CN108866144B - 一种制备和纯化虾青素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种制备和纯化虾青素的方法，其包括如下步骤：步骤1）淀粉废水预处理，步骤2）制备混合菌液，步骤3）菌藻混合培养，步骤4）提取虾青素，步骤5）纯化虾青素。本发明方法通过从雨生红球藻中制备和纯化虾青素，提高了虾青素的纯度,收率达到90%以上。

Description

一种制备和纯化虾青素的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备和纯化虾青素的方法。

背景技术

虾青素(astaxanthin)，化学名称为3,3′-二羟基-4,4 ′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，为萜烯类不饱和化合物，化学分子式为C40H52O4，分子结构中有两个β-紫罗兰酮环，11个共轭双键，化学结构与β-胡萝卜素类似。虾青素广泛存在于自然界，如大多数甲壳类动物和鲑科鱼类体内，植物的叶、花、果，以及火烈鸟的羽毛中等，特别是虾、蟹、鱼、藻体、酵母和鸟类的羽毛中含量较高，是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一。

虾青素世界上最强的天然抗氧化剂之一，有效清除细胞内的氧自由基，增强细胞再生能力，维持机体平衡和减少衰老细胞的堆积，由内而外保护细胞和DNA健康，从而保护皮肤健康，促进毛发生长，抗衰老、缓解运动疲劳、增强活力。自2008年以来，国内外大量研究证实虾青素具有较强的抗氧化活性，在提高免疫力，预防肿瘤、心血管疾病、糖尿病等慢性疾病的发生发展，延缓衰老等方面具有积极的促进作用。目前主要作为人类的高级保健食品、药品，以及水产养殖动物和家禽、家畜的饲料添加剂。随着虾青素多种生理功能的发现，在国内外引起了虾青素的研究热潮。虾青素的生产具有人工合成和生物获取两种方式。人工合成虾青素不仅价格昂贵，而且同天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面差别显著，动物对化学合成的虾青素吸收能力较弱，且在体内不能转化成天然构型。生物获取主要来源于水产品加工工业的废弃物、红发夫酵母和微藻。其中，废弃物中虾青素含量较低，且提取费用较高，不适于进行大规模生产。天然的红发夫酵母中虾青素平均含量也仅为0.40%。相比之下，雨生红球藻中虾青素含量却高达1.5%－3.0%，因此被看作是天然虾青素的“浓缩品”。雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物，因此，利用这种微藻提取虾青素无疑具有广阔的发展前景，已成为国际上天然虾青素生产的研究热点。

文献“营养胁迫对雨生红球藻虾青素累积的影响，水生生物学报2000年”发现，通过改变营养条件可诱导雨生红坏灌积累虾青素，色素的速率与原初氮浓度成反比，氮源相对缺乏对细胞增殖及色素累积相对都有利，平衡氮源、细胞增殖以及虾青素产率是虾青素生产需要关注的重点。中国专利“CN103114121A，一种雨生红球藻生产虾青素的方法”公开了一种雨生红球藻生产虾青素的方法,先将雨生红球藻在培养池池水中自然培养6～8天,让其增殖,再在池水中加入磷酸二氢钾和硝酸钠,并在池上覆有红色薄膜,波长为630nm～760nm光波照射下,虾青素含量可以达到1％以上。文献“温度对雨生红球藻(Haematococcuspluv ialis)生物量和虾青素产量的影响，武汉植物学研究2005年”在用环形培养池模拟系统培养雨生红球藻的过程中, 研究了温度对雨生红球藻生物量及虾青素产量的影响，结果表明， 25℃时，红球藻生物量和虾青素产量最高，分别为2.68g/L和13.53 mg/ L，22℃时，虾青素含量最高,为1.52%。

淀粉加工是以玉米，高粱、小麦、马铃薯以及甘薯等农作物，经过浸泡、磨碎等工艺制备成淀粉的工艺技术。淀粉加工行业具备水耗较高，污染性强等特点，废水的COD很高,通常为1000～30000mg/L,还包括高浓度的SS、NH3-N、色素、淀粉以及纤维素等。淀粉生产企业每年排放大量的高浓度有机废水，而这些淀粉生产企业排放的废水处理达标率还很低，严重污染环境，如何对其进行净化利用也是需要解决的技术问题。申请人前期的研究成果“一种利用淀粉废水生产虾青素的方法”利用淀粉废水来生产虾青素，获得了粗提物，在此基础上，申请人继续对粗提物进行了纯化。

发明内容

在前期研究成果的基础上，本发明提供了一种制备和纯化虾青素的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种制备和纯化虾青素的方法，其包括如下步骤：

步骤1）淀粉废水预处理，步骤2）制备混合菌液，步骤3）菌藻混合培养，步骤4）提取虾青素，步骤5）纯化虾青素。

进一步地，

所述步骤1）淀粉废水预处理，包括如下：淀粉废水首先进入沉淀池，沉淀时间为12-24h，随后进入酸碱调节池，调节pH为7.0-7.5。

进一步地，

所述步骤2）制备混合菌液，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌培养液、植物乳杆菌培养液以及沼泽红假单胞菌培养液按照5-7:3-5:3-5的体积比混合得到复合菌液。

进一步地，

所述步骤3）菌藻混合培养，包括如下步骤：将经过预处理后的淀粉废水注入到生物反应池，首先将复合菌液按照1:（200-400）的体积比接入到淀粉废水，生物处理24-48h，然后取对数生长期的雨生红球藻，按照1:（100-200）的体积比接入到淀粉废水，光强在5000-8000lux，光暗比为12:12，培养时间为8-10天；然后将液体进行离心，离心速度为2000-3000rpm，离心时间为10-20min，收集沉淀物。

进一步地，

所述步骤4）提取虾青素，包括如下步骤：将沉淀物水洗两次，然后冷冻干燥得到粉末；然后按照1kg粉末：1-2L溶剂的量添加溶剂，超声破壁，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，总超声时间为60min，再静置30min，然后3000rpm离心5min，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理30min，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，然后3000rpm离心3min，收集上清液；合并两次上清液，低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入相同质量的浓度为的0.1mol/L的KOH/甲醇溶液，置于4℃下皂化12h，得到虾青素粗提物。

进一步地，

所述步骤5）纯化虾青素，包括如下步骤：将虾青素粗提物通过大孔吸附树脂进行吸附处理，流速为2BV/h，先用水洗脱，将KOH和甲醇洗去，再用乙醇洗脱，一部分绿色色素被洗脱下来，最后用丙酮洗脱，解析速度为1BV/h，洗脱液分为绿色和红色两部分，收集红色部分，真空浓缩后得到膏状红色提取物。

优选地，所述溶剂由乙酸乙酯和乙醇按照1:2的体积比混匀制得。

优选地，所述大孔吸附树脂选自HPD100型或D-101型。

本发明实施方式种具体使用的菌株为解淀粉芽孢杆菌ATCC23843，植物乳杆菌ATCC8014，沼泽红假单胞菌ATCC17001；本领域技术人员在实施本发明技术方案时，并不限于以上具体的菌株，也可以采用相同种属的其他菌株。

作为本发明的其他技术方案中，对复合菌液中菌株浓度没有特别的限定，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。

本发明所述的菌种属于已知菌株，均可以从ATCC等商业途径购买得到。本发明的各菌种培养步骤为本领域的常规技术，并不限于本发明记载的方式。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

淀粉废水中氨氮含量过大，游离氨和铵离子形式存在的氮受污染水体的氨氮对雨生红球藻的毒害较大，会导致雨生红球藻死亡；淀粉废水经过预处理后，毒性降低，本发明采用的复合菌液可以利用铵离子，并且降解淀粉等废弃物产生还原糖类物质，经过处理后，废水中的氨氮含量降低，并且含有丰富的碳源和色素，适合雨生红球藻的生产；菌株产生的二氧化碳能够满足藻细胞快速生长所需，从而提高虾青素的积累速率；雨生红球藻可以产生氧气和小分子化合物共菌类使用，形成共生关系；雨生红球藻可以利用废水中的硝酸根离子作为氮源，提高生长速率，通过还原反应产生的铵离子反过来被菌株利用；充足的氮源有利于藻类生物量的增加，但是不利于虾青素的积累，随着废水中氮源的降低，雨生红球藻生长速率放缓，但是虾青素积累速率明显增加。本发明复合菌液采用三种菌株，相互共生，协同性能好，能够将废水中的污染物大幅降低，从而符合雨生红球藻的生存环境。本发明方法既处理了淀粉废水，又制备了虾青素，一举两得，应用前景广阔。本发明对虾青素粗提物进行了大孔树脂吸附纯化，当用水洗脱后，KOH和甲醇等小分子杂质被除去；再用乙醇洗脱，极性较强的绿色色素物质被洗脱下来，红色部分不能被洗脱；最后用丙酮洗脱，收集富含虾青素的红色部分进行浓缩，提高了虾青素的纯度,收率达到90%以上。

附图说明

图1：培养时间对生物量的影响；

图2：培养时间对虾青素含量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种制备和纯化虾青素的方法，其包括如下步骤：

步骤1）淀粉废水预处理：淀粉废水首先进入沉淀池，沉淀时间为24h，随后进入酸碱调节池，调节pH为7.0；

步骤2）制备混合菌液：将解淀粉芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行扩大培养，获得浓度为5×10⁸cfu/ml的解淀粉芽孢杆菌培养液；

将植物乳杆菌接种到MRS固体培养基上培养，得到单菌落，然后接入到MRS液体培养基中进行扩大培养，培养至浓度为5×10⁸cfu/ml的植物乳杆菌培养液；

将沼泽红假单胞菌在LB平板上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入扩大培养基上培养，培养至浓度为3×10⁸cfu/ml的沼泽红假单胞菌培养液；所述扩大培养基的组分为：葡萄糖 10g/L、玉米浆8g/L、氯化铵1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、七水硫酸镁0.01g/L；

将解淀粉芽孢杆菌培养液、植物乳杆菌培养液以及沼泽红假单胞菌培养液按照5:3:3的体积比混合得到复合菌液；

步骤3）菌藻混合培养：将经过预处理后的淀粉废水注入到生物反应池，首先将复合菌液按照1:400的体积比接入到淀粉废水，生物处理48h，然后取对数生长期的雨生红球藻，按照1:200的体积比接入到淀粉废水，藻细胞密度为2×10⁴个/ml，光强在5000lux，光暗比为12:12，培养时间为8天；然后将液体进行离心，离心速度为2000rpm，离心时间为20min，收集沉淀物；

步骤4）提取虾青素：将沉淀物水洗两次，然后冷冻干燥得到粉末；然后按照1kg粉末：1L溶剂（乙酸乙酯和乙醇按照1:2的体积比混匀制得）的量添加溶剂，超声破壁，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，总超声时间为60min，再静置30min，然后3000rpm离心5min，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理30min，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，然后3000rpm离心3min，收集上清液；合并两次上清液，低温蒸干，残留物用两倍质量的乙醚溶解，然后加入与溶解液相同质量的浓度为的0.1mol/L的KOH/甲醇溶液，置于4℃下皂化12h，得到虾青素粗提物；

步骤5）纯化虾青素：将虾青素粗提物通过大孔吸附树脂（HPD100型）进行吸附处理，流速为2BV/h，先用水洗脱，将KOH和甲醇洗去，再用乙醇洗脱，一部分绿色色素被洗脱下来，最后用丙酮洗脱，解析速度为1BV/h，洗脱液分为绿色和红色两部分，收集红色部分，真空浓缩后得到膏状红色提取物。

实施例2

一种制备和纯化虾青素的方法，其包括如下步骤：

步骤1）淀粉废水预处理：淀粉废水首先进入沉淀池，沉淀时间为12h，随后进入酸碱调节池，调节pH为7.5；

步骤2）制备混合菌液：将解淀粉芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行扩大培养，获得浓度为7×10⁸cfu/ml的解淀粉芽孢杆菌培养液；

将植物乳杆菌接种到MRS固体培养基上培养，得到单菌落，然后接入到MRS液体培养基中进行扩大培养，培养至浓度为3×10⁸cfu/ml的植物乳杆菌培养液；

将沼泽红假单胞菌在LB平板上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入扩大培养基上培养，培养至浓度为5×10⁸cfu/ml的沼泽红假单胞菌培养液；所述扩大培养基的组分为：葡萄糖 10g/L、玉米浆8g/L、氯化铵1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、七水硫酸镁0.01g/L；

将解淀粉芽孢杆菌培养液、植物乳杆菌培养液以及沼泽红假单胞菌培养液按照7:5:5的体积比混合得到复合菌液；

步骤3）菌藻混合培养：将经过预处理后的淀粉废水注入到生物反应池，首先将复合菌液按照1:200的体积比接入到淀粉废水，生物处理24h，然后取对数生长期的雨生红球藻，按照1: 200的体积比接入到淀粉废水，藻细胞密度为1×10⁴个/ml，光强在6000lux，光暗比为12:12，培养时间为10天；然后将液体进行离心，离心速度为3000rpm，离心时间为10min，收集沉淀物；

步骤4）提取虾青素：将沉淀物水洗两次，然后冷冻干燥得到粉末；然后按照1kg粉末：1.5L溶剂（乙酸乙酯和乙醇按照1:2的体积比混匀制得）的量添加溶剂，超声破壁，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，总超声时间为60min，再静置30min，然后3000rpm离心5min，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理30min，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，然后3000rpm离心3min，收集上清液；合并两次上清液，低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入相同质量的浓度为的0.1mol/L的KOH/甲醇溶液，置于4℃下皂化12h，得到虾青素粗提物；

步骤5）纯化虾青素：将虾青素粗提物通过大孔吸附树脂（D-101型）进行吸附处理，流速为2BV/h，先用水洗脱，将KOH和甲醇洗去，再用乙醇洗脱，一部分绿色色素被洗脱下来，最后用丙酮洗脱，解析速度为1BV/h，洗脱液分为绿色和红色两部分，收集红色部分，真空浓缩后得到膏状红色提取物。

实施例3

本发明复合菌液对淀粉废水的处理效果：

以实施例1的复合菌液为例，对照组1为解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌两种菌株，其余同实施例1；对照组2为植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌，其余同实施例1；对照组3为解淀粉芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌，其余同实施例1。具体结果见表1：

表1

	预处理后	实验组	对照组1	对照组2	对照组3
						COD （mg/L）	1389	203	451	612	574
NH3-N （mg/L）	377	86	155	169	203
						硫化物 （mg/L）	203	38	67	54	81
淀粉 （mg/L）	589	73	115	141	93
						蛋白质（mg/L）	325	71	82	91	74

如表1所示，经过微生物处理后，废水中的污染物大幅降低，适合用于培养雨生红球藻。

实施例4

生物量和虾青素含量的测定：采用HPLC 法测定虾青素含量。虾青素皂化后的虾青素粗提物上样前过0.45μm 膜过滤，流动相为二氯甲烷:甲醇:乙腈:水＝5:85:5:5，使用前流动相超声脱气30min。流速1ml/min，检测波长480nm，柱温25℃，进样量20μl，计算虾青素含量。同时将干粉进行称重，计算生物量。

实验组为实施例1，同时设置对照组：将雨生红球藻在常规培养液（BG-11）条件下进行培养，其余参数步骤同实施例1。具体结果见表2：

表2

组别	生物量g/L	虾青素含量mg/g
			实验组	5.79	8.19
对照组	5.33	6.27

如表2所示，与常规培养方式相比，本发明生物量和虾青素含量均有所提升，分别达到是108.6%和130.6%；其中，虾青素含量提升幅度较大。

实施例5

藻类培养时间对生物量和虾青素含量的影响：

分别设置于2d、4d、6d、8d、10d以及12d检测了生物量和虾青素含量，如图1所示，前六天，生物量迅速增加，第六天后，生物量增幅并不明显，第八天后生物量下降，可能是因为培养初期，废水中氮源较为丰富，雨生红球藻可以快速增殖，后期氮源含量降低，不足以维持增殖，而氮源的减少有利于虾青素的积累，生物量增幅放缓时，虾青素的产量反而会大幅提高（见图2），需要平衡生物量和虾青素产量之间的关系，结合图1-2，选择8-10天较为合适。

实施例5

HPLC法检测本发明终产品的虾青素含量以及称重检测终产品的质量（按照1000g粉末获得的终产品进行计算），具体结果见表3：

表3

实例	虾青素含量%	产品质量g
			实施例1	97.7	7.85
实施例2	96.8	7.64

如表3所示，本发明产品中虾青素的含量为96%以上，收率为90%以上。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.一种制备和纯化虾青素的方法，其包括如下步骤：

步骤1）淀粉废水预处理，步骤2）制备混合菌液，步骤3）菌藻混合培养，步骤4）提取虾青素，步骤5）纯化虾青素；

所述步骤1）淀粉废水预处理，包括如下：淀粉废水首先进入沉淀池，沉淀时间为12-24h，随后进入酸碱调节池，调节pH为7.0-7.5；

所述步骤2）制备混合菌液，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌培养液、植物乳杆菌培养液以及沼泽红假单胞菌培养液按照5-7:3-5:3-5的体积比混合得到复合菌液；

所述步骤3）菌藻混合培养，包括如下步骤：将经过预处理后的淀粉废水注入到生物反应池，首先将复合菌液按照1:（200-400）的体积比接入到淀粉废水，生物处理24-48h，然后取对数生长期的雨生红球藻，按照1:（100-200）的体积比接入到淀粉废水，光强在5000-8000lux，光暗比为12:12，培养时间为8-10天；然后将液体进行离心，离心速度为2000-3000rpm，离心时间为10-20min，收集沉淀物；

所述步骤4）提取虾青素，包括如下步骤：将沉淀物水洗两次，然后冷冻干燥得到粉末；然后按照1kg粉末：1-2L溶剂的量添加溶剂，超声破壁，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，总超声时间为60min，再静置30min，然后3000rpm离心5min，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理30min，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，然后3000rpm离心3min，收集上清液；合并两次上清液，低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入相同质量的浓度为0.1mol/L的KOH/甲醇溶液，置于4℃下皂化12h，得到虾青素粗提物；所述溶剂由乙酸乙酯和乙醇按照1:2的体积比混匀制得；

所述步骤5）纯化虾青素，包括如下步骤：将虾青素粗提物通过大孔吸附树脂进行吸附处理，流速为2BV/h，先用水洗脱，将KOH和甲醇洗去，再用乙醇洗脱，一部分绿色色素被洗脱下来，最后用丙酮洗脱，解析速度为1BV/h，洗脱液分为绿色和红色两部分，收集红色部分，真空浓缩后得到膏状红色提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂选自HPD100型或D-101型。

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