CN112342145A - 一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物的复壮方法，具体涉及一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法，包括，步骤一：取当年分离的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入PDA培养基，培养至菌落表面产生气生菌丝备用；步骤二：将禽蛋去壳，置入灭菌后的容器，加入抗生素溶液混合均匀备用；步骤三：将步骤一中备用的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入步骤二加入培养液的培养器皿中培养至培养基表面长满气生菌丝为止，备用；步骤四：将步骤三中的蝙蝠蛾被毛孢菌接入装有PDA斜面培养基的试管中培养至蝙蝠蛾被毛孢菌白色气生菌丝长满试管，步骤五：将步骤四中的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入种子生产培养基中，接入量为一支斜面试管中的所有菌落，培养3～7天复壮完成。本发明改善了蝙蝠蛾被毛孢发酵过程中生长速度慢、产量低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的复壮方法，具体涉及一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法。
背景技术
冬虫夏草是鳞翅目蝙蝠蛾属的虫草蝙蝠蛾(H epialus armoricamus Oberthur)幼虫感染蝙蝠蛾被毛孢真菌后，在体内大量繁殖形成的虫菌复合体。冬虫夏草在生物分类学上属于子囊菌门、肉座菌目、线虫草科线虫草属。冬虫夏草系我国特产珍稀名贵中药材。冬虫夏草的用药历史始载于《本草纲目拾遗》，称其具有“补肺益肾、止血化痰之功效”。近代药理和临床研究表明，冬虫夏草对调节机体免疫功能、治疗慢性肾炎、支气管炎等多种疾病有显著疗效，具有广阔的市场前景。
冬虫夏草为冬虫夏草菌寄生于蝙蝠蛾属昆虫体内形成的菌虫复合体，冬虫夏草的主要活性成分源于冬虫夏草菌的代谢产物。现代药物化学与药理学研究表明冬虫夏草菌丝体与天然冬虫夏草具有相近的化学成分，具有相似的药理作用。因此，用冬虫夏草菌丝体代替天然冬虫夏草，不仅可以缓解野生冬虫夏草资源的压力，还可以满足人们对冬虫夏草健康保障功能的需求。
而现有技术如中国专利CN102283022A公开的冬虫夏草菌无性阶段菌种分离的方法，该专利从感染中国被毛孢的蝙蝠蛾幼虫活体的体液中分离中国被毛孢无性阶段菌种的方法；其缺点是收集中国被毛孢感染的蝙蝠蛾幼虫难度大，时间长，分离的菌种必须通过驯化、复壮后才能用于大规模生产，周期长。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法，通过该方法复壮后的蝙蝠蛾被毛孢能快速在固体培养基上生长。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法，包括以下步骤：
(1)取当年分离的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入PDA培养基，接入2～3mm大小的菌块1～3个，在15～20℃下培养至菌落表面产生气生菌丝，备用；
(2)取禽蛋，去壳，置于灭菌后的容器，加入1～2％的抗生素溶液混合均匀，每500ml分装，装入量不超过容器体积的1/3，备用；
(3)取步骤(1)得到的蝙蝠蛾被毛孢菌种1～3g接入到步骤(2)的培养液中，在温度为18～20℃，转速为60～180r/min条件下培养3～10d，置于15～20℃下静置培养8～15天，至培养基表面长满白色絮状气生菌丝为止，备用；
(4)将步骤(3)中得到的蝙蝠蛾被毛孢菌接入PDA斜面培养基中，菌种接入量为1～3mm大小菌块1～5个，在8～12℃下静置培养3～7d至菌丝长满试管备用；
(5)将步骤(4)中的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入种子培养基中，接入量为一支斜面试管中的所有菌落，培养时间为3～7d，复壮完成。
进一步地，所述步骤(2)中禽蛋的处理方法为禽蛋在2％～3％浓度的84消毒液中浸泡30～35min，取出放入75％乙醇溶液中浸泡20～30min，去除外壳。
进一步地，所述禽蛋为鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋、鹅蛋中的任意一种。
进一步地，所述步骤(2)中的抗生素溶液为硫酸庆大霉素、乳酸环丙沙星、诺氟沙星、链霉素中的任意一种或多种的组合物。
进一步地，所述步骤(5)中的种子培养基中小米和水的质量比为1:1.2。
现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)材料容易得到，成本低；
(2)改善了蝙蝠蛾被毛孢发酵过程中生长速度慢、产量低的问题；
(3)菌种生长旺盛，培养基简单，复壮后的蝙蝠蛾被毛孢能快速在固体培养基上生长。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例进一步阐述本发明。
本发明提供一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法，具体包括以下步骤：
步骤一：取当年分离的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入PDA斜面培养基的试管中，接入2～3mm大小菌块1～3个，在15～20℃下培养至菌落表面长出气生菌丝为止，培养时间见表1，备用；
步骤二：取禽蛋，在2％～3％浓度的84消毒液中浸泡30分钟，取出放入75％乙醇溶液中浸泡20分钟，去除外壳，置于灭菌后的容器，加入1～2％的抗生素溶液混合均匀，分装入500ml培养器皿中，装入量不超过容器体积的1/3，备用；
步骤三：将步骤一中备用的蝙蝠蛾被毛孢菌种在无菌环境中接入装有步骤二培养液的培养器皿中，在18～20℃，转速60～180r/min下培养3～10d，置于15～20℃培养箱静置培养，培养8～15d，接种量为1～3g，培养基表面长满气生菌丝，肉眼观察其形态为白色絮状菌丝为止，备用；
步骤四：将步骤三中的蝙蝠蛾被毛孢菌接入装有PDA斜面培养基的试管中，接入1～3mm大小菌块1～5个，在8～12℃培养箱静置培养3～7d，蝙蝠蛾被毛孢菌白色气生菌丝长满试管，备用；
步骤五：将步骤四中的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入种子生产培养基中，接入量为一支斜面试管中的所有菌落，培养时间为3～7d，培养7天内的生长状况见表2，复壮完成，菌种即可用于规模化生产；
表1不同培养基培养天数
本发明的另一特点是步骤一、步骤三、步骤四中所述的蝙蝠蛾被毛孢菌培养基按含蛋白质高低,所用培养基的顺序为低蛋白培养基、高蛋白培养基、低蛋白培养基。步骤一PDA低蛋白培养基以表面接种菌落表面长出气生菌丝为培养终点。步骤三禽蛋高蛋白培养基以培养基表面全部长出白色气生菌丝为终点。步骤四PDA低蛋白培养基以斜面试管培养基表面全部长满气生菌丝为终点。
表2分离蝙蝠蛾被毛孢菌种与复壮后蝙蝠蛾被毛孢菌种在生产培养基上接种后的生长状况
实施例1
本实施例提供一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法，包括以下步骤：
步骤一：取当年分离的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入PDA培养基，接入量为2～3mm大小的菌块1个，在15℃下培养至菌落表面产生气生菌丝备用；
步骤二：取禽蛋在2％～3％浓度的84消毒液中浸泡30min，取出放入75％乙醇溶液中浸泡20min，去除外壳，置于灭菌后的容器，加入1％的抗生素溶液混合均匀，分装入500ml培养器皿中，装入量不超过容器体积的1/3，备用；
步骤三：取步骤一中备用的蝙蝠蛾被毛孢菌种3g在无菌环境中接入步骤二加入培养液的培养器皿中，在18℃，转速60r/min摇床培养10d，置于15℃培养箱静置培养，在培养基表面长满气生菌丝为止，备用；
步骤四：将步骤三中的蝙蝠蛾被毛孢菌接入装有PDA斜面培养基的试管中，菌种接入量为1mm菌块5个，在8℃培养箱静置培养7d，蝙蝠蛾被毛孢菌白色气生菌丝长满试管；
步骤五：将步骤四中的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入种子生产培养基中，接入量为一支斜面试管中的所有菌落，培养7d，复壮完成，菌种即可用于规模化生产。
实施例2
本实施例提供一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法，包括以下步骤：
步骤一：取当年分离的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入PDA培养基，接入量为2～3mm大小的菌块2个，在20℃下培养至菌落表面产生气生菌丝备用；
步骤二：取禽蛋在2％～3％浓度的84消毒液中浸泡30min，取出放入75％乙醇溶液中浸泡25min，去除外壳，置于灭菌后的容器，加入1％的抗生素溶液混合均匀，分装入500ml培养器皿中，装入量不超过容器体积的1/3，备用；
步骤三：取步骤一中备用的蝙蝠蛾被毛孢菌种3g在无菌环境中接入步骤二加入培养液的培养器皿中，在20℃，转速180r/min摇床培养6d，置于15℃培养箱静置培养，在培养基表面长满气生菌丝为止，备用；
步骤四：将步骤三中的蝙蝠蛾被毛孢菌接入装有PDA斜面培养基的试管中，菌种接入量为2mm菌块3个，在12℃培养箱静置培养3d，蝙蝠蛾被毛孢菌白色气生菌丝长满试管；
步骤五：将步骤四中的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入种子生产培养基中，接入量为一支斜面试管中的所有菌落，培养7d，复壮完成，菌种即可用于规模化生产。
实施例3
本实施例提供一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法，包括以下步骤：
步骤一：取当年分离的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入PDA培养基，接入量为2～3mm大小的菌块2个，在20℃下培养至菌落表面产生气生菌丝备用；
步骤二：取禽蛋在2％～3％浓度的84消毒液中浸泡35min，取出放入75％乙醇溶液中浸泡20min，去除外壳，置于灭菌后的容器，加入1％的抗生素溶液混合均匀，分装入500ml培养器皿中，装入量不超过容器体积的1/3，备用；
步骤三：取步骤一中备用的蝙蝠蛾被毛孢菌种3g在无菌环境中接入步骤二加入培养液的培养器皿中，在19℃，转速100r/min摇床培养7d，置于17℃培养箱静置培养，在培养基表面长满气生菌丝为止，备用；
步骤四：将步骤三中的蝙蝠蛾被毛孢菌接入装有PDA斜面培养基的试管中，菌种接入量为2mm菌块3个，在8℃培养箱静置培养6d，蝙蝠蛾被毛孢菌白色气生菌丝长满试管；
步骤五：将步骤四中的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入种子生产培养基中，接入量为一支斜面试管中的所有菌落，培养7d，复壮完成，菌种即可用于规模化生产。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (5)
1.一种蝙蝠蛾被毛孢真菌的复壮方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取当年分离的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入PDA培养基，接入量为2～3mm大小菌块1～3个，在15～20℃下培养至菌落表面产生气生菌丝，备用；
(2)取禽蛋，去壳，置于灭菌后的容器，加入1～2％的抗生素溶液混合均匀，每500ml分装，装入量不超过容器体积的1/3，备用；
(3)取步骤(1)得到的蝙蝠蛾被毛孢菌种1～3g接入到步骤(2)的培养液中，在温度为18～20℃，转速为60～180r/min条件下培养3～10d，置于15～20℃下静置培养8～15d，至培养基表面长满白色絮状气生菌丝为止，备用；
(4)将步骤(3)中得到的蝙蝠蛾被毛孢菌接入PDA斜面培养基中，菌种接入量为1～3mm大小菌块1～5个，在8～12℃下静置培养3～7d至菌丝长满试管备用；
(5)将步骤(4)中的蝙蝠蛾被毛孢菌种接入种子培养基中，接入量为一支斜面试管中的所有菌落，培养时间为3～7d，复壮完成。
2.根据权利要求1所述的一种蝙蝠蛾被毛孢菌种的复壮方法，其特征在于：所述步骤(2)中禽蛋的处理方法为禽蛋在2％～3％浓度的84消毒液中浸泡30～35min，取出放入75％乙醇溶液中浸泡20～30min，去除外壳。
3.根据权利要求1所述的一种蝙蝠蛾被毛孢菌种的复壮方法，其特征在于：所述禽蛋为鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋、鹅蛋中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种蝙蝠蛾被毛孢菌种的复壮方法，其特征在于：所述步骤(2)中的抗生素溶液为硫酸庆大霉素、乳酸环丙沙星、诺氟沙星、链霉素中的任意一种或多种的组合物。
5.根据权利要求1所述的一种蝙蝠蛾被毛孢菌种的复壮方法，其特征在于：所述种子培养基中小米和水的质量比为1:1.2。
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