CN101695257B - 冬虫夏草菌的固体发酵法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草菌的固体发酵法。本法采用生产菌种为中国被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng的液体发酵醪液作液体菌种，通过灌注或拌和接种，让冬虫夏草菌在以谷物为基质的固体培养基上发酵生产。本法综合了液体发酵和固体发酵的双重优点。既有菌种培养時间短、活力强、流动性好、发育点多的优点，又具有生产设备投资小、能耗低、无废液排放、产品易貯存等特点。本发明的终产品，为富含冬虫夏草菌的谷物。可直接作为保健食品的原料应用。

Description

冬虫夏草菌的固体发酵法

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及冬虫夏草菌的固体发酵生产方法。

背景技术

冬虫夏草(Ophiocordysepes sinensis＝Cordycepes sinensis(Berk.)Sacc.)是寄生于蝙蝠蛾幼虫上的真菌和虫尸复合物。冬虫夏草上的“草”，是该菌的有性器官-子座，“虫”，是其寄主虫尸，内为该菌的菌絲体-菌核。冬虫夏草分离得的菌种，是冬虫夏草的无性型，菌种学名为中国被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)，俗称冬虫夏草菌(真菌学报，1988，8(1)，35-40)。

冬虫夏草菌的发酵生产，已有多篇专利报道。如申请号97110448.4，03131904.1，200410019092.4，200410025517.2，200410101728.X，200710142960.1等。但上述专利描述的都是中国被毛孢的液体发酵法，都需用10-50吨大型发酵罐，生产中还需不断压送无菌空气，能源耗损大，且另有废弃醪液排放，有碍环境保护，发酵终产物为液体醪液，不易贮存。

申请号为03135622.2的发明专利，提出了冬虫夏草菌的固体发酵生产法。该专利用固体发酵罐来取代液体发酵罐，让中国被毛孢在蔗糖、酵母和蚕蛹粉等固体基质上生长，其终产品为固体培养物，易贮存，生产中亦无废液排放，但该法仍需用发酵罐，仍然需要向罐内压送无菌空气，能源耗损大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究设计毋需压缩空气，亦无废液排放，节能减排，成本低廉的冬虫夏草菌生产方法。

本发明提供了一种冬虫夏草菌的固体发酵生产方法。其特点是用中国被毛孢的液体菌种，让它在以谷物为基本料的固体基质上发酵生长。

本发明方法具体包括下列步骤：

一、液体菌种生产

(1)菌种：生产菌种为中国被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng，可从天然冬虫夏草分离而得，或从中国科学院微生物研究所或安徽农业大学经济昆虫菌物研究所购得，经DNA指纹谱鉴定，应与天然冬虫夏草的相似率为95％-100％；

(2)液体菌种生产：

①.液体母种的培养：取在14～18℃下培养2-3月的中国被毛孢菌苔，用无菌手朮刀切割成小块，移入盛有100ml液体培养基的250ml锥形瓶中，在转速为80～200rpm的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养，培养温度为14～18℃，2～3周后，即可获得冬虫夏草菌的液体母种；

②.液体菌种的扩大生产：将冬虫夏草菌的液体母种，移植到2～3倍量(V/V)的液体培养基中，在温度为14～18℃，转速为80～200rpm的旋转式或往复式摇瓶机上继续振荡培养6～8天，即得冬虫夏草菌的液体菌种(图1)。此液体菌种还可进一步扩大移植到2～3倍量(v/v)的液体培养基中。扩大培养所用的锥形瓶容量，可达500至5000ml，培养条件同上。

冬虫夏草菌的扩大培养，也可在血清瓶(10升)中进行。用血清瓶培养時所需的无菌空气，可由市售的小型空气压缩机经空气过滤器过滤而得。通气量是液体培养基体积的0.2～1.0/分(v/v)；

生产冬虫夏草菌液体菌种的培养基，由碳源、氮源、矿物质、复合营养成分、维生素和水组成；其中碳源为下列一种或几种成分：蕈糖、蜂蜜、糖蜜和葡萄糖，含量为2.0～4.0％w/v；氮源为下列一种或多种成分：蛋白胨、酵母浸出粉、蚕蛹粉或奶粉，含量为0.1～3.0％w/v；矿物元素为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或硫酸镁，含量为0.01～0.1％w/v；复合营养成分为下列一种或多种成分：菇蕈、米麸、麦麸、玉米，含量为1.0～10.0％w/v；维生素为硫胺素，含量为0.001～0.01％w/v；水为饮用水，含量为83～97％w/v。液体培养基的pH值为6.0～7.0；

二、固体发酵生产：

(1)固体发酵的培养基：

冬虫夏草菌固体发酵的培养基由谷物、辅料和水组成。

所述谷物为大米、小米、玉米、小麦、大麦或荞麦的一种或多种，含量为固体发酵培养基的35～40％w/w；辅料为下列一种或多种：蚕蛹粉、麦麸或玉米粉，含量为固体发酵培养基的5～15％w/w；水为饮用水，含量为固体发酵培养基的50～55％w/v；

(2)灭菌：将上述固体发酵培养基装入容器(玻瓶或耐热塑料袋)内，在1.1KG/cm2下蒸汽灭菌30-60分钟；

(3)接种：将步骤一得到的冬虫夏草菌液体菌种灌注入上述经灭菌並冷却的固体发酵培养基中，接种量为固体发酵培养基干重的10～50％，接种后应及時搅拌或翻动，使液体菌种均匀分散在固体培养基上；

或采用拌种法，即：液体菌种和固体发酵培养料的拌和，是在搅拌器中完成的，所述搅拌器外形为圆筒形或圆锥形，直径60cm，长120cm，上有投料口，下有出料口，可封闭，可耐1.1Kg/cm2压力，能通入蒸汽灭菌，单层或具夹套，搅拌器中央有搅拌轴，能将液体菌种和固体培养料拌和均匀，并能将此拌和料分批推送至发酵袋内，拌种時的液体菌种用量为：每100Kg固体发酵培养料(以湿重计)拌入液体菌种10±2L；

(4)发酵培养和采收：瓶或袋内的固体培养料，当接入液体菌种后即可移入发酵室中进行培养。发酵室的室温为12～18℃，相对湿度为65±10％，袋/瓶内的品温为14～16℃。当发酵培养8～12周后，培养物表面的菌丝体色泽由白色转为黄褐色，这時发酵培养已成熟，即可采收。(图2、图3)

(5)冷冻干燥：培养成熟的固体发酵培养物，可按下列步骤作冷冻真空干燥；干燥品再经粉碎、过筛，即得冬虫夏草菌的固体发酵菌粉。

①.冷冻：将新鲜的固体发酵培养物在-20～-30℃下冷冻1～4h；

②.升华干燥：在真空度为30～60Pa，冷阱温度为-40～-20℃下升华干燥，時间4～7h；

③.解吸干燥：在真空度为10～40Pa，冷阱温度为-20～40℃下作解吸干燥，直至培养物中的含水量下降至3～5％。

对冬虫夏草菌的固体发酵培养物作冷冻真空法干燥，能最大限度地保持冬虫夏草菌的生理活性，且含水量低，可长期保藏。

(6)检验：用本发明生产的固体发酵菌粉，经HPLC检测，其腺苷Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、尿苷(Uridine)和胞苷(Cytidine)的色谱峰，与天然冬虫夏草的相应色谱峰重叠一致。(图4)

本发明取用冬虫夏草菌的发酵醪液作液体菌种，利用了液体菌种流动性好，培养時间短，活力强、污染少的优点。同時，又让冬虫夏草菌在谷物等基质上进行固体发酵。生产中无需大型发酵设备，亦无废料排放。节能减排，友好环境，成本低亷。

本发明综合了液体发酵和固体发酵的双重优点，其终产品为富含冬虫夏草菌的谷物，可直接用作加工食品的原料。

附图说明

图1.冬虫夏草菌的液体菌种。

图2.用液体菌种为种子的固体发酵培养物，瓶装。

图3.用液体菌种为种子的固体发酵培养物，袋装。

图4.天然冬虫夏草(上)和冬虫夏草菌固体发酵菌粉(下)的HPLC色谱图。两者的腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、尿苷(Uridine)和胞苷(Cytidine)色谱峰，完全重叠一致。

具体实施方式

实施例1

一.菌种制备

1.菌种：生产菌种为中国被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)，从中国科学院微生物研究所或安徽农业大学经济昆虫菌物研究所等单位购得，经DNA检测，其RDNA核苷酸序列和天然冬虫夏草的相似率99％；

2.菌种的扩大繁殖：

(1).琼脂斜面：琼脂斜面培养基配方：

蕈糖20g，蛋白胨3g，酵母浸出粉2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，琼脂20g，水1000ml，pH6.5，待琼脂溶化后分装入100ml小三角瓶中，每瓶装培养基50ml，灭菌：121℃，25分钟。用中国被毛孢yy0701菌株接种，16℃下培养70天；

*蕈糖，又名海藻糖，英文名：Trehalose，该糖在昆虫和藻类中普遍存在

(2).摇瓶培养：

培养基配方：取香菇100g，麦麸10g，蚕蛹粉10g和玉米粉10g，加水1000ml，煮沸，维持20分钟。用布过滤，取滤汁，並定容至1000ml。在上述滤汁中另加蕈糖10g，蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g及硫胺素15mg。溶解並混和后，用1Mol氢氧化纳溶液调pH至6.8；

分装和灭菌：将上述培养液分装入500ml园锥瓶内，装量：100ml/瓶，灭菌：121℃下30分钟；

接种与培养：取在16℃下已培养70天的中国被毛孢菌苔(约2平方厘米大)，用手术刀切割成10～20个小块。然后移入上述摇瓶培养基中，在频率为150rpm，温度为17℃下，振荡培养20天。这時培养液中已长满菌丝小球，醪液静置后不分层，即可作为液体母种，进一步扩大繁殖。方法是将上述液体母种，移植至装量为200ml的500ml圆锥瓶中，即总量为300ml的醪液中含液体母种100ml，接种量为33％。培养基和培养条件同上，振荡培养6天后即得冬虫夏草菌的液体菌种；

二、固体发酵生产：

1.固体发酵配方及装袋：

配方：秈大米100Kg、玉米粉10Kg，摇瓶培养基80L，

装瓶：将上述配方经混和后，分装入耐热塑料袋中，装量：每袋2Kg；

灭菌：121℃，35分钟；

2.接种：将上述冬虫夏草菌液体菌种，用灌注法接入上述已经灭菌并冷却至室温的固体发酵袋中，每袋灌入液体菌种150ml，並隨即将袋内培養物倒转或侧向翻动5次，使液体菌种能均匀地分散在米粒基质上，然后移入发酵室中培养。整个接种和翻动可在自动流水綫上进行。

3.培养、采收：冬虫夏草菌的固体发酵室，其室温应控制在为16±2℃，相对湿度在65±10％；袋内品温在15±2℃。发酵培养3周后，米粒基质上已长满中国被毛孢菌丝体，培养8周后，培养物表面的菌丝体色泽已由白色转为黄褐色。

4.冷冻真空干燥：将上述发酵成熟的培养物，先在-20～-30℃下冷冻3h，然后置真空度为40Pa，冷阱温度为-30℃下升华干燥，8h后继续在真空度为15Pa下解吸干燥，直至培养物中的含水量下降到5％。干燥物经粉碎並通过3号药筛后，即得冬虫夏草菌的固体发酵菌粉100Kg；

5.检验：将冬虫夏草菌的固体发酵菌粉用HPLC仪测定，其腺苷、鸟苷、胞苷、肌苷、和尿苷的色谱峰，应和天然冬虫夏草的相应色谱峰}叠合一致。

实施例2

本实施例中的菌种制备和液体菌种生产方法，均同实施例1。但在固体发酵生产项下的接种方式，采用拌种法，即：液体菌种和固体发酵培养料的拌和，是在搅拌器中完成的，所述搅拌器外形为圆筒形或圆锥形，直径60cm，长120cm，上有投料口，下有出料口，可封闭，可耐1.1Kg/cm2压力，能通入蒸汽灭菌，单层或具夹套，搅拌器中央有搅拌轴，能将液体菌种和固体培养料拌和均匀，并能将此拌和料分批推送至发酵袋内，拌种時的液体菌种用量为：每100Kg固体发酵培养料(以湿重计)拌入液体菌种10±2L；固体发酵用的塑料袋(发酵袋)大20x 40cm，事先应用r射线辐照灭菌。拌种后的固体发酵培养料(拌和料)装入发酵袋的量为5±0,2Kg/袋(以湿重计)。然后扎口，並运送至固体发酵培养室培养，其培养条件、采收和检测标准，同实施例1。

本实施例因采用拌和法接种，中国被毛孢菌丝体在谷粒培养基上分布更均匀，发酵周期比灌注接种法可缩短1～2周。

实施例3

本实施例中的菌种制备和固体发酵生产方法同实施例2，但液体菌种的扩大改用大容量的血清瓶培养。方法和步骤如下：

取在16℃下巳培养90天的中国被毛孢菌苔(约3平方厘米大)，用手术刀切割成10～20个小块，移入装有200ml液体培养基的500ml园锥瓶中，经摇瓶培养得中国被毛孢的液体母种；

2.取上述两瓶500ml园锥瓶中的400ml液体母种，移入内装液体培养基1000ml的1500ml大园锥瓶中.接种量为28％.然后置往复式摇床上振荡培养，振幅8cm，频率为80～100次/分；培养温度为16±2℃，振荡培养6～7天后，每瓶大园锥瓶中即可得中国被毛孢摇瓶种子1.4L；

3.上述摇瓶种子可进一步在容量为10升的血清瓶中扩大培养.每10L容量的血清瓶中装液体培养基6L，用2瓶振荡培养所得的液体菌种(共2.8L)接种，即接种量为32％。

4.将上述接种了液体菌种的血清瓶，移入室温为16±2℃，相对湿度为65±10％的培养室内，並向血清瓶内通入无菌空气。无菌空气是由医用小型空气压缩机将空气经空气过滤器除菌后获得的。每台小型空气压缩机可为3～10个血清瓶提供无菌空气。通气量为醪液体积的0.5～1.0(v/v)/min。通气培养6～8天后，每个血清瓶即可生产得冬虫夏草菌液体菌种8.8L.每5～6个血清瓶的液体菌种生产量，相当于一只100立升种子罐的液体菌种生产量，可足够供应生产冬虫夏草菌固体发酵菌粉300Kg。

Claims (3)

1.一种冬虫夏草菌的固体发酵法，其特征在于该方法包括下列步骤：

一、液体菌种生产

(1)菌种：生产菌种为中国被毛孢Hirsutella sinensis；菌种经DNA指纹谱鉴定，与天然冬虫夏草的相似率为95％-100％；

(2)液体菌种生产：

①液体母种的培养：取在14～18℃下培养2-3月的中国被毛孢菌苔，切成小块，移入盛有100ml液体培养基的250ml锥形瓶中，在转速为80～200rpm的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养，培养温度为14～18℃，2～3周后，即可获得冬虫夏草菌的液体母种；

②液体菌种的扩大生产：将冬虫夏草菌的液体母种，移植到2～3倍量v/v的液体培养基中，继续在温度为14～18℃，转速为80～200rpm的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养6～8天，即得冬虫夏草菌的液体菌种；

所述液体培养基由碳源、氮源、矿物质、复合营养成分、维生素和水组成；其中碳源为下列一种或多种成分：蕈糖、蜂蜜、糖蜜和葡萄糖，含量为2.0～4.0％w/v；氮源为下列一种或多种成分：蛋白胨、酵母浸出粉、蚕蛹粉或奶粉，含量为0.1～3.0％w/v；矿物元素为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或硫酸镁，含量为0.01～0.1％w/v；复合营养成分为下列一种或多种成分：菇蕈、米麸、麦麸、玉米，含量为1.0～10.0％w/v；维生素为硫胺素，含量为0.001～0.01％w/v；水为饮用水，含量为83～97％w/v；液体培养基的pH值为6.0～7.0；

二、固体发酵生产：

(1)固体发酵的培养基：

固体发酵的培养基由谷物、辅料和水组成；所述谷物为大米、小米、 玉米、小麦、大麦或荞麦的一种或多种，含量为固体发酵培养基的35～40％w/w；辅料为下列一种或多种：蚕蛹粉、麦麸或玉米粉，含量为固体发酵培养基的5～15％w/w；水为饮用水，含量为固体发酵培养基的50～55％w/v；

(2)灭菌：将上述固体发酵培养基装入容器内，在1.1KG/cm2下蒸汽灭菌30～60分钟；

(3)接种：将步骤一所得的冬虫夏草菌液体菌种，灌注入上述已经灭菌並冷却的固体发酵培养基中，接种量为固体发酵培养基干重的10～50％v/w；

(4)发酵培养和采收：冬虫夏草菌的固体发酵培养，其室温控制在12～18℃，料温控制在14～18℃，相对湿度在65±10％，经8～12周发酵培养后，培养物表面的菌丝体色泽由白色转为黄褐色，这時发酵培养已成熟，即可取出作冷冻真空干燥；

(5)冷冻干燥：冬虫夏草菌的固体发酵培养物，可用冷冻真空干燥法干燥，干燥物经粉碎、过筛，即得冬虫夏草菌的固体发酵菌粉；所述固体发酵培养物的冷冻真空干燥，通过下列步骤依次进行：

1)冷冻：将新鲜的固体发酵培养物在-20～-30℃下冷冻，時间1～4h；

2)升华干燥：在真空度为30～60Pa，冷阱温度为-40～-20℃下升华干燥，時间4～7h；

3)解吸干燥：在真空度为10～40Pa，冷阱温度为-20～40℃下作解吸干燥，直至培养物中的含水量下降至3～5％。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤一(2)冬虫夏草菌液体菌种的生产，用血清瓶作通气培养，通气量为1∶0.2～1∶1v/v。

3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤二(3)采用拌种法，即：液体菌种和固体发酵培养料的拌和，是在搅拌器中完成的；所述搅 拌器外形为圆筒形或圆锥形，上有投料口，下有出料口，可封闭，可耐1.1Kg/cm2压力，能通入蒸汽灭菌，单层或具夹套，搅拌器中央有搅拌轴，能将液体菌种和固体培养料拌和均匀，并能将此拌和料分批推送至发酵袋内；拌种時的液体菌种用量为：每100Kg固体发酵培养料以湿重计拌入液体菌种10±2L。 

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