CN116948986A - 一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体vap230304及其应用 - Google Patents
一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体vap230304及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116948986A CN116948986A CN202311071470.2A CN202311071470A CN116948986A CN 116948986 A CN116948986 A CN 116948986A CN 202311071470 A CN202311071470 A CN 202311071470A CN 116948986 A CN116948986 A CN 116948986A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phage
- vibrio
- vap230304
- vibrio alginolyticus
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000607594 Vibrio alginolyticus Species 0.000 title claims abstract description 54
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 27
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 claims description 6
- 241000607618 Vibrio harveyi Species 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005336 cracking Methods 0.000 abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 14
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 abstract description 9
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 abstract description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 9
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 abstract description 6
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 3
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 6
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007827 osmolarity assay Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241000607291 Vibrio fluvialis Species 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 description 1
- 230000002353 algacidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/00032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于水产养殖业微生物技术应用领域，公开了一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体VAP230304及其应用，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC M 20231412。该溶藻弧菌噬菌体VAP230304应用于水产养殖多种细菌的生物控制过程中，具有裂解谱广、细菌抗性低、耐盐性强、杀菌效率高，不易让细菌产生耐药性的优势，对水产中占比大的弧菌及嗜水气单胞菌的预防和杀灭具有巨大应用潜力，同时具有优秀的杀菌效率和抑菌表现。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖业微生物技术应用领域，具体涉及一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体VAP230304及其应用。
背景技术
噬菌体是地球上数量最多的生物，它们与细菌有着特异性的相互作用，并在细菌裂解后释放后代。噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，烈性噬菌体可以感染和裂解宿主细菌，具有特异性强、自我增殖快的特点。但由于噬菌体与细菌相互作用产生共同进化，针对噬菌体的感染进化出多种抗感染机制，即产生抗噬菌体致病菌，进而限制了噬菌体疗法的应用，因此寻找或改造噬菌体使其不易让细菌产生耐受十分有必要。
申请CN202310039349.5公开了一种溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25及其应用，该噬菌体具有裂解谱广、杀菌效率高的优势，对水产养殖中溶藻弧菌的预防和杀灭具有巨大应用潜力，同时具有优秀的杀菌效率和抑菌表现，抑菌作用时间长。
申请CN202210332738.2公开了一株高效裂解溶藻弧菌噬菌体PVA23及其用途，该噬菌体具有效价高、裂解率高、增殖力强、潜伏期短、爆发量大的特点，且安全性高、环境友好，并具有良好的温度和酸碱耐受能力，能适应更严苛的应用环境，且其感染复数极低，能够快速有效地杀灭溶藻弧菌，预防溶藻弧菌病害，尤其能够快速有效抑制人工养殖对虾养殖池中溶藻弧菌的生长，在水产养殖及其他环境中的溶藻弧菌防控方面具有重要的应用价值。
申请CN202210332740.X公开了一株具有宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体PVA8及其用途，该噬菌体具有效价高、裂解谱宽、增殖力强、爆发量大的特点，能裂解溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌以及河流弧菌等多种致病性弧菌，并对溶藻弧菌具有极低的感染复数，能够有效抑制弧菌的生长，能够作为生物抗菌剂应用于防控水产养殖中弧菌的污染。
尽管现有的溶藻噬菌体裂解谱较广、杀菌效率较高，但由于其细菌可能会产生抗性，导致其无法高效且持久抑菌，而本发明中VAP230304噬菌体的细菌抗性低、杀菌效率高，具有不易让细菌产生耐药性的优势，且对水产中占比大的弧菌及嗜水气单胞菌均有杀灭作用，因此具有巨大应用潜力。
发明内容
本发明目的是提供一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体(Vibrioalginolyticu phage)VAP230304，所述噬菌体的保藏编号为：CCTCC NO:M20231412。
本发明的另一个目的在于提供溶藻弧菌噬菌体VAP230304在水产细菌裂解中的应用。为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
申请人在江苏南通某水产养殖水塘，分离出一株溶藻弧菌噬菌体VAP230304，所述噬菌体在2023年8月10日保藏至中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M20231412，分类命名：Vibrio alginolyticu phage VAP230304。
本发明的保护范围还包括：溶藻弧菌噬菌体VAP230304在制备水产细菌裂解剂中的应用。
以上所述的应用中，优选的，所述的水产细菌包括：水产弧菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和/或变形杆菌(Proteus)；
以上所述的应用中，优选的，所述的水产弧菌包括：溶藻弧菌(Vibrioalgimolyticus)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，哈维氏弧菌(Vibrioharveyia)和/或鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。
与现有技术相比，本发明具有以下效果：
1)噬菌体VAP230304裂解谱广，具有多价性：对224株溶藻弧菌中213株具有裂解效果，裂解率达95.1％；对138株副溶血弧菌中93株具有裂解效果，裂解率达67.4％；对72株哈维氏弧菌中48株具有裂解效果，裂解率达66.7％；对82株嗜水气单胞菌中54株有效，解裂解率达65.9％；对64株变形杆菌中31株有效，解裂解率达48.4％；对86株鳗弧菌中17株有效，裂解率达19.8％，对水产中占比大的多种致病菌均有效果。
2)噬菌体VAP230304具有高发酵率，在最佳感染复数MOI＝0.001时，发酵6h，效价可达2.5×1011PFU/mL，为工业发酵提供了理论基础。
3)噬菌体VAP230304不易让细菌产生耐药性，对宿主菌进行测试，噬菌体VAP230304不敏感突变频率仅为3.2‰。
4)溶藻弧菌噬菌体VAP230304环境耐受性好：在pH为5-9范围内处理2h其效价无明显变化，在pH为4、10范围内处理2h其效价略有变化；在温度为60℃以下较易存活，在40℃以下处理1h效价不受影响；在盐浓度是1.5％-3.5％范围内，噬菌体均可保持较高的活性，且当盐浓度是2.5％时，噬菌体效价达到最大，为4.7×109PFU/mL，随后随着盐浓度增加噬菌体浓度稍有下降，盐浓度高于3.5％时噬菌体浓度迅速下降。
附图说明
图1为溶藻弧菌噬菌体VAP230304的噬菌斑图。
图2为噬菌体VAP230304的宿主谱及裂解率图。
图3为溶藻弧菌噬菌体VAP230304的pH值稳定性示意图。
图4为本发明一种溶藻弧菌噬菌体VAP230304于不同温度的稳定性示意图。
图5噬菌体渗透压稳定性测定。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
溶藻弧菌噬菌体VAP230304的分离纯化
在江苏南通某水产养殖水塘采集水样10份，每份50mL，6000rpm离心10min，取上清，并用0.22um滤器除菌，取5mL处理后上清液与0.5mL溶藻弧菌(浓度为5×108CFU/mL左右)混合均匀，放置于37℃培养箱中150rpm振荡发酵培养过夜；取发酵后液体6000rpm离心10min，取上清，并用0.22um滤器除菌，得种子滤液，取滤液100uL与300uL溶藻弧菌(浓度为5×108CFU/mL左右)混合均匀，将混合物与2％氯化钠TSB半固体(含0.65％琼脂)混合均匀，浇筑在2％氯化钠TSA底板上，待凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中培养过夜。记录培养皿噬菌体的效价，在培养皿上挑取噬菌斑透而亮的斑点，于1mLSM液中振荡解吸附后过0.22um的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL2％氯化钠TSB液体培养基中，加入100uL相应的宿主溶藻弧菌菌液并混匀，静止吸附15min，37℃下150rpm过夜培养，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
所分得溶藻弧菌噬菌体VAP230304与宿主菌形成的噬菌斑透亮、圆形、直径为1mm(图1)。该噬菌体VAP230304已于2023年8月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Vibrio alginolyticus phage VAP230304，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M20231412.
实施例2：
溶藻弧菌噬菌体VAP230304对水产致病菌裂解范围实验
采用双层点滴法来测定噬菌体的裂解谱。准备好足量的盛有3mL的2％氯化钠TSB的EP管，取224株溶藻弧菌、138株副溶血弧菌、72株哈维氏弧菌、82株嗜水气单胞菌、64株变形杆菌、86株鳗弧菌，37℃恒温200rpm振荡8h，得到纯净菌液；准备好足量的TSA底板，将0.9ml菌液与50℃左右6ml的2％氯化钠TSB半固体培养基(含0.65％琼脂)混合均匀，缓慢平铺于TSA底板之上；平板培养基凝固至常温后，取溶藻弧菌噬菌体VAP230304溶液(效价1×109PFU/mL)5uL滴于双层板中心，等溶液自然风干后，放置于37℃恒温生化培养箱中培养8h左右，观察结果。每组实验重复3次。
结果如图2所示，溶藻弧菌噬菌体VAP230304具有高裂解率，对224株溶藻弧菌中213株具有裂解效果，裂解率达95.1％，对138株副溶血弧菌中93株具有裂解效果，裂解率达67.4％，对72株哈维氏弧菌中48株具有裂解效果，裂解率达66.7％，对82株嗜水气单胞菌中54株有效，解裂解率达65.9％，对64株变形杆菌中31株有效，解裂解率达48.4％，对86株鳗弧菌中17株有效，裂解率达19.8％，说明溶藻弧菌噬菌体VAP230304裂解谱很宽且裂解率高，在水产养殖中针对多种致病菌的预防和杀灭，具有巨大应用潜力。
实施例3：溶藻弧菌噬菌体VAP230304最佳感染复数测定
准备溶藻弧菌噬菌体VAP230304的宿主菌溶藻弧菌GVA1(申请号202210107498.6)，准备好装有3mL 2％氯化钠TSB的EP管，挑取溶藻弧菌GVA1单菌落接种于培养基中，在37℃条件下振荡培养8h，得到宿主菌菌液。按接种量1％接种菌液至100mL TSB培养基中，待溶藻弧菌生长至对数初始期时(浓度1×108CFU/mL)，随后将溶藻弧菌噬菌体VAP230304接种于该培养基中，按照不同的感染复数(multiplicity of infection，MOI；MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，每组实验3个平行。在37℃摇床中150rpm振荡培养12h。12h后结束培养，取出部分培养液进行6000rpm离心l0min收集上清，测定噬菌体效价。
实验结果如下表1所示，MOI＝0.001时，效价可达2.5×1011PFU/mL，对工业发酵提供了理论基础。
表1噬菌体VAP230304最佳感染复数
| 噬菌体浓度(PFU/mL) | 宿主菌浓度(CFU/mL) | 感染复数 | 效价(PFU/mL) |
| 1.0×109 | 1.0×108 | 10 | 6.1×109 |
| 1.0×108 | 1.0×108 | 1 | 7.5×109 |
| 1.0×107 | 1.0×108 | 0.1 | 4.8×109 |
| 1.0×106 | 1.0×108 | 0.01 | 5.9×1010 |
| 1.0×105 | 1.0×108 | 0.001 | 2.5×1011 |
| 1.0×104 | 1.0×108 | 0.0001 | 3.7×1010 |
实施例4：溶藻弧菌噬菌体VAP230304的pH稳定性试验
取无菌细菌瓶分别加入不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)的2％氯化钠TSB培养基9mL后将上述细菌瓶置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lmL噬菌体纯培养液(起始效价：5×109PFU/mL)，于25℃环境中静置120min。处理结束后取样品做适当稀释采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
结果如图3所示，溶藻弧菌噬菌体VAP230304在pH为5-9范围内处理2h其效价无明显变化，在pH为4、10范围内处理2h其效价略有变化。
实施例5：溶藻弧菌噬菌体VAP230304的温度稳定性试验
取若干支无菌50mL离心管，各加入45mL TSB后置于相应温度的恒温水浴中，待温度平衡后分别加入5mL噬菌体纯培养液(起始效价：6.5×1010PFU/mL)，于40℃、50℃、60℃、70℃的温度中作用20min、40min、60min。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
结果如图4所示，实验组中溶藻弧菌噬菌体VAP230304在温度为60℃以下较易存活，在40℃以下处理1h效价不受影响。
实施例6：噬菌体VAP230304渗透压稳定性测定
分别配制含0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％和4.5％NaCl的肉汤培养基，取不同盐度培养基9mL后置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lmL噬菌体纯培养液(起始效价：5×1010PFU/mL)，于25℃环境中静置120min。作用结束后用双层平板法进行效价测定。
溶藻弧菌是嗜盐性微生物，其噬菌体对盐浓度的耐受性至关重要，测定噬菌体VAP230304在盐浓度处于1.0％～4.0％范围时的噬菌斑数量较及活性。结果如图5所示(在图5的横坐标中，数值处于两个刻度的中间)，可见盐浓度的进一步增加，导致噬菌斑逐步增加。当盐浓度是2.5％时，噬菌体效价达到最大，为4.7×109PFU/mL，随后随着盐浓度增加噬菌体浓度稍有下降，盐浓度高于3.5％时噬菌体浓度迅速下降。
实施例7：噬菌体VAP230304不敏感突变频率测定
取100uL噬菌体VAP230304和噬菌体GVA-P21(申请号202210107498.6)(1×108PFU/mL)分别与新鲜培养的对数期宿主菌GVA1稀释液(1×105CFU/mL)混匀，37℃水浴15min后稀释涂布TCBS平板。以PBS缓冲液代替噬菌体增殖液为空白对照，同样方法处理后稀释，取100uL涂布TCBS平板。37℃培养12h，统计TCBS平板上的菌落数。理论上，由于噬菌体的数量远大于宿主菌株，平板上应该没有菌落生长；如果出现了菌落，有两种可能：1.宿主菌发生了抗性突变，噬菌体对其不起裂解作用；2.宿主菌与噬菌体没有接触或者没有接触至足够时间导致其没有被裂解。
进一步的，挑取平板上的所有菌落分别接种于2216E液体培养基试管，37℃、180rpm培养6h，点斑法测定各菌落培养物对噬菌体的敏感性，统计不被裂解的菌落数，此时不被裂解的菌落数即为发生了抗性突变的菌株。
结果如下表所示，噬菌体VAP230304不敏感突变频率为3.2‰，噬菌体GVA-P21不敏感突变频率为2.26％，比噬菌体VAP230304的不敏感突变频率高7倍。说明噬菌体VAP230304的不敏感突变频率极低，不易导致宿主细菌发生抗性突变，适用于临床的应用。
表2噬菌体VAP230304的不敏感突变频率测定
实施例8：溶藻弧菌噬菌体VAP230304的发酵制备
从宿主菌溶藻弧菌GVA1平板上挑取单菌落，接种于3mL的2％氯化钠TSB培养基中，在37℃下150rpm培养8h，得到宿主菌液。将菌悬液以1％接种量接种于100mL的2％氯化钠TSB培养基中，在37℃下150rpm培养至对数期前期。发酵体系为6L，发酵培养基为普通TSB培养基，初始PH值为7.0；采用火焰法按1％接种量接种溶藻弧菌，以最佳感染复数MOI＝0.001向发酵体系加入噬菌体，接入噬菌体后需静止吸附15min，发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml发酵液于无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液过0.22um的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，5000rpm离心15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。
结果如表3所示，溶藻弧菌噬菌体VAP230304在发酵6h，效价可达4.5×1011PFU/mL，在6h至12h时间段，效价稳定在1011PFU/ml；因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。
表3噬菌体VAP230304的发酵动态
Claims (4)
1. 一株分离的溶藻弧菌噬菌体（Vibrio alginolyticu phage）VAP230304，所述噬菌体的保藏编号为：CCTCC NO:M20231412。
2.权利要求1所述的噬菌体在制备水产细菌裂解剂中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，所述的水产细菌为：水产弧菌、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和/或变形杆菌（Proteus）。
4. 根据权利要求3所述的应用，所述的水产弧菌为：溶藻弧菌（Vibrio algimolyticus），副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），哈维氏弧菌（Vibrio harveyia）和/或鳗弧菌（Vibrio anguillarum）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311071470.2A CN116948986A (zh) | 2023-08-22 | 2023-08-22 | 一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体vap230304及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311071470.2A CN116948986A (zh) | 2023-08-22 | 2023-08-22 | 一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体vap230304及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116948986A true CN116948986A (zh) | 2023-10-27 |
Family
ID=88454774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311071470.2A Pending CN116948986A (zh) | 2023-08-22 | 2023-08-22 | 一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体vap230304及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116948986A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118028248A (zh) * | 2024-02-01 | 2024-05-14 | 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 | 一株高裂解性哈维氏弧菌噬菌体及其应用 |
| CN118222518A (zh) * | 2024-03-22 | 2024-06-21 | 武汉格瑞农生物科技有限公司 | 一株具备多价性及高发酵率的豚鼠气单胞菌噬菌体及其应用 |
-
2023
- 2023-08-22 CN CN202311071470.2A patent/CN116948986A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118028248A (zh) * | 2024-02-01 | 2024-05-14 | 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 | 一株高裂解性哈维氏弧菌噬菌体及其应用 |
| CN118028248B (zh) * | 2024-02-01 | 2024-10-18 | 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 | 一株高裂解性哈维氏弧菌噬菌体及其应用 |
| CN118222518A (zh) * | 2024-03-22 | 2024-06-21 | 武汉格瑞农生物科技有限公司 | 一株具备多价性及高发酵率的豚鼠气单胞菌噬菌体及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107686832B (zh) | 新的副溶血性弧菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用 | |
| CN116948986A (zh) | 一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体vap230304及其应用 | |
| CN109749966A (zh) | 一株假交替单胞菌及其作为益生菌在水产上的应用 | |
| CN109735471B (zh) | 一株微小杆菌及其作为益生菌在水产上的应用 | |
| CN112501090B (zh) | 一株地衣芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114921420B (zh) | 一种鸭疫里氏杆菌噬菌体 | |
| CN114437964B (zh) | 一株贝莱斯株芽孢杆菌及其应用 | |
| CN113293143B (zh) | 一株可降低鸡白痢沙门氏菌垂直传播的沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| Miyamoto et al. | Lethal Effect of Fresh Sea Water on Vibrio parahaemolyticus and Isolation of Bdellovibrio Parasitic against | |
| CN117070471A (zh) | 一株可口服进入血液的多价沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN118086224A (zh) | 一种具有裂解谱多价性的副溶血弧菌噬菌体及其在海参养殖的应用 | |
| CN117070472A (zh) | 一株针对高致病性弧菌及耐药弧菌的副溶血弧菌噬菌体及应用 | |
| CN116042541A (zh) | 一种溶藻弧菌噬菌体grnrz-p25及其应用 | |
| CN117187126A (zh) | 一种大肠杆菌噬菌体jnuw3的分离以及抗jnuw3噬菌体大肠杆菌的开发 | |
| CN117126778A (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN116574624B (zh) | 具有溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法及其应用 | |
| CN114703149A (zh) | 一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体gva-p21及其应用 | |
| CN104845940B (zh) | 沙门氏菌噬菌体制剂及其制备方法 | |
| CN114921419B (zh) | 一种鸭疫里氏杆菌噬菌体 | |
| CN118147090B (zh) | 一株同时裂解多株大肠杆菌和沙门氏菌的噬菌体及其应用 | |
| CN114958778B (zh) | 一株副溶血弧菌裂解性噬菌体gvp-p20及其在中华绒螯蟹中副溶血弧菌的防治应用 | |
| CN110408573A (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌yfi-6及其在抗大鲵虹彩病毒中的应用 | |
| CN113583894B (zh) | 花鲈致病性哈维弧菌菌株及其灭活疫苗 | |
| CN115418355B (zh) | 一种迟缓葡萄球菌噬菌体及其分离方法与应用 | |
| CN115851617B (zh) | 一种大肠杆菌噬菌体lhe83及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |