CN105037469A - 一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，包括以下步骤：将北冬虫夏草子实体经清水冲洗，加入乙醚脱脂；配制固体发酵培养基对样品进行发酵培养、过滤，制备样品滤液；将NKA-Ⅱ型大孔树脂采用乙醇浸泡进行预处理；在预处理好的NKA-Ⅱ型大孔树脂中按比例加样品滤液，进行摇床振荡培养，采用乙醇洗脱，对洗脱液在259nm处测定吸光度值，进行虫草素含量的测定。本发明对固态培养基的成分进行了严格优化，使北冬虫夏草菌丝体生长更有利，可明显提高菌丝体中的主要有效成分之一麦甾醇的含量；本发明采用对虫草素的吸附能力最强的NKA-II型树脂作为吸附载体，将吸附时间限定为3-6h，虫草素得率高；整个操作简便，成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法。
背景技术
冬虫夏草是麦角菌科真菌，首载于本草从新，味甘，性温，归肺，肾经，具有具有多种生理活性，如补虚损、益精气、保肺、益肾、止血化痰、滋补强壮、抗氧化、提高免疫力等，因此，常用来治疗劳咳痰血、盗汗、阳痿、遗精、黄胆病、肺结核及老年衰弱、慢性咳喘等症，为我国名贵中药材之一。
虫草素（cordycepin）又称虫草菌素、蛹虫草菌素、3′-脱氧腺苷（3-deoxyadenosine），是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。早在1950年，国外学者Cunninghametal.观察到被蛹虫草Cordycepsmilitaris寄生的昆虫组织不易腐烂，进而从中分离出一种抗菌性物质，定名为虫草素，之后许多学者对其进行了验证研究（Kaczkaetal.1964b；Frederiksenetal.1965）。虫草素分子式为C10H13N5O3，王成明等国内这者于2009报道虫草素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、清除自由基等药理作用，目前，已经出现以虫草素为主要成分的新药应用于白血病的治疗，它在临床上有着良好的应用前景。目前已报道的虫草素产生菌主要是虫草属的一些种类及其上分离得到的菌株，而天然冬虫夏草子实体中基本不含虫草素，发酵菌丝体中却含有极低含量的虫草素。北冬虫夏草是主要产虫草素的菌株，研究表明，其深层发酵液中含有大量虫草素，因此，对北冬虫夏草深层发酵液中的虫草素进行有效分离、纯化显得十分重要。离子交换树脂吸附法、反相高效液相色谱法等是目前虫草素主要的分离纯化方法，但前者需要用酸碱处理，后期处理比较复杂，其他方法虫草素提取率低，难以进行工业化生产。为此，本发明提供一种操作简便、虫草素得率高的大孔吸附树脂分离纯化方法。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，操作简便，虫草素得率高。
本发明的技术方案如下：
一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，包括以下步骤：
（1）样品前处理：将保藏好的北冬虫夏草子实体5-10g经清水冲洗，加入乙醚脱脂，再加清水反复冲洗，烘干备用；
（2）配制固体发酵培养基：取葡萄糖2-5g，玉米粉2-4g，蛋白胨1-2g，麦麸2-4g，KH2PO42-4g,MgSO41-2g，VitaminB12-4g，VitaminB23-6g，培养基中加入蒸馏水，加热煮沸，调节PH，趁热倒入容器中，高压蒸汽灭菌，倒在平板上；
（3）发酵培养：将步骤（1）中经样品前处理后的样品接种到步骤（2）中制备好的培养基中，培养完成后取菌种发酵液，经0.45um微孔滤膜过滤，取样品滤液备用；
（4）树脂的预处理：将NKA-Ⅱ型大孔树脂采用乙醇浸泡，除去上浮的树脂碎片，反复浸泡3-5次，至洗涤液3倍体积水无白色浑浊为止，最后用蒸馏水淋洗直至无乙醇味；
（5）称取步骤（4）中预处理好的NKA-Ⅱ型大孔树脂2-5g，加入10-20ml步骤（3）中制备好的样品滤液，进行摇床振荡培养3-6h，将吸附后的树脂采用清水洗涤3-5次，采用乙醇洗脱，对洗脱液在259nm处测定吸光度值，进行虫草素含量的测定。
优选的，步骤（1）中所述的烘干温度均为50-80℃。
优选的，步骤（2）中加蒸馏水的量是按料水比（1-3）:（1.5-5）的体积加入的。
优选的，步骤（2）中调节PH为调节PH至6.5-7.2。
优选的，步骤（2）中所述的高压蒸汽灭菌时间为10-20min。
优选的，步骤（3）中所述的培养温度为25-28℃，培养为无光照培养，培养时间为5-7d。
优选的，步骤（4）中所述的乙醇的浓度为90-95%，采用乙醇浸泡的时间为每次12-24h。
优选的，步骤（5）中的摇床培养速度为100-120r/min。
优选的，步骤（5）中所述的乙醇的浓度为40-50%。
优选的，步骤（5）中所述的乙醇的加入量为NKA-Ⅱ型大孔树脂体积的4-6倍，采用乙醇洗脱的时间为60-120min。
本发明与现有技术相比，有益效果体现在：
1.本发明中将蛋白胨作为固态培养基的氮源，可提高虫草菌丝体及其主要有效成分的含量；本发明对固态培养基的成分进行了严格优化，对固态培养时的培养温度、料水比及光照等培养条件也进行了严格控制，对冬虫夏草菌丝体生长更有利，可明显提高菌丝体中的主要有效成分之一麦甾醇的含量。
2.本发明在对北冬虫夏草进行深层发酵时，先采用清水冲洗，再采用乙醚脱脂，再采用清水冲洗，可有效去除样品中有关杂质对后续虫草素的提取。
3.研究显示，NKA-II型树脂对虫草素的吸附能力最强，为此，本发明选择NKA-II型树脂作为虫草素的吸附载体；另外，虫草素在NKA-II型树脂上静态吸附时间达到3h后，虫草吸附率可达90%或以上，在吸附6h时,吸附率可达95%或以上，因此，本发明将NKA-II型树脂吸附时间限定为3-6h，可最大限度的吸附发酵液中的虫草素。
4.在对吸附有虫草素的NKA-II型树脂进行解吸时，体积分数为50%左右的乙醇解吸率可达90%以上，而体积分数为95%的乙醇解吸率也为90%以上，为此，本发明选择体积分数为40-50%的乙醇作为洗脱剂进行解吸，不仅不会对虫草素的解吸产生影响，而且节省了成本；另外，加入的乙醇洗脱剂的体积为NKA-II型树脂的4-6倍，可人使虫草素解吸率达90%以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例1
一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，包括以下步骤：
（1）样品前处理：将保藏好的北冬虫夏草子实体5g经清水冲洗，加入乙醚脱脂，再加清水反复冲洗，在50℃下烘干备用；
（2）配制固体发酵培养基：取葡萄糖2g，玉米粉2g，蛋白胨1g，麦麸2g，KH2PO42g,MgSO41g，VitaminB12g，VitaminB23g，培养基中加入蒸馏水，加热煮沸，调节PH至6.5，趁热倒入容器中，高压蒸汽灭菌10min，倒在平板上；
（3）发酵培养：将步骤（1）中经样品前处理后的样品接种到步骤（2）中制备好的培养基中，在25℃下无光照培养5d，培养完成后取菌种发酵液，经0.45um微孔滤膜过滤，取样品滤液备用；
（4）树脂的预处理：将NKA-Ⅱ型大孔树脂采用90%的乙醇浸泡12h，除去上浮的树脂碎片，反复浸泡3次，至洗涤液3倍体积水无白色浑浊为止，最后用蒸馏水淋洗直至无乙醇味；
（5）称取步骤（4）中预处理好的NKA-Ⅱ型大孔树脂2-5g，加入10-20ml步骤（3）中制备好的样品滤液，以100r/min速度进行摇床振荡培养3h，将吸附后的树脂采用清水洗涤3次，采用NKA-Ⅱ型大孔树脂体积4倍的40%的乙醇洗脱60min，对洗脱液在259nm处测定吸光度值，进行虫草素含量的测定。
步骤（2）中加蒸馏水的量是按料水比1:1.5的体积加入的。
实施例2
一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，包括以下步骤：
（1）样品前处理：将保藏好的北冬虫夏草子实体10g经清水冲洗，加入乙醚脱脂，再加清水反复冲洗，在80℃下烘干备用；
（2）配制固体发酵培养基：取葡萄糖5g，玉米粉4g，蛋白胨2g，麦麸4g，KH2PO44g,MgSO42g，VitaminB14g，VitaminB26g，培养基中加入蒸馏水，加热煮沸，调节PH至7.2，趁热倒入容器中，高压蒸汽灭菌20min，倒在平板上；
（3）发酵培养：将步骤（1）中经样品前处理后的样品接种到步骤（2）中制备好的培养基中，在28℃下无光照培养7d，培养完成后取菌种发酵液，经0.45um微孔滤膜过滤，取样品滤液备用；
（4）树脂的预处理：将NKA-Ⅱ型大孔树脂采用95%的乙醇浸泡24h，除去上浮的树脂碎片，反复浸泡5次，至洗涤液3倍体积水无白色浑浊为止，最后用蒸馏水淋洗直至无乙醇味；
（5）称取步骤（4）中预处理好的NKA-Ⅱ型大孔树脂5g，加入20ml步骤（3）中制备好的样品滤液，以120r/min速度进行摇床振荡培养6h，将吸附后的树脂采用清水洗涤5次，采用NKA-Ⅱ型大孔树脂体积6倍的50%的乙醇洗脱120min，对洗脱液在259nm处测定吸光度值，进行虫草素含量的测定。
步骤（2）中加蒸馏水的量是按料水比3:5的体积加入的。
实施例3
一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，包括以下步骤：
（1）样品前处理：将保藏好的北冬虫夏草子实体8g经清水冲洗，加入乙醚脱脂，再加清水反复冲洗，在65℃下烘干备用；
（2）配制固体发酵培养基：取葡萄糖3.5g，玉米粉3g，蛋白胨1.5g，麦麸3g，KH2PO43g,MgSO41.5g，VitaminB13g，VitaminB24.5g，培养基中加入蒸馏水，加热煮沸，调节PH至7.0，趁热倒入容器中，高压蒸汽灭菌15min，倒在平板上；
（3）发酵培养：将步骤（1）中经样品前处理后的样品接种到步骤（2）中制备好的培养基中，在26℃下无光照培养6d，培养完成后取菌种发酵液，经0.45um微孔滤膜过滤，取样品滤液备用；
（4）树脂的预处理：将NKA-Ⅱ型大孔树脂采用93%的乙醇浸泡18h，除去上浮的树脂碎片，反复浸泡4次，至洗涤液3倍体积水无白色浑浊为止，最后用蒸馏水淋洗直至无乙醇味；
（5）称取步骤（4）中预处理好的NKA-Ⅱ型大孔树脂3.5g，加入15ml步骤（3）中制备好的样品滤液，以110r/min速度进行摇床振荡培养4.5h，将吸附后的树脂采用清水洗涤4次，采用NKA-Ⅱ型大孔树脂体积5倍的45%的乙醇洗脱100min，对洗脱液在259nm处测定吸光度值，进行虫草素含量的测定。
步骤（2）中加蒸馏水的量是按料水比2:3的体积加入的。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品前处理：将保藏好的北冬虫夏草子实体5-10g经清水冲洗，加入乙醚脱脂，再加清水反复冲洗，烘干备用；
（2）配制固体发酵培养基：取葡萄糖2-5g，玉米粉2-4g，蛋白胨1-2g，麦麸2-4g，KH2PO42-4g,MgSO41-2g，VitaminB12-4g，VitaminB23-6g，培养基中加入蒸馏水，加热煮沸，调节PH，趁热倒入容器中，高压蒸汽灭菌，倒在平板上；
（3）发酵培养：将步骤（1）中经样品前处理后的样品接种到步骤（2）中制备好的培养基中，培养完成后取菌种发酵液，经0.45um微孔滤膜过滤，取样品滤液备用；
（4）树脂的预处理：将NKA-Ⅱ型大孔树脂采用乙醇浸泡，除去上浮的树脂碎片，反复浸泡3-5次，至洗涤液3倍体积水无白色浑浊为止，最后用蒸馏水淋洗直至无乙醇味；
（5）称取步骤（4）中预处理好的NKA-Ⅱ型大孔树脂2-5g，加入10-20ml步骤（3）中制备好的样品滤液，进行摇床振荡培养3-6h，将吸附后的树脂采用清水洗涤3-5次，采用乙醇洗脱，对洗脱液在259nm处测定吸光度值，进行虫草素含量的测定。
2.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，步骤（1）中所述的烘干温度均为50-80℃。
3.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，步骤（2）中加蒸馏水的量是按料水比（1-3）:（1.5-5）的体积加入的。
4.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，步骤（2）中调节PH为调节PH至6.5-7.2。
5.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，步骤（2）中所述的高压蒸汽灭菌时间为10-20min。
6.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，步骤（3）中所述的培养温度为25-28℃，培养为无光照培养，培养时间为5-7d。
7.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，步骤（4）中所述的乙醇的浓度为90-95%，采用乙醇浸泡的时间为每次12-24h。
8.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，步骤（5）中的摇床培养速度为100-120r/min。
9.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，步骤（5）中所述的乙醇的浓度为40-50%。
10.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草深层发酵液中虫草素的提取方法，其特征在于，步骤（5）中所述的乙醇的加入量为NKA-Ⅱ型大孔树脂体积的4-6倍，采用乙醇洗脱的时间为60-120min。
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