CN100389191C - 一种高活性野生虫草菌株及其子实体和人工栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高活性野生虫草菌株及其子实体和人工栽培方法，所提供的高活性野生虫草新菌株为日本虫草广东变型GDIM_C050423 CCTCC M 206051，由该菌株经人工栽培可生产出具有高活性物质成分的子实体，所述的人工栽培方法包括母种制作，一级液体种制作，二级生产种制作，接种和人工栽培和采收等阶段。所得的子实体是一种新产品，有以下特征：子实体棒状，不分枝或少在子实体顶部有短分枝，黄褐色至黑褐色，顶部有颗粒状小点或无，长椭圆形至柱形，少见尖状顶部。该产品在形态上与冬虫夏草的子座相似，具有丰富的营养价值和保健作用，其中虫草酸的含量可达39.2%以上，远远高于其他虫草种类，可作为食品应用。
Description
技术领域
本发明属微生物技术领域，涉及高活性野生虫草菌株及其子实体和人工栽培方法。
背景技术
虫草属(Cordyceps)隶属于子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)。虫草属真菌在我国的药用历史悠久，特别是尤以冬虫夏草最为著名，具有多种治疗和滋补保健作用，享誉海内外。此外蛹虫草(又称为北虫草)(C.militaris.)、蝉花(C.sobolifer)、古尼虫草(C.gunnii.)等都有类似于冬虫夏草的作用，部分种类的活性成份比冬虫夏草要高(陈万群等，1993)。
现代科学研究表明，虫草中的虫草素、虫草酸、腺苷等各种有效成份具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、滋阴壮阳、保肝益肺和提高免疫力等多种功效，而且虫草子实体中还含有多类对人体有益的营养成分。随着人们生活水平和品质的提高，对冬虫夏草的需求不断增加，连年采挖，野生虫草资源日愈贫乏，虫草的生态环境遭受了严重的破坏。而至今为止，冬虫夏草还未能规模化人工栽培，恶性循环，使冬虫夏草价格逐年上升，远远未能满足人们日益增长的需求。因此，寻找新的虫草资源并进行相应的人工栽培技术研究，不但可以有效地缓解这种供需矛盾，而且对提高我国人民的健康水平和生活水平有着重要意义。
在世界上人工培育虫草研究中，能成功产生子座的虫草种类不多。如蛹虫草(谷恒生等，1986)、冬虫夏草(沈南英等，1981)、棒形虫草(C.clavulata Ell.et Ew)(耶文拉霍娃，1982)、布氏虫草(C.Brongniartii Shimazu)(Shimizu et al.，1988)、古尼虫草(C.gunnii(Berk.)Berk.)(刘杰麟等，1990)、瘤座虫草(C.tuberculata(Lebrt.)Maire.)(凌建亚等，1999)、泰山虫草(C.taishanensis)(安秀荣等，2003)、台湾虫草(C.formosana)(李春如等，2005)等。这些已人工栽培的种类仅占目前已知种类的很少一部分，且都处于试验室阶段。目前，只有蛹虫草能利用家蚕和柞蚕及其它培养基进行商业化生产，并获得与天然蛹虫草较为一致的子实体。因此，加强新虫草资源的开发研究，拓展人工栽培新种类是解决当前虫草资源需求紧张的有力途径之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种可人工栽培生产出具有高活性物质成分的子实体的高活性野生虫草新菌株；
本发明还提供一种虫草新产品，为利用该高活性野生虫草菌株人工栽培得到的具有高活性物质成分的子实体，以及所述的子实体的人工栽培方法。
本发明所提供的高活性野生虫草新菌株，是在广东野外发现并采用组织分离方法获得的，该菌株命名为：日本虫草广东变型(Cordyceps japonica fguangdongensis)GDIM_C050423，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 206051，简称日本虫草广东变型GDIM_C050423 CCTCC M 206051，该虫草菌株经鉴定，与日本虫草(Cordyceps japonica Lloyd)最为接近，区别在于：
菌株特性：菌丝生长在固体培养基上，基生菌丝发达，气生菌丝甚少。光照10小时/天，3-4天后，菌丝逐渐转为黄色。而文献报道的日本虫草生长在固体培养基上的白色菌丝受光照时并不转成黄色。
子实体形态特征：子座高5-11cm，头部稍膨大，直径3-6mm，不如野生子实体粗，黄褐色至黑褐色，成熟时有颗粒状小点。柄细长，直径2-4mm，褐色。
本菌种经分子生物学技术鉴定，包括进行ITS-PCR、测序并与Genbank中所登录的日本虫草(Cordyceps japonica Lloyd)序列相比对，相似率为98％。
由本发明的高活性野生虫草新菌株，即日本虫草广东变型GDIM_C050423 CCTCC M206051菌株经人工栽培，可生产出具有高活性物质成分的高活性野生虫草子实体，该子实体一种新产品，有以下特征：
子实体棒状，不分枝或少在子实体顶部有短分枝，黄褐色至黑褐色，顶部有颗粒状小点或无，长椭圆形至柱形，少见尖状顶部。
本发明所述的高活性野生虫草子实体的人工栽培方法，需经以下栽培阶段：
(1)母种制作：将出发菌株接入无菌的加富PDA斜面培养基中，20-25℃下，暗培养10-15天后，光照4-6天，选取转色较快且菌丝生长整齐的菌种，作为母种；
(2)一级液体种制作：将经复壮挑选的母种接至无菌液体培养基中，振荡培养7-10天，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2-3毫米的作为一级菌种；
(3)二级生产种制作：将一级液体菌种按V/V为3％～10％的比例接入液体培养基中，按一级液体菌种的培养方式进行培养，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2-3毫米的作为二级生产种，用于虫草的栽培生产；
(4)接种和人工栽培：在无菌室或超净工作台内，将经无菌水稀释的二级生产种接入无菌的栽培培养基中，每瓶接入17-22毫升。再进行避光培养9-14天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强400-1000Lux，空气相对湿度80-90％，18-25℃，经7-12天即可长出子实体原基，再培养40-50天；
(5)采收：待子实体顶部变成圆形，并出现颗粒状小点时，即可采收。
在本发明所述的的栽培方法中，一级液体种和二级生产种制作所用的液体培养基可采用如下配方(按质量百分比计)：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，麦芽浸出粉0.3％，酵母浸膏0.3％，pH6.0-6.5。
用于接种的所述的栽培培养基可由大米和营养液按重量比1∶1～1.5配制而成，所述的营养液的质量百分比配方为：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，麦芽浸出粉0.3％，酵母浸膏0.3％，pH6.0～6.5。
在进行高活性野生虫草子实体的人工栽培时，为防止出发菌株(原始菌株)退化，还需按照常规方法对菌种进行复壮。
本发明经过多次重复，均能达到本发明的目的，即能成功栽培出高活性野生虫草子实体。优良的菌种培养和子实体培养条件的建立是本发明得以实现的关键。
本发明的产品，即高活性野生虫草子实体含有多种有效成分，可作为食品应用。以下是对其进行成分分析的结果及产品成份含量范围：
| 分析项目 | 检测结果(mg/g) | 含量范围(mg/g) |
| 腺苷 | 0.81 | 0.50～1.00 |
| 虫草素 | 0.15 | 0.1～0.2 |
| 甘露醇(虫草酸) | 395 | 350～450 |
本发明提供的高活性野生虫草新菌株经所述的人工栽培方法所形成的产品(子座部分)在形态上与冬虫夏草的子座相似，具有丰富的营养价值和保健作用，其中虫草酸的含量可达39.2％以上，远远高于其他虫草种类。且产品经广东省疾病预防控制中心毒理实验所检验，属于无毒级物质。因此，此虫草产品将能缓解当前虫草资源紧缺的局面，能更好地满足人们对虫草的需求，提高人们的生活质量和健康水平。
具体实施方式：
利用本发明的高活性野生虫草新菌株，即日本虫草广东变型GDIM_C050423 CCTCC M206051菌株栽培生产高活性野生虫草子实体的过程如下：
1.菌种分离、保藏与复壮
1.1原始菌种
原始菌种为在广东野外发现并采用组织分离方法获得的日本虫草广东变型GDIM_C050423 CCTCC M 206051菌株。
1.2母种
将原始菌种接入无菌的加富PDA斜面培养基中，20-25℃下，暗培养10-15天后，光照4-6天，选取转色快且菌丝生长整齐的菌种，作为母种。
1.3复壮
经多次栽培，挑选出品质优良的母种，在其培养基中增加1-2％的葡萄糖，进行复壮。
2.菌种制作
2.1一级菌种
将经筛选的母种接至经灭菌的液体培养基中，并放入一个螺旋钢丝圈，用于分散菌丝球，在25℃，140r/m，振荡培养7-10天。选取菌丝球大小均匀一致、直径为2-3毫米的作为一级菌种。一级菌种也可直接用于栽培生产。培养基配方(质量百分比)：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，麦芽浸出粉0.3％，酵母浸膏0.3％，pH6.0-6.5。
2.2二级菌种
将一级菌种按5-8％的比例(体积比)接入液体培养基中，并放入一个螺旋钢丝圈，用于分散菌丝球，按一级菌种的培养方式进行培养，至菌球充满全部液体培养基即可。选取菌丝球大小均匀一致、直径为2-3毫米的作为二级菌种，直接用于栽培生产。
3.栽培培养基配制
大米和营养液按1∶1.2的比例(重量比)进行配制，用聚乙烯耐高温薄膜封口，经121℃，高压灭菌40分钟，冷却后即可用于接种。营养液配方为：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，麦芽浸出粉0.3％，酵母浸膏0.3％，pH6.0-6.5。
4.接种和人工栽培
在无菌室或超净工作台内，用无菌水按1∶2的比例稀释二级菌种，再将经稀释的菌种接入无菌的栽培培养基中，每瓶接入17-22毫升。避光培养9-14天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强400-1000Lux，空气相对湿度80-90％，18-25℃，经7-12天即可长出子实体原基，再培养40-50天，待子实体顶部变成圆形，并出现颗粒状小点时，即可采收。
Claims (5)
1.一种高活性野生虫草菌株，其特征在于该菌株在野外发现并采用组织分离方法获得，该菌株命名为：日本虫草广东变型(Cordyceps japonica f guangdongensis)GDIM_C050423，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 206051，简称日本虫草广东变型GDIM_C050423 CCTCC M 206051，其菌株特性为：菌丝生长在固体培养基上，基生菌丝发达，气生菌丝甚少，光照10小时/天，3-4天后，菌丝逐渐转为黄色；子实体形态特征为：子座高5-11cm，头部稍膨大，直径3-6mm，黄褐色至黑褐色，成熟时有颗粒状小点，柄细长，直径2-4mm，褐色。
2.一种高活性野生虫草子实体，其特征在于由日本虫草广东变型GDIM_C050423 CCTCM 206051菌株人工栽培而得，该子实体为棒状，不分枝或少在子实体顶部有短分枝，黄褐色至黑褐色，顶部有颗粒状小点或无，长椭圆形至柱形，少见尖状顶部。
3.权利要求2所述的高活性野生虫草子实体的人工栽培方法，其特征在于以日本虫草广东变型GDIM_C050423 CCTCC M 206051为出发菌株，经以下栽培阶段：
(1)母种制作：将出发菌株接入无菌的加富PDA斜面培养基中，20-25℃下，暗培养10-15天后，光照4-6天，选取转色较快且菌丝生长整齐的菌种，作为母种；
(2)一级液体菌种制作：将经复壮挑选的母种接至无菌液体培养基中，振荡培养7-10天，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2-3毫米的作为一级菌种；
(3)二级生产种：将一级液体菌种按V/V为3％～10％的比例接入液体培养基中，按一级液体菌种的培养方式进行培养，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2-3毫米的作为二级生产种，用于虫草的栽培生产；
(4)接种和出草管理：在无菌室或超净工作台内，将经无菌水稀释的二级生产种接入无菌的栽培培养基中，每瓶接入17-22毫升，再进行避光培养9-14天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强400-1000Lux，空气相对湿度80-90％，18-25℃，经7-12天即可长出子实体原基，再培养40-50天；
(5)采收：待子实体顶部变成圆形，并出现颗粒状小点时，即可采收。
4.根据权利要求3所述的高活性野生虫草的人工栽培方法，其特征在于所述的液体培养基的质量百分比配方为：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，麦芽浸出粉0.3％，酵母浸膏0.3％，pH6.0-6.5。
5.根据权利要求3所述的高活性野生虫草的人工栽培方法，其特征在于所述的栽培培养基由大米和营养液按重量比1∶1～1.5配制而成，所述的营养液的质量百分比配方为：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，麦芽浸出粉0.3％，酵母浸膏0.3％，pH6.0～6.5。
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