CN103446190B - 一种混合菌株的固体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种混合菌株的固体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，依次包括步骤斜面培养、液体菌种生产、固体发酵和干燥粉碎，其特征在于，所述发酵的菌株为中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌。本发明利用中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种不同的菌株，并结合各自的发酵、生长特点，共同通过固体发酵制得了组成更接近于天然冬虫夏草、功效更加齐全的冬虫夏草菌粉，给冬虫夏草的人工产业化带来了良好的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种固体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，具体涉及一种混合菌株的固体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法。
背景技术
冬虫夏草又称虫草，是我国传统名贵中药，具有止咳、化痰、降低血清胆固醇、调节和增强免疫力、抗肿瘤等多种药理作用。近年来，国内外对冬虫夏草需求剧增。但由于冬虫夏草有其严格的寄生性和特殊的生长地理环境，产量相当有限，药源比较紧缺。为缓解市场的供需矛盾，冬虫夏草的人工发酵产品越来越重要。
目前国内外冬虫夏草的液体深层发酵研究及生产，大部分采用的菌株是蝙蝠蛾拟青霉、中华头孢菌、蝙蝠蛾被孢霉、中华束丝孢菌或中国被毛孢等。这些菌株中蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌(即虫草头孢菌)属于常温菌，对生长环境和培养基的要求不高；而中国被毛孢则属于低温菌，生长缓慢，对人工发酵的技术条件要求较高。多篇现有技术公开了利用上述菌株进行的发酵工艺。
专利申请CN01106767公开了一种冬虫夏草菌粉，其通过固体发酵生产法制得，使用的菌种为中华束丝孢。
专利申请CN03135622公开了一种冬虫夏草无性阶段固体发酵工艺，专利申请CN200910197957公开了一种冬虫夏草菌的固体发酵法，其中都具体公开了中国被毛孢的固体发酵条件。
专利申请CN200910114886公开了一种真菌发酵物饲料添加剂，其包括蝙蝠蛾拟青霉的固体发酵产物。
专利申请CN201210283373公开了一种虫草饲料添加剂的制备方法，包括菌种扩培、菌种发酵、后期熟化，所用的菌种为蝙蝠蛾拟青霉。
由此可见，现有技术都是利用单一菌株发酵制备天然冬虫夏草的人工替代品的。但由于天然冬虫夏草含有多种无性系菌株，所以采用单一菌株发酵制备的人工替代品的组成难以接近天然冬虫夏草，并且由单一菌株发酵生产的冬虫夏草菌粉产品的功能单一，效果不够全面，例如百令片/胶囊、金水宝片/胶囊、至灵胶囊、宁心宝胶囊和心肝宝胶囊等。
目前，为解决上述问题，已有现有技术将两种或三种菌株发酵的冬虫夏草菌粉通过简单的物理混合，来制备多功能的产品，包括CN200710301690、CN200710308028和200710307526等。但这种通过简单物理混合制得的产品在组成上仍然难以接近天然冬虫夏草，其功效仍然是有限的。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的发明人根据多年来在冬虫夏草菌发酵工艺的研究，利用中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种不同的菌株，并结合各自的发酵、生长特点，共同通过固体发酵制得了组成更接近于天然冬虫夏草、功效更加齐全的冬虫夏草菌粉。
本发明提供了一种混合菌株的固体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，还提供了通过该方法制得的冬虫夏草菌粉。具体是按以下技术方案来实现的：
一种混合菌株的固体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，依次包括步骤斜面培养、液体菌种生产、固体发酵和干燥粉碎，其特征在于，所述发酵的菌株为中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌。
优选地，上述方法中，所述液体菌种生产包括中国被毛孢菌株的2～4次扩大生产，以及蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌的1～3次扩大生产。
优选地，上述方法中，所述液体菌种生产包括中国被毛孢单独扩大生产后，再与蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合继续扩大生产。
优选地，上述方法中，所述液体菌种生产时中国被毛孢单独扩大生产7～9天。
优选地，上述方法中，所述液体菌种生产时中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合后共进行1～3次扩大生产，每次扩大生产2～3天。
优选地，上述方法中，所述液体菌种生产的培养基含有碳源、氮源和无机盐，按重量体积比计，含有碳源2.0～15.0％，氮源1.0～15.0％，无机盐0.1～5.0％。
优选地，上述方法中，所述液体菌种生产和固体发酵的温度为15～18℃。
优选地，上述方法中，所述固体发酵培养基含有谷物、辅料和水，所述谷物为大米、小米、玉米、小麦、大麦或荞麦的一种或多种，含量为固体发酵培养基的35～40％w/w；所述辅料为蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾和硫酸镁中的一种或多种。
优选地，上述方法中，所述固体发酵采用接种法或拌种法。
本发明的优点在于：利用中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种不同的菌株，并结合各自的发酵、生长特点，共同通过固体发酵制得了组成更接近于天然冬虫夏草、功效更加齐全的冬虫夏草菌粉，给冬虫夏草的人工产业化带来了良好的经济效益。
具体实施方式
实施例1
取购买或分离的中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种菌株，分别进行斜面培养，其中中国被毛孢接种后于12℃培养30天，蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌常温培养8天，斜面培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉5％、葡萄糖2％、玉米粉3％、蛋白胨0.75％、琼脂2％、麸皮1.5％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾0.2％和水84.55％。
将完成培养的中国被毛孢接种于扩大生产培养基上，接种量5-10％，15℃下进行第一次扩大生产，时间为7天；扩大生产培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖2％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.8％、水95.6％。
将第一次扩大生产后的中国被毛孢与完成培养的蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合，共同接种于扩大生产培养基上，接种量5-10％，15℃下再进行1次扩大生产，3天后制得冬虫夏草菌的液体菌种，扩大生产培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉2％、葡萄糖2.5％、玉米粉1％、蛋白胨2％、酵母膏5％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾1％、水86.95％。
将液体菌种接种于灭菌的固体发酵培养基上，接种量5-10％，15℃下发酵8天，固体发酵培养基的组份含有大米100Kg、玉米粉10Kg、蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，磷酸二氢钾0.5g和硫酸镁0.2g。
待固体发酵室物料内外均长满菌丝，停止发酵，将物料烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。
实施例2
取购买或分离的中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种菌株，分别进行斜面培养，其中中国被毛孢接种后于14℃培养28天，蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌常温培养10天，斜面培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉3％、葡萄糖4％、玉米粉1％、蛋白胨0.5％、琼脂1％、麸皮4％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.05％、水86.35％。
将完成培养的中国被毛孢接种于扩大生产培养基上，接种量5-10％，18℃下进行第一次扩大生产，时间为7天；扩大生产培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖3％、酵母膏4％、蛋白胨0.5％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾1％、水90.5％。
将第一次扩大生产后的中国被毛孢与完成培养的蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合，共同接种于扩大生产培养基上，接种量5-10％，18℃下再进行3次扩大生产，2天后制得冬虫夏草菌的液体菌种，扩大生产培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉3％、葡萄糖4％、玉米粉4％、蛋白胨0.5％、酵母膏1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.05％、水87.35％。
将液体菌种与灭菌的固体发酵培养基拌种混匀，接种量5-10％，15℃下发酵6天，固体发酵培养基的组份含有大米80Kg、玉米粉20Kg、蛋白胨10g，酵母浸出粉20g，磷酸二氢钾0.3g和硫酸镁0.5g。
待固体发酵室物料内外均长满菌丝，停止发酵，将物料烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。
实施例3
取购买或分离的中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种菌株，分别进行斜面培养，其中中国被毛孢接种后于13℃培养29天，蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌常温培养9天，斜面培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉4％、葡萄糖2.5％、玉米粉4％、蛋白胨2％、琼脂0.5％、麸皮1％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾1％、水84.2％。
将完成培养的中国被毛孢接种于扩大生产培养基上，接种量5-10％，16℃下进行第一次扩大生产，时间为8天；扩大生产培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉4％、葡萄糖5％、玉米粉3％、蛋白胨1％、酵母膏2％、硫酸镁0.9％、磷酸氢二钾0.2％、水83.9％。
将第一次扩大生产后的中国被毛孢与完成培养的蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合，共同接种于扩大生产培养基上，接种量5-10％，16℃下再进行2次扩大生产，3天后制得冬虫夏草菌的液体菌种，扩大生产培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖4％、酵母膏3％、蛋白胨1.5％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.1％、水91.35％。
将液体菌种与灭菌的固体发酵培养基拌种混匀，接种量5-10％，15℃下发酵7天，固体发酵培养基的组份含有大米90Kg、玉米粉30Kg、蛋白胨8g，酵母浸出粉15g，磷酸二氢钾0.6g和硫酸镁0.4g。
待固体发酵室物料内外均长满菌丝，停止发酵，将物料烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。
实施例4
取购买或分离的中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种菌株，分别进行斜面培养，其中中国被毛孢接种后于13℃培养30天，蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌常温培养8天，斜面培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉3％、葡萄糖2.5％、玉米粉1.5％、蛋白胨1％、琼脂0.75％、麸皮1.5％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％、水89.45％。
将完成培养的中国被毛孢接种于扩大生产培养基上，接种量5-10％，16℃下进行第一次扩大生产，时间为8天；扩大生产培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖5％、蛋白胨2％、酵母膏0.1％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾0.05％、水92.05％。
将第一次扩大生产后的中国被毛孢与完成培养的蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合，共同接种于扩大生产培养基上，接种量5-10％，15℃下再进行3次发酵，2天后制得冬虫夏草菌的液体菌种，扩大生产培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖5％、蛋白胨2％、酵母膏0.1％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾0.05％、水92.05％。
将液体菌种与灭菌的固体发酵培养基拌种混匀，接种量5-10％，15℃下发酵7天，固体发酵培养基的组份含有大米100Kg、玉米粉20Kg、蛋白胨10g，酵母浸出粉15g，磷酸二氢钾0.3g和硫酸镁0.5g。
待固体发酵室物料内外均长满菌丝，停止发酵，将物料烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。
对照例1
取购买或分离的中国被毛孢菌株，按照实施例1的培养和发酵条件(培养基、温度、时间等)进行斜面培养、2次扩大生产和固体发酵。待固体发酵室物料内外均长满菌丝，停止发酵，将物料烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。
对照例2
取购买或分离的蝙蝠蛾拟青霉菌株，按照实施例2的培养和发酵条件(培养基、温度、时间等)进行斜面培养、4次扩大生产和固体发酵。待固体发酵室物料内外均长满菌丝，停止发酵，将物料烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。
对照例3
取购买或分离的中华头孢菌菌株，按照实施例3的培养和发酵条件(培养基、温度、时间等)进行斜面培养、3次扩大生产和固体发酵。待固体发酵室物料内外均长满菌丝，停止发酵，将物料烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。
对照例4
按照专利申请CN200710301690中实施例1的条件制得的冬虫夏草菌粉，过程为：取92克中国被毛孢虫草菌粉，4克蝙蝠蛾拟青霉虫草菌粉，4克中华头孢虫草菌粉，再将上述三种原料混匀可制得发酵虫草混合粉产品。
试验例1
按照以下指标对实施例1-4和对照组1-4的冬虫夏草菌粉进行对照，其中各成分含量为冬虫夏草菌粉中的重量百分含量，具体结果见下表(各数值为10批样品的均值)：
由此发现，本发明实施例1-4的冬虫夏草菌粉中各成分的含量都更接近于天然冬虫夏草，多数都高于天然冬虫夏草；相反，对照例1-4的冬虫夏草菌粉中都含有低于天然冬虫夏草的成分。
这一结论通过指纹图谱测试(HPLC法)亦可得出：指纹图谱测试结果本发明实施例1-4的冬虫夏草菌粉与天然冬虫夏草的基因相似度＞98.5％，说明本发明的冬虫夏草菌粉完全可以作为天然虫草的替代品。
试验例2
取18～20g的雄性ICR小鼠50只，按体重随机分成10组：空白组、普通组、实验组1-4和对照组1-4，其中空白组给予蒸馏水、普通组给予天然冬虫夏草菌粉混悬液、实验组1-4分别给予实施例1-4的冬虫夏草菌粉混悬液、对照组1-4分别给予对照例1-4的冬虫夏草菌粉混悬液，剂量为0.5g/Kg(菌粉重量/小鼠重)；每天灌胃给药1次，连续7d；每组10只。
小鼠脾淋巴细胞悬浮液的制备：末次给药后30min，小鼠摘眼球放血致死，75％乙醇浸泡5min，无菌取脾，用1ml注射器塞磨碎，尼龙绸布过滤到10ml离心管中，用Hank’S液洗涤，合并洗涤液，1500rpm离心5min，弃上清，加Hank’S液至7ml，细胞混匀，再离心，重复2次。进行细胞计数，以RPMI1640完全培养液稀释至1×107个/ml的脾细胞混悬液备用。
MTT法淋巴细胞增殖反应实验：新鲜分离的1×107cell/ml小鼠脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔加100μL脾细胞混悬液，再根据实验设计加入刺激剂(ConA和LPS)50μL/孔，每个样品设3个平行孔并设对照孔(仅加RPMI1640培养基)，将培养板置于37℃的5％CO2培养箱中培养44h。每孔加入5050μL MTT溶液((2mg/ml)，继续培养4h。培养物1500rpm离心5min，弃去上清，每孔加150μL酸性DMSO溶液，振荡，使紫色结晶完成溶解(置暗处室温放置15～30min)。以酶标仪于578nm处测其OD值。计算刺激指数(SI)=加ConA细胞孔的平均OD值÷对照孔的平均OD值，结果见下表(与空白组比较，**P＜0.01)。
| 组别 | T淋巴细胞SI值 | B淋巴细胞SI值 |
| 空白组 | 1.12±0.41 | 1.29±0.34 |
| 普通组 | 2.33±0.48** | 1.86±0.25** |
| 实验组1 | 2.38±0.40** | 1.96±0.37** |
| 实验组2 | 2.40±0.31** | 1.90±0.30** |
| 实验组3 | 2.51±0.24** | 1.96±0.28** |
| 实验组4 | 2.50±0.28** | 1.93±0.29** |
| 对照组1 | 1.18±0.21 | 1.32±0.27 |
| 对照组2 | 1.15±0.25 | 1.31±0.34 |
| 对照组3 | 1.13±0.34 | 1.30±0.22 |
| 对照组4 | 1.29±0.33 | 1.36±0.22 |
T、B淋巴细胞在体外培养时，受到有丝分裂原(如PHA、ConA)刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。该试验例2的结果显示，与空白组比较，在剂量为0.5g/Kg(菌粉重量/小鼠重)的条件下，普通组和实验组1-4均能显著地提高小鼠脾T、B淋巴细胞转化刺激指数，而对照组1-4的影响不明显。由此说明本发明的冬虫夏草发酵菌粉与天然冬虫夏草在增强免疫功能方面具有相似的功效，都能显著提高正常小鼠免疫功能。而仅用单一菌株发酵、或物理混合三种菌株发酵产物的冬虫夏草菌粉则不具有上述效果。
最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种混合菌株的固体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，依次包括步骤斜面培养、液体菌种生产、固体发酵和干燥粉碎，其特征在于，所述发酵的菌株为中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌，所述液体菌种生产包括中国被毛孢单独扩大生产后，再与蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合继续扩大生产；
所述液体菌种生产时中国被毛孢单独扩大生产7～9天；
所述液体菌种生产时中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合后共进行1～3次扩大生产，每次扩大生产2～3天；
所述液体菌种生产的培养基含有碳源、氮源和无机盐，按重量体积比计，含有碳源2.0～15.0％，氮源1.0～15.0％，无机盐0.1～5.0％；
所述液体菌种生产和固体发酵的温度为15～18℃；
所述固体发酵培养基含有谷物、辅料和水，所述谷物为大米、小米、玉米、小麦、大麦或荞麦的一种或多种，含量为固体发酵培养基的35～40％w/w；所述辅料为蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾和硫酸镁中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体发酵采用接种法或拌种法。
3.通过权利要求1-2任意一项所述的方法制备得到的冬虫夏草菌粉。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 810001 Xining biological science and Technology Industrial Park, No. two, No. 16, Qinghai Applicant after: Wang Hui Address before: 810001 No. 19, Dongxin Road, Xining economic and Technological Development Zone, Qinghai, China Applicant before: Wang Hui |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190819 Address after: 810001 North Chengbei Biotechnology Industrial Park, Xining City, Qinghai Province, No. 16 Jing No. 2 Road Patentee after: Qinghai Mount Everest caterpillar fungus Pharmaceutical Group Co., Ltd. Address before: 810001 Xining biological science and Technology Industrial Park, No. two, No. 16, Qinghai Patentee before: Wang Hui |