CN103650910B - 一种冬虫夏草子实体及其培植方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，公开了一种冬虫夏草子实体及其培植方法。本发明所述培植方法将中国被毛孢菌接种在固体培养基上，在避光、14-20℃和45-60%相对湿度的条件下进行菌落培养35-55天，然后转至避光、10-15%氧气浓度、0-10℃和70-90%相对湿度的条件下诱导子实体至子实体长出。本发明将中国被毛孢菌接种于特定的培养基中，并控制中国被毛孢在不同生长阶段的湿度和温度等条件，在低温、避光和少氧的环境中培育出真正的冬虫夏草子实体，其免疫调节作用和活性物质含量与野生冬虫夏草子实体基本无差别。
Description
本申请要求于2012年09月20日提交中国专利局、申请号为201210356912.3、发明名称为“一种冬虫夏草子实体及其培植方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体的说是涉及一种冬虫夏草子实体及其培植方法。
背景技术
冬虫夏草是冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)感染并寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上长出的子座（子实体）及幼虫虫体的复合体，属于可食用的真菌，是我国一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。
蝙蝠蛾幼虫被冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)感染，菌丝充满整个虫体组织，结成坚硬的假菌核，在冬季低温干燥土壤内保持虫形不变达数月之久（冬虫），待夏季温湿适宜时从菌核长出棒状子实体（子座）并露出地面（夏草），因此得名冬虫夏草。野生的冬虫夏草仅生长在青藏高原海拔3000-5000米的高山草甸、高原草甸等高寒植被中，由于近年来过度采挖使其产量下降，其价格与20多年前相比已经上涨了1000多倍。因此，我国科研人员一直在进行利用冬虫夏草菌的无性型人工发酵菌丝和培植子实体来替代野生冬虫夏草的产业化研究（即模拟虫体营养成分做成培养基接种冬虫夏草菌的无性型-中国被毛孢菌丝，形成有性型-子实体），力图让昂贵的冬虫夏草能够走进寻常百姓家。
在当前阶段，冬虫夏草菌丝体是最常见的冬虫夏草人工培植产品，如冬虫夏草菌丝体胶囊和冬虫夏草菌丝体粉。与冬虫夏草子实体相比，冬虫夏草菌丝体的营养远不如子实体。在一株完整的冬虫夏草中，80%的营养和活性成分集中在子座（子实体）中，而仅20%的的营养和活性成分集中在虫体（菌丝体）中，可见冬虫夏草子实体才是冬虫夏草的精华所在，而人工培植冬虫夏草子实体更具有实际意义。
在研究人工培植冬虫夏草子实体的起始阶段，由于对冬虫夏草菌的正确无性型没有明确定论，使得人工培植冬虫夏草子实体出现了较为混乱的局面，即凡是认为分离自虫草的菌就是冬虫夏草菌的无性型，而由这些无性型的菌培植的子实体就称为冬虫夏草子实体，如申请号为00108486.0的中国专利，其公开了一种“人工培育冬虫夏草的方法”，从其记载的内容上看实际上是人工培育子实体，但其培养基中用到了培育蛹虫草子实体的典型组分-蚕蛹粉等，且其菌丝的颜色为白色，这与蛹虫草的无性型-蛹草拟青霉的菌丝颜色是一致的，而且蛹虫草的生长速度快，培养周期短为40-50天，因此可以推知其培育的并不是冬虫夏草子实体，而是蛹虫草子实体。上述混乱状况对相关药品和保健品的生产、管理和应用带来极大的影响。
随着研究的不断深入，有明确证据表明，冬虫夏草菌的正确无性型为中国被毛孢［Hirsutella sinensis X.J.Liu，Y.L.Guo.］，但是，只有极少的报道记载了利用中国被毛孢在培养基上培植冬虫夏草子实体的内容，如文献《人工培养冬虫夏草研究》（俞永信，菌物研究，2004年第2卷第2期，42-46页），不过该文献在培养基的组成和培养条件上不够明确，而且子实体的数量仅为1根/CFU，长度最长也只有5cm左右，产量较低不利于广泛应用。因此，提供一种利用中国被毛孢培植产量较高的冬虫夏草子实体的方法就具有重要的实际意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够利用中国被毛孢人工培植出冬虫夏草子实体的方法，使得该方法能够提高子实体的数量和长度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种冬虫夏草子实体的培植方法，将中国被毛孢菌接种在固体培养基上，在避光、14-20℃和45-60%相对湿度的条件下进行菌落培养至菌落直径为3-4cm，然后转至避光、10-15%氧气浓度、0-10℃和70-90%相对湿度的条件下诱导子实体至子实体长出，所述固体培养基由葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、水解乳蛋白、无水硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂和水组成，质量比依次为28～32∶8～12∶4～6∶4～6∶0.4～0.6∶0.8～1.2∶18～22∶800～1200。
本发明所述培植方法采用的中国被毛孢菌可以通过市售获得，或利用本领域常规技术手段从野生的冬虫夏草上分离获得。其中，本发明所述固体培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、水解乳蛋白、无水硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂和水的质量比优选为30∶10∶5∶5∶0.5∶1∶20∶1000。
由于野生冬虫夏草的生长环境特殊，对人工培植冬虫夏草子实体的环境要求十分严格，光照、温度、湿度、氧气浓度等均需要达到合适条件才可能培植出冬虫夏草子实体，而且冬虫夏草子实体不能在一般的真菌培养基上生长，其所能适应的培养基范围极为狭窄，以上多种影响因素使得人工培植冬虫夏草子实体成为一个难题，而一般的有限次试验根本无法将上述培植条件调整到一个合适的范围，这些问题使得现有技术中尚无利用中国被毛孢菌成功培植出冬虫夏草子实体的报道。
针对以上难题，申请人在对野生冬虫夏草生长特性深入研究的基础上，经过创造性的劳动，提供了一种能够利用中国被毛孢菌成功培植出冬虫夏草子实体的方法，本发明所述培植方法分为菌落培养和子实体诱导两个阶段。
菌落的生长程度直接关系着子实体的长出与否，菌落过大会消耗掉过多的培养基营养，子实体营养不足就不会长出；而菌落过小，则不容易长出子实体。因此，本发明培养菌落的时间为35-55天，优选为40-50天，更优选为45天。同时，所述菌落培养的温度优选为17-19℃，更优选为18℃，所述菌落培养的相对湿度优选为50-60%，更优选为55%。
本发明模拟冬虫夏草生长的高原环境，在诱导子实体阶段，降低氧气浓度为10-15%，并降温至10℃以下，提高空气相对湿度，只有这种环境才能促使冬虫夏草子实体的长出，作为优选，本发明诱导子实体的氧气浓度为12%，所述诱导子实体的温度为4-6℃，更优选为5℃，所述诱导子实体的相对湿度为75-85%，更优选为80%。为了保证所诱导的冬虫夏草子实体粗壮、饱满，本发明优选诱导子实体的时间为5-6个月，此时获得子实体长度在3-8cm。
利用本发明所述培植方法多次培育冬虫夏草子实体，结果显示平均每个试管斜面培养基上能够培育出3-8根子实体，产量为0.4-1.1根/cm2。
在单菌落培植试验中，按照本发明所述培植方法进行培植，可以获得2-8根子实体，长度在4-8cm，与现有的单菌落获得1根子实体、子实体最长长度5cm的结果相比有很大的提高。
此外，本发明还提供一种由本发明所述培植方法培育的子实体。本发明所培育出的冬虫夏草子实体的外形、颜色与野生的冬虫夏草子实体完全一致，为浅棕色或棕色，并且还对所培植的冬虫夏草子实体进行了ITS特异性PCR扩增并测序，测序比对结果为冬虫夏草［Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc］，表明本发明所述培植方法培育出的子实体为真正的冬虫夏草子实体。
由以上技术方案可知，本发明将中国被毛孢菌接种于特定的培养基中，并控制中国被毛孢在不同生长阶段的湿度和温度等条件，在低温、避光和少氧的环境中培育出真正的冬虫夏草子实体，其免疫调节作用和活性物质含量与野生冬虫夏草子实体基本无差别。
附图说明
图1所示为本发明所述冬虫夏草子实体DNA序列的BLAST对比图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种冬虫夏草子实体及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种冬虫夏草子实体及其制备方法进行详细说明。
实施例1：本发明所述培植方法培育冬虫夏草子实体
1、培植方法
称取葡萄糖3g，蛋白胨1g，酵母浸出粉0.5g，水解乳蛋白0.5g，无水MgSO4 0.05g，KH2PO4 0.1g，琼脂2g，水100ml，配制成4支直径为3cm的试管固体培养基并灭菌备用。同时分离自野生的冬虫夏草，经过纯化，培养得到冬虫夏草的无性型中国被毛孢。
把中国被毛孢菌种切成4×4mm大小的小块接在各固体斜面培养基上，然后放入18℃、相对湿度为55%的的环境下培养45天。
将菌落转至无光照、氧气浓度为12%的诱导容器中，其相对湿度控制在80%，温度控制在5℃，培养6个月4支试管共获得28根子实体，子实体长度在4～8cm，为簇生或单生，浅棕色或棕色，产量约为1根/cm2（单支试管培养基面积为7.06cm2）。
2、单菌落培植试验
挑取1中的中国被毛孢菌落，把切成4×4mm大小的菌块接在固体斜面培养基上，按1中方法进行培植，单个菌落可获得8根子实体，子实体长度在4～8cm，这与文献《人工培养冬虫夏草研究》公布的数据相比（详见背景技术最后一段）有很大的提高，表明本发明所述培植方法能够提高冬虫夏草子实体的数量和长度。
实施例2：本发明所述冬虫夏草子实体的ITS序列分析
真菌18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守，其间的间隔区为内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer,ITS），真菌rDNA ITS序列（内转录间隔区）在进化上具有保守性，对此序列的检测有助于分析其遗传关系。
提取实施例1子实体部位的DNA，进行ITS特异性PCR扩增，并进行测序和在Genbank中进行BLAST对比，测序结果为586个碱基，序列见SEQ IDNO:1，BLAST对比结果为冬虫夏草［Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc］，BLAST对比图见图1。
实施例3：本发明所述培植方法培育冬虫夏草子实体
1、培植方法
称取葡萄糖2.67g，蛋白胨1.00g，酵母浸出粉0.50g，水解乳蛋白0.50g，无水MgSO4 0.05g，KH2PO4 0.10g，琼脂1.83g，水100ml，配制成4支直径为3cm的试管固体培养基并灭菌备用。同时分离自野生的冬虫夏草，经过纯化，培养得到冬虫夏草的无性型中国被毛孢。
把中国被毛孢菌种切成4×4mm大小的小块接在固体斜面培养基上，然后放入14℃、相对湿度为45%的的环境下培养55天。
将菌落转至无光照、氧气浓度为15%的诱导容器中，其相对湿度控制在70%，温度控制在0℃，培养5个月4支试管共获得20根子实体，子实体长度在4～8cm，为簇生或单生，浅棕色或棕色，产量约为0.7根/cm2（单支试管培养基面积为7.06cm2）
2、单菌落培植试验
挑取1中的中国被毛孢菌落，把切成4×4mm大小的菌块接在固体斜面培养基上，按1中方法进行培植，单个菌落可获得5根子实体，子实体长度在4～8cm，这与文献《人工培养冬虫夏草研究》公布的数据相比（详见背景技术最后一段）有很大的提高，表明本发明所述培植方法能够提高冬虫夏草子实体的数量和长度。
此外，将本实施例培育出的冬虫夏草子实体按照实施例2的方法进行检测，其序列的BLAST对比结果为冬虫夏草［Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc］。
实施例4：本发明所述培植方法培育冬虫夏草子实体
1、培植方法
称取葡萄糖3.51，蛋白胨1.00g，酵母浸出粉0.50g，水解乳蛋白0.5g，无水MgSO4 0.05g，KH2PO4 0.10g，琼脂2.25g，水100ml，配制成4支直径为3cm的试管固体培养基并灭菌备用。同时分离自野生的冬虫夏草，经过纯化，培养得到冬虫夏草的无性型中国被毛孢。
把中国被毛孢菌种切成4×4mm大小的小块接在各固体斜面培养基上，然后放入20℃、相对湿度为60%的的环境下培养35天。
将菌落转至无光照、氧气浓度为10%的诱导容器中，其相对湿度控制在90%，温度控制在10℃，培养6个月4支试管共获得12根子实体，子实体长度在3～8cm，为簇生或单生，浅棕色或棕色，产量约为0.4根/cm2（单支试管培养基面积为7.06cm2）
2、单菌落培植试验
挑取1中的中国被毛孢菌落，把切成4×4mm大小的菌块接在固体斜面培养基上，按1中方法进行培植，单个菌落可获得2根子实体，子实体长度在4～8cm，这与文献《人工培养冬虫夏草研究》公布的数据相比（详见背景技术最后一段）有很大的提高，表明本发明所述培植方法能够提高冬虫夏草子实体的数量和长度。
此外，将本实施例培育出的冬虫夏草子实体按照实施例2的方法进行检测，其序列的BLAST对比结果为冬虫夏草［Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc］。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种冬虫夏草子实体的培植方法，其特征在于，将中国被毛孢菌接种在固体培养基上，在避光、14-20℃和45-60%相对湿度的条件下进行菌落培养35-55天，然后转至避光、10-15%氧气浓度、0-10℃和70-90%相对湿度的条件下诱导子实体至子实体长出，所述固体培养基由葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、水解乳蛋白、无水硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂和水组成，质量比依次为28～32∶8～12∶4～6∶4～6∶0.4～0.6∶0.8～1.2∶18～22∶800～1200。
2.根据权利要求1所述培植方法，其特征在于，所述固体培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、水解乳蛋白、无水硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂和水的质量比为30∶10∶5∶5∶0.5∶1∶20∶1000。
3.根据权利要求1所述培植方法，其特征在于，所述菌落培养的温度为17-19℃。
4.根据权利要求1所述培植方法，其特征在于，所述菌落培养的相对湿度为50-60%。
5.根据权利要求1所述培植方法，其特征在于，所述诱导子实体的温度为4-6℃。
6.根据权利要求1所述培植方法，其特征在于，所述诱导子实体的相对湿度为75-85%。
7.根据权利要求1所述培植方法，其特征在于，所述诱导子实体的氧气浓度为10-15%。
8.根据权利要求1所述培植方法，其特征在于，所述诱导子实体的时间为5-6个月。
9.根据权利要求1所述培植方法，其特征在于，所述菌落培养的时间为40-50天。
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