CN109749966A - 一株假交替单胞菌及其作为益生菌在水产上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种假交替单胞菌及其作为益生菌在水产上的应用，属于菌种技术领域。一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp)20101015001株，所述菌株于2018年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.16067。该菌株对可引起对虾的急性肝胰腺坏死病的细菌具有拮抗作用；以携带有3种病原的对虾为对象，进行了该株菌的益生菌的应用效果评估，3种病原包括有白斑综合征病毒、可引起对虾急性肝胰腺坏死病原细菌，虾肝肠胞虫，结果发现本发明菌株添加饲料投喂对虾后，可显著提高对虾的成活率，并可提高生长率和单位水体产量，同时有降低饲料系数的效果。

Description

一株假交替单胞菌及其作为益生菌在水产上的应用

技术领域

本发明涉及一种假交替单胞菌及其作为益生菌在水产上的应用，属于菌种技术领域。

背景技术

假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)是Gaulthier等1995年报道的新海洋细菌属，其分类地位属变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、假交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)，是一类好氧异养型、不产芽胞、具有鞭毛的革兰氏阴性细菌。该属有别于假单胞菌属(Pseudomonassp.)和交替单胞菌属(Alteromonas sp.)，目前鉴定到种的有南极洲假交替单胞菌(P.antarctica)、柠檬假交替单胞菌(P.citrea)、杀鱼假交替单胞菌(P.piscicida)和河豚毒素假交替单胞菌(P.tetraodonis)等30多种。

假交替单胞菌目前均分离自海洋环境中，如海水、海冰、海洋沉积物环境，以及甲壳动物、海鞘、海绵、无脊椎动物幼虫和藻类等。该属细菌在水产养殖中多有为致病菌的报道。有研究报道表明，假交替单胞菌也与条斑紫菜(Porphyrae yezoensis)绿斑病、条斑紫菜丝状体黄斑病相关(闫咏等，2002；王洪斌等，2011)；王印庚等(2006)报道了假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)是刺参(Apostichopus japonicus)“腐皮综合征”的致病菌；乔迁等(2010)从发病七带石斑鱼(Epinephelus septemfasciatus)分离出具有致病性的Pseudoaheromonas sp.BY0081株，该病原在较低的温度下仍有较强的毒力，也可感染淡水剑尾鱼(Xiphophorus helleri)；白雪松等(2013)从发病日本对虾(Penaeusjaponicas)蚤状幼体分离的Pseudoalteromonas sp.XS-1株，可引起日本对虾蚤状幼体及仔虾的死亡；乔毅等(2015)报道了Pseudoalteromonas sp.LSHD-Ⅰ株可引起黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)皮肤溃烂病。但也有研究发现，该属细菌也能够分泌多种胞外的生物活性和酶活性物质，具有抗细菌、抗真菌和溶藻等活性(Bowman，2007；黄姿等，2008；Chen et al，2010；Holmstromet al，1998；Lucas-Elioet al，2005)。Rodrigues等(2015)报道了Pseudoalteromonas sp.3J6株对可引起马尼拉蛤(Ruditapes philippinarum)褐色边缘病(Brown Ring Disease,BRD)的Vibrio tapetis具有一定的抑制作用。

近年来，水产病害已对水产养殖的健康可持续发展构成严重威胁，开发针对水产病原的有效防控方法的应用研究，是水产业健康可持续发展的迫切要求。以虾类养殖业为例，已知的虾类疫病多达10种，且近年呈现多病原感染的趋势。其中上个世纪90年代报道的白斑综合症(White Spot Syndrome，WSS)，以及近些年来相继发现的肝胰腺微孢子虫病(Hepatopancreatic microsporidiosis，HPM)和急性肝胰腺坏死病(AcuteHepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND)的3种疫病，分别是当前虾类产业中重要的病毒病、寄生虫病和细菌病，其病原分别是由白斑综合症病毒(White spot syndromevirus，WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)和携带着编码毒力蛋白Pir^VP的质粒的细菌所引起的。该3种病原也是当前我国虾类疫病中有着很高阳性检出率及危害的重要病原，据《2016年中国水生动物卫生状况报告》报道，2016年我国开展的白斑综合症的主动监测范围包括天津等12个省(自治区、直辖市)，661个监测养殖场点的平均阳性养殖场点检出率为16.2％，997批次样品的平均阳性样品检出率为12.9％。而被动监测中，507批次样品中的虾肝肠胞虫阳性率为30.9％，501批次的急性肝胰腺坏死性病的阳性率为22.5％。

益生菌(Probiotics)作为活体微生物制剂，具有促进营养物质的消化吸收而促生长，其本身也可作为营养物质而被机体吸收；分泌拮抗物质或争夺生态位抑制有害微生物而优化菌群结构；激发机体的非特异性免疫提高抗病力，其在水产养殖中的应用也为水产病害的防控提供了一种方法。我们在2010年10月，从健康大菱鲆肠道中分离鉴定到一株假交替单胞菌20101015001株，其保藏编号为：CGMCC No.16067。人工感染实验结果表明，该菌株对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)没有致病作用；该菌株具有胞外蛋白酶活性，抑菌实验结果表明，该菌株对可引起对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌具有拮抗作用。该菌株添加到对虾饲料中，投喂携带有致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌、白斑综合症病毒、虾肝肠胞虫的凡纳滨对虾幼虾60天后，可不同程度提高实验对虾血清蛋白浓度，以及超氧化物歧化酶活力、过氧化物酶活力、溶菌酶和酸性磷酸酶活力等免疫酶活性，成活率、生长率和单位水体产量也较对照组有显著提高，并可有效降低饲料系数。上述结果说明本发明菌株可提高水生动物的抗病力和生长性能，具有水产益生菌的开发应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一株假交替单胞菌及其作为益生菌在水产上的应用。

一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp)，菌株的分类命名为：假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp)20101015001株；于2018年7月6号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；保藏编号为：CGMCC No.16067；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp)20101015001株于2010年分离自一尾健康大菱鲆(Scophthalmus maximus)肠道中，经证实该菌株不具有致病性，凡纳滨对虾在浓度为1.0×10⁸CFU/ml的该菌株中浸泡72h后也是安全的。

所述假交替单胞菌20101015001株，可培养于2216E海水培养基，培养方法如下：从-80℃保存的菌种中挑取少量接种于液体培养基或固体平板，培养温度范围为20—37℃。其中液体培养中，180r/min摇瓶培养至OD₆₀₀为0.5—0.6，即可获得该菌株的新鲜菌液。

所述假交替单胞菌20101015001株的16s rRNA和弧菌溶血素基因的碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，这些基因具有该菌株的特征性。

所述假交替单胞菌20101015001株可产生胞外蛋白活性物质，具有胞外蛋白酶活性。

所述假交替单胞菌20101015001株，以及该菌株的各类产物和/或其产物的改造物，对对虾类不具有致病性，对可引起致急性肝胰腺坏死病的细菌具有拮抗作用。

所述的急性肝胰腺坏死病的细菌为携带具有编码PirA和/或PirB毒素的基因的质粒的弧菌属细菌。如已报道的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，坎贝氏弧菌(V.campbellii)和欧文氏弧菌(V.owensii)等，也可以是其他尚未发现和报道的携带具有编码PirA和/或PirB毒素的基因的细菌。

所述假交替单胞菌20101015001株，以及该菌株的各类产物和/或其产物的改造物，对水生动物的病毒和细菌病原具有抗病作用。所述的水生动物病毒和细菌病原为白斑综合征病毒(WSSV)、虾血细胞虹彩病毒(Shrimp Hemocyte Iridescent Virus,SHIV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic NecrosisVirus,IHHNV)、偷死野田村病毒病(Covert Mortality Nodavirus，CMNV)、黄头病毒(Yellow Head Virus，YHV)、桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)等虾类病毒、神经坏死病毒(Nervous Necrosis Virus)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen andKidney Necrosis Virus,ISKNV)等鱼类病毒等所引起的病毒病，哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、坎贝氏弧菌(V.campbellii)、发光杆菌、爱德华氏菌(Edwardsiella)、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等引起的细菌病。

该菌株应中中，添加饲料后投喂对虾，可不同程度的提高携带多病原感染对虾的血清蛋白浓度、免疫酶活性和成活率，所述对虾的病毒、细菌、寄生虫病原可以是白斑综合征病毒、虾肝肠胞虫，以及可引起对虾急性肝胰腺坏死病的细菌，所述的免疫酶可以为氧化物歧化酶活力、过氧化物酶活力溶菌酶和酸性磷酸酶活力等，所述的对虾携带的病原也可以是虾类的其他病原的一种或多种；该菌株添加饲料中投喂对虾，可显著提高对虾的成活率、生长率并降低饲料系数。

一种如上述所述的假交替单胞菌CGMCC No.16067株作为水生动物益生菌的应用，所述菌株具有促进水生动物生长的作用。

所述假交替单胞菌20101015001株在应用中，可影响水生对物的肠道内定植的优势菌群种类，这种影响与提高对虾免疫力和生长性能相关。

假交替单胞菌20101015001株作为水生动物益生菌的应用，可采用注射、口服和浸泡的方式。注射可采用腹腔或肌肉注射两种方式，该方式下菌株使用的剂量为10⁴—10⁸CFU/g(菌落形成单位/鱼体体重)，注射1次后的14—30天也可进行2次注射；口服方式中，该菌株在配合饲料中的添加剂量为10⁴-10¹¹CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂14天及以上；浸泡方式中，该菌株在养殖水体中的浓度为10⁴-10⁹CFU/ml(菌落形成单位/浸泡水体体积)的浓度，浸泡时间60min及以上。

假交替单胞菌20101015001株作为水生动物益生菌的应用，所述的水生动物可以甲壳类、鱼类、两栖类和爬行类动物。不同的水生动物及其应用方式的不同，该菌株的应用剂量也有所不同，对于特定水生动物的在使用中的具体剂量，应该进行单独测试。

本发明的积极效果在于：本发明找到了1株水生动物的益生菌株，即假交替单胞菌20101015001株。经证实，该菌株对可引起对虾的急性肝胰腺坏死病的细菌具有拮抗作用；以携带有3种病原的对虾为对象，进行了该株菌的益生菌的应用效果评估，3种病原包括有2种致病原，即白斑综合征病毒和可引起对虾急性肝胰腺坏死病原细菌，以及1种可引起感染对虾生长停滞的虾肝肠胞虫，结果发现本发明菌株添加饲料投喂对虾后，可显著提高对虾的成活率，并可提高生长率和单位水体产量，同时有降低饲料系数的效果。这一结果，为包括虾类在内的水生动物的疫病防控提供了一种有效的保护途径，其使用可减少或消除由于水生动物病原发生所致的消毒剂、抗生素等化学药物的滥用，显著提高水产养殖动物及其产品的安全，以及病原菌抗药性增加所带来的生物安全风险。

附图说明

图1为假交替单胞菌20101015001的16SrRNA序列系统发育树。

图2为假交替单胞菌20101015001的弧菌溶血素基因序列系统发育树。

图3为假交替单胞菌20101015001对副溶血弧菌的抑菌效果图；

图4为假交替单胞菌20101015001的蛋白酶效果图；

具体实施方式

以下通过实施例，对本发明作进一步详细说明。所述假交替单胞菌20101015001株的保藏编号为CGMCC No.16067。

实施例1：20101015001株的分离、培养及保藏

细菌来源于2010年一尾健康大菱鲆肠道中，采用接种环蘸取肠组织，划线接种于添加2％琼脂的海水2216E培养基平板(酵母提取物1g，胰化蛋白胨5g，FePO4 0.1g，海水定容至1L，pH 7.6—7.8)，28℃培养24—48h，从平板上挑取优势菌落中的单菌落，再次划线上述的2216E固体培养基平板进行纯化培养。所获纯化的单克隆菌株命名为20101015001株。

本发明菌株也可在干酪素琼脂培养基(配制盐度约为16％的海水，每100mL该过滤海水中加入1.0g干酪素，0.3g牛肉浸膏，0.2g磷酸二氢钾，1.5g琼脂，调节pH至10.0)生长。

菌株保藏：将离心去上清的20101015001株重悬于含有8—20％甘油的新鲜海水2216E培养基中，并置于-80℃冰箱保存。

实施例2：基于20101015001株的16S rRNA基因的PCR扩增及其序列分析

(1)细菌DNA的制备：细菌样品DNA的制备采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)进行DNA提取。

(2)PCR扩增：采用细菌16S rRNA基因的通用引物(27F/1492R)进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：

上述的反应体系中的Premix Ex(Version 2.0)购自Takara生物工程有限公司。PCR扩增反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸8min，1个循环。所获DNA片段用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(OMEGA)进行纯化后，由生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序。

(3)系统发育学分析：考虑测序中，荧光染料的干扰可导致引物3'端后面的几十个碱基不一定能够准确判读的因素，实际序列比对中，对所获得的测序序列(1446bp)起始和末尾的约10—20bp碱基进行了去除，对剩下的1396bp碱基的序列(SEQ ID NO：1)在NCBI上进行同源性检索，并对其相关序列采用了Clustalx(1.83)软件进行多序列比对，进一步采用MEGA 7软件的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发生树，并进行1000次的Bootstraps重复检验，所获的系统进化树见图1。

由图1可见，20101015001株与假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp)的细菌聚类，与其中的Pseudoalteromonas tetraodonis BSi20588株(DQ520896.1)的相似度达到99％，根据上述信息学的分析结果，确定20101015001株为1株假交替单胞菌属细菌。

实施例3：基于假交替单胞菌20101015001株的弧菌溶血素(Vibriolysin)基因的PCR扩增及其序列分析

(1)细菌DNA的制备：同实施例2。

(2)PCR扩增：根据假交替单胞菌GFC株(GenBank：CP011042.1)的序列，设计用于扩增其弧菌溶血素(Vibriolysin)基因1285bp的引物如下：

Ps-t-F:5'CAATCAAACTCTGCTTCCT 3'

Ps-t-R:5'CTACACCCGCACTCCAATA 3'

PCR扩增反应体系参见实施例2。

PCR方法反应程序：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸5min，1个循环。所获PCR产物由生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序。

(3)系统发育学分析：考虑测序中，荧光染料的干扰可导致引物3'端后面的几十个碱基不一定能够准确判读的因素，实际序列比对中，对所获得的测序序列起始和末尾的约50bp碱基进行了去除，对剩下的1193bp碱基的序列(SEQ ID NO：2)在NCBI上进行同源性检索，并对其相关序列采用了Clustalx(1.83)软件进行多序列比对，进一步采用MEGA 7软件的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发生树，并进行1000次的Bootstraps重复检验，所获的系统进化树见图2。

由图2可见，基于弧菌溶血素基因系统进化分析的结果也进一步确定了20101015001株为假交替单胞菌属细菌。其中20101015001株与Pseudoalteromonasissachenkonii KMM 3549株(CP011031.1)和Pseudoalteromonas tetraodonis GFC株(CP011042.1)等菌株的相似度达到99％，与Pseudoalteromonas sp.SB-B1(AB457060.1)株的相似度达到92％。

实施例4：假交替单胞菌20101015001株对病原菌的拮抗实验

假交替单胞菌20101015001株的培养：将-80℃冰箱保存的该菌株，经在2216E平板上划线活化，挑取单菌落接种于2216E海水液体培养基，于28℃摇床振荡培养过夜，采用涂布平板计数法确定菌浓度约为10¹¹CFU/ml。

病原菌及培养：病原菌以可引起急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(VP-AHPND)20130629002S01株为例。首先将20130629002S01株接种在2216E液体培养基中，取100μl1.0×10⁷CFU/ml菌液涂布于新鲜的2216E固体培养基平板上。

拮抗实验：用无菌镊子夹取5片φ6mm的无菌滤纸片等距离放置在涂布在上述20130629002S01株的平板上，取8μl假交替单胞菌20101015001株的新鲜菌液滴于滤纸片上，28℃培养24h后，由图3观察到20101015001株对上述的VP-AHPND的20130629002S01具有拮抗作用，其抑菌圈直径为10—12mm。

本实施例的病原菌选择中，也可以为引起急性肝胰腺坏死的非副溶血弧菌的细菌，如坎贝氏弧菌(V.campbellii)和欧文氏弧菌(V.owensii)；或其他尚未报道的携带具有编码PirA和/或PirB毒素的基因的质粒的细菌；也可以是可引起其他细菌病的虾类病原细菌，如哈维氏弧菌(V.harveyi)、发光杆菌等；也可以是如爱德华氏菌(Edwardsiella sp.)、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)等鱼类病原菌。

实施例5：假交替单胞菌20101015001株蛋白酶活性检测

干酪素琼脂培养基配制：参考Dang等(2009)方法配制酪蛋白平板(成分见实施例1)，115℃，灭菌30min。

用无菌镊子夹取4片φ6mm无菌滤纸片在平板上等距离放置，取8μl假交替单胞菌20101015001株的新鲜菌液滴于滤纸片上，28℃培养24h后观察透明圈。另选用1株芽孢杆菌KL-Y 2013株和1株酵母菌KL-5 2016株作为对照菌株，操作方法同上。

如图4所示，实验结果发现，对照菌株中芽孢杆菌KL-Y 2013L株观察到透明圈，但酵母菌KL-5 2016株没有观察到透明圈。假交替单胞菌20101015001株可在酪蛋白平板上形成透明圈，该结果表明20101015001株具有胞外的蛋白酶活性。

实施例6：假交替单胞菌20101015001株安全性实验

评估菌株对水生动物的安全性，所选的水生动物为凡纳滨对虾。

假交替单胞菌20101015001株以1.0×10⁸CFU/ml的浓度，浸浴凡纳滨对虾，另设对照组。每组设3个平行，每个平行30尾虾，浸泡72h，记录对虾的活动及存活状况。实验结果中20101015001株并未引起任何对虾死亡和异常表征，该结果显示该株菌对凡纳滨对虾无致病性。

实施例7：饲料中添加假交替单胞菌20101015001株对对虾生长性能的评估

本实施例用于假交替单胞菌20101015001株对水生动物的生长性能的评估，评估所用的水生动物以凡纳滨对虾为例。

1.1菌液制备

假交替单胞菌20101015001保种菌株，在2216E平板上划线活化，挑取单菌落接种于2216E海水液体培养基，于28℃摇床振荡培养过夜，采用涂布平板计数法确定菌浓度约为10¹¹CFUml^-1。

1.2实验饲料制备

饲料选用正大集团有限公司所售2种不同规格的饲料，饲料粒径分别为0.5—1.0mm和1.2mm，饲料蛋白含量均为35％，分别记为1号和2号料。

实验饲料制备：2种规格饲料分别以料液比1：0.5(W/g：V/ml)添加假交替单胞菌20101015001菌液。室温放置10h，使菌液充分浸润，使饲料中最终含菌量为10¹¹CFU/g左右。

对照组饲料：按照料液比1：0.5与无菌2216E培养基混合，操作方法同上。

1.3实验分组及养殖管理

实验虾病原检测：随机取实验对虾30尾，分为2个样品进行合并检测，使用无菌手术刀片切取对虾肝胰腺、鳃丝和肌肉组织，放入3倍体积的95％乙醇中保存。组织的总DNA和总RNA，使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根)和RNAiso Plus(TaKaRa)分别进行提取，检测方法分别按OIE(2016)、Tourtip等(2009)和Zhang等(2014)的方法对对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(VP_AHPND)、桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)和偷死野田村病毒(CMNV)进行PCR检测。检测结果表明，实验虾的IHHNV、TSV、YHV、IMNV和CMNV均为阴性，但VP_AHPND、WSSV和EHP的3种病原在第2轮PCR扩增结果显示为阳性，其中，WSSV和VP_AHPND在2个合并样品中均只有1个出现阳性。

实验分组情况：实验组和对照组各3个平行/组，140尾/平行。实验对虾每天早上、中午和晚上共投喂3次，日投喂量为对虾体重的3～5％。养殖实验进行60d，前30d投喂1号实验饲料，后30d投喂2号实验饲料。实验组投喂中，以6d为周期，前3d投喂实验组饲料，后3d投喂对照组饲料。正式实验前凡纳滨对虾暂养15天。

养殖管理：凡纳滨对虾各平行组，置于φ80cm×150cm的圆形水泥池中，水体为0.5^m3。实验期间每隔2d换水1次，换水量约为水体的1/3，水温为(26±2)℃，盐度为15±1，pH8.1±0.1，连续充气，每天检查对虾摄食及存活情况，对发现的死亡对虾及时捞出。

1.4实验指标及数据处理

每隔15d每组每个重复取20尾，快速称重后再放回原池，计算特定生长率；养殖结束时，记录各组对虾存活数量，测量各组对虾初始和实验结束时的体重，计算各组对虾的存活率和生长率；统计各组对虾饲料投喂量，计算饲料系数。

存活率(Survival rate,SR)(％)＝存活尾数/总尾数×100

特定生长率(Specific growth rate,SGR)(％/d)＝[T_(i+15)平均体重–T_i平均体重]/(T_i平均体重×15)×100

平均生长率(Average growth rate,AGR)(％/d)＝(终末平均体重–初始平均体重)/(初始平均体重×60)×100

饲料系数(Feed conversion ratio,FCR)＝摄食饲料量/(终末体重–初始体重)

以上的实验数据分析，均采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析。单因素实验结果方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05作为差异显著水平，若差异达显著，则进行Duncan多重比较，显著性水平为P<0.05。

2.1生长率

特定生长率统计结果表明，投喂16～30d各组对虾的特定生长率较0～15d均有所提升，但前30d内实验组对虾的特定生长率与对照组相比没有显著差异(P>0.05)；在第31～60天，实验组对虾的生长速度显著高于对照组(P<0.05)。各组对虾养殖60d体重统计结果显示：投喂添加假交替单胞菌(20101015001)组和对照组的总平均生长率分别是(11.6±0.71)％d^-1和(7.69±0.30)％d^-1，实验组较对照组提高了(45.3±12.5)％，且两数值间有显著性差异(P﹤0.05)。

2.2成活率

各组对虾养殖60d存活率结果显示：由于实验对虾携带有WSSV、VP_AHPND和EHP，对照组存活率仅为(25.5±1.8)％，而投喂添加假交替单胞菌(20101015001)组对虾存活率达(79.3±7.6)％，较对照组提高了(213±43)％，且两数值间有着极显著差异(P<0.01)。

2.3饲料效率

实验组的饲料系数和对照组的饲料系数分别为1.05和1.38，实验组是对照组的(76.3±1.0)％，较对照组有着显著差异性下降(P<0.05)。

2.4对虾产量

实验组和对照组对虾养殖60d的单位水体产量分别为(626.7±97.6)gm^-3和(138.2±10.8)gm^-3，实验组是对照组的(456±92)％，且两数值间有着极显著性差异(P<0.01)。

表1投喂添加不同饲料的凡纳滨对虾生长、存活和生产特性

注：标注相同小写字母表示无显著差异(P>0.05)，标注不同小写字母表示有显著差异(P<0.05)，标注两个相同的字母表示极显著差异(P<0.01)。

实施例8：饲料中添加假交替单胞菌20101015001株对对对虾肠道菌群的影响评估

实验用虾分组及管理同实施例5。

实验中第40、50和60d，测定对虾肠道细菌优势菌群的变化，以评估假交替单胞菌20101015001株对对对虾肠道菌群的影响。

肠道组织DNA的提取及测序：参考李继秋等(2006)的方法，提前2d从每组随机取8尾虾，置于3L新鲜海水中暂养，不投喂饲料，待排空肠道内容物后，无菌操作取对虾肠道，置于灭菌海水中清洗后匀浆，将肠道匀浆液梯度稀释，将各稀释度的肠道匀浆液涂布2216E平板，于28℃培养箱中培养24h后，挑取各组平板中的优势菌落，进行分离纯化培养。按水煮法提取DNA作为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，PCR扩增产物寄送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

肠道菌群分析：测序分析结果表明，益生菌添加的颗粒饲料长期投喂改变了肠道内定植的优势菌群。在实验40d时，对照组对虾的肠道中定植菌量最少，无明显优势菌落，而实验组肠道定植菌只有1株占绝对优势的副溶血弧菌，对该株副溶血弧菌进行了pirA和pirB基因检测，结果呈阴性，表明为非VP_AHPND菌株；实验50d时，实验组肠道定植的优势菌除了副溶血弧菌还多了美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)；实验60d时，对照组肠道定植有美人鱼发光杆菌和副球菌(Paracoccus sp.)2株优势菌；而实验组肠道定植优势菌是微杆菌。上述结果表明，假交替单胞菌20101015001株在应用中，可影响水生对物的肠道内定植的优势菌群种类，这种影响与提高对虾免疫力和生长性能相关。

表2各实验组对虾中肠定植的优势菌

注：ND表示未测试。

实施例9：饲料中添加假交替单胞菌20101015001株对对虾免疫性能的影响

实验用虾分组及管理同实施例5。

对虾血清制备：实验60天后，对虾进行饥饿24h再抽取血液。每池取10尾对虾，用1ml无菌注射器自对虾围心腔中抽取血淋巴，每组血淋巴液混合置于无菌离心管中，于4℃冰箱中静置过夜，3000r/min离心10min，取上层血清，置于–80℃超低温冰箱保存。

血清酶活测定：酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、溶菌酶活力，以及总蛋白的浓度测定均采用测试盒(南京建成生物工程研究所)按说明书方法操作。

ACP活力定义：100ml血清在37℃与基质作用30min产生1mg酚为1个活力单位(U/100ml)；SOD总活力定义：lml反应液中SOD抑制率达50％时所对应的酶量为一个SOD活力单位(U/ml)；POD活力定义：在37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生1μg的底物酶量定义为一个酶活力单位(U/ml)；溶菌酶测定采用以南京建成生物工程研究所提供的测试盒中的溶壁微球菌的冻干粉(sigma)为底物。用0.1mol/L、pH＝6.4的磷酸钾盐缓冲液配底物悬液(OD≈0.3-0.5)。取3m1该悬液于试管内做水浴处理，并加入50μL血清振荡混匀，测其A₀值。然后37℃水浴加热30min，结束后立即冰浴10min以终止反应，于570nm处的测其A值。溶菌酶活力U_L按下式计算：U_L＝(A₀-A)/A；总蛋白浓度测定原理：碱性条件下，蛋白将Cu²⁺还原为Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂形成紫色的络合物，562nm处有最大吸收峰，依据吸光度与浓度成正比，通过测吸光度即可计算待测蛋白的浓度。

蛋白浓度分析：实验组总蛋白浓度极显著高于对照组(P<0.01)。

免疫酶活结果分析：实验组凡纳滨对虾血清ACP、SOD和POD较对照组分别提高20.1％、13.7％和9.3％，其中ACP和SOD较对照组有着差异性显著(P<0.05)，POD较对照组有着极差异极显著(P<0.01)。溶菌酶活性和总蛋白浓度实验组较对照组分别提高28.6％和12.8％，但与对照组间差异不显著(P>0.05)。

表3不同添加饲料对凡纳滨对虾免疫的影响

注：标注相同小写字母表示无显著差异(P>0.05)，标注不同小写字母表示有显著差异(P<0.05)，标注两个相同的字母表示极显著差异(P<0.01)。

上述结果表明，饲料添加该菌株，可提高携带白斑综合征病毒(WSSV)、虾肝肠胞虫(EHP)和致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(VP_AHPND)病原对虾血清总蛋白浓度和免疫酶活性。

实施例10：假交替单胞菌20101015001株在水产养殖中的应用效果评估方式

通过注射、口服或浸泡的方式，评估假交替单胞菌20101015001株对水生动物抗病效果评估。

水生动物可以为甲壳类、鱼类和爬行类等。

注射可采用腹腔或肌肉注射两种方式，该方式下菌株使用的剂量为10⁴—10⁸CFU/g(菌落形成单位/鱼体体重)，注射1次后的14—30天也可进行2次加强接种；

口服方式中，该菌株在配合饲料中的添加剂量为10⁴-10¹¹CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂14—60d；

浸泡方式中，该菌株在养殖水体中的浓度为10⁴-10⁹CFU/ml(菌落形成单位/浸泡水体体积)的浓度，浸泡时间60min—24h。

上述假交替单胞菌20101015001株在对虾养殖中抗病原的应用效果评估所用的病原，可以是下列病原中的1种或多种。所述的病原可以为白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、致急性肝胰腺坏死病细菌、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)、偷死野田村病毒(CMNV)和桃拉综合征(TSV)病毒等已知或未知的虾类病原、神经坏死病毒(NNV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)等鱼类病毒，也可以是如哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、坎贝氏弧菌(V.campbellii)、发光杆菌、以及可引起对虾肝胰腺坏死综合征(AHPND)或其他细菌病的虾类病原细菌、爱德华氏菌(Edwardsiella)、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)等鱼类病原菌。

其中，可引起对虾肝胰腺坏死综合征(AHPND)的细菌为携带具有编码PirA和/或PirB毒素基因的质粒的弧菌引起的急性肝胰腺坏死病，该类弧菌可以为V.parahaemolyticus，V.campbellii和V.owensii等，也可以是其他尚未发现和报道的携带具有编码PirA和/或PirB毒素的基因的细菌。

应用30—60天后，通过投喂前后的水生动物的生长性能、免疫因子及成活率等的检测，进行假交替单胞菌20101015001株抗病原的应用效果评估，较对照组实验组的成活率和平均生长率提高10—30％及以上，视为有效。

实施例11：假交替单胞菌20101015001株与其他益生菌混合在水产养殖中的应用效果评估方式

将假交替单胞菌20101015001株与水生动物益生菌混合，进行混合益生菌制剂在水产养殖上应用效果评估。

20101015001株与其不具有拮抗作用的益生菌，按1:0.25、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2.0的比例混合添加于水生动物饲料中，添加菌在饲料中的浓度可以10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、108⁵、10⁹、10¹⁰、10¹¹CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂14—60d后，用合适剂量的实验水生动物的病原进行人工感染，根据感染后的成活率，确定两种益生菌的合适比例及在饲料中适宜添加量，并参考实施例7、8和9的方法进行混合益生菌对水生动物抗病及生长性能的影响评估。

上述应用试也可采用浸泡的方式加以评估，所述的益生菌可以为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)等，水生动物可以为甲壳类、鱼类、爬行类等水生动物。

应用30—60天后，通过投喂前后的水生动物的生长性能、免疫因子及成活率等的检测，进行假交替单胞菌20101015001株抗病原的应用效果评估，较对照组实验组的成活率和平均生长率提高10—30％及以上，视为有效。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的均等修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的专利涵盖范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

连云港市启明水产有限公司

<120> 一株假交替单胞菌及其作为益生菌在水产上的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp)

<400> 1

agtcgagcgg taacatttct agcttgctag aagatgacga gcggcggacg ggtgagtaat 60

gcttgggaac atgccttgag gtgggggaca acagttggaa acgactgcta ataccgcata 120

atgtctacgg accaaagggg gcttcggctc tcgcctttag attgggccaa gtgggattag 180

ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgatccct agctggtttg agaggatgat 240

cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 300

tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt 360

gtaaagcact ttcagtcagg aggaaaggtt agtagttaat acctgctagc tgtgacgtta 420

ctgacagaaa aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcga 480

gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg tacgcaggcg gtttgttaag cgagatgtga 540

aagccccggg ctcaacctgg gaactgcatt tcgaactggc aaactagagt gtgatagagg 600

gtggtagaat ttcaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctgaaggaat accgatggcg 660

aaggcagcca cctgggtcaa cactgacgct catgtacgaa agcgtgggga gcaaacagga 720

ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtctact agaagctcgg aacctcggtt 780

ctgtttttca aagctaacgc attaagtaga ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa 840

actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca 900

acgcgaagaa ccttacctac acttgacata cagagaactt accagagatg gtttggtgcc 960

ttcgggaact ctgatacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gagatgttgg 1020

gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat ccttagttgc tagcaggtaa tgctgagaac 1080

tctaaggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgg 1140

cccttacgtg tagggctaca cacgtgctac aatggcgcat acagagtgct gcgaactcgc 1200

gagagtaagc gaatcactta aagtgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc 1260

catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgta tcagaatgac gcggtgaata cgttcccggg 1320

ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc tccagaagta gatagtctaa 1380

ccctcgggag gacgtt 1396

<210> 2

<211> 1193

<212> DNA

<213> 假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp)

<400> 2

ttgattgggt tgagtgtagg gaacgaatta gttgtattaa aagaatttac tagcaataac 60

ggagaagtaa cccgccgcta tcaacaaacg tatcagggca ttcctgtcat tggtgatacg 120

gtcagcttaa catttaataa tgggatgctt aaaaaagccc atggtgcagc tgtttataat 180

attgatgaag atttatctga tgtatcggct aaattgacaa aaaaagatgc gattttaaaa 240

gggtctaaaa cgggtatagc tgcaaaatca gtaggcttaa aaaaacataa tgagcaatcc 300

agacttgcta tctgggttga cgatcaaaat aaagcgcatt tagtttatga agtgtcttat 360

gttacttatg gcaagtcacc atcaaggcca tacctgatca ttgatgctaa taccggtgag 420

gtcttgctta gttacgataa cctgcaacat gccaatgcaa caggccctgg cggtaatcta 480

aaaacaggca agtatttata tggaactgat tttgacagcc tagatgttag tcaatcaggt 540

aatacttgta gcatgaataa cgcaaatgtt cgcactatta atttaaatgg cggaacaagt 600

ggctcttctg cgtattcatt tacatgtcct gaaaatacgt ttaaagaaat taacggtgct 660

tattcaccgc taaacgatgc tcattttttt ggtaacgtta tttttaatat gtataacgat 720

tggttaggga ctgcgccttt gagttttcag ttacaaatgc gggttcatta ctcaagtaac 780

tatgaaaatg cgttttggga tggcagcgca atgacctttg gtgatgggca aaatacattc 840

tacccgttgg ttagtttaga tgtttctgcg catgaagtca gccatggctt tactgagcaa 900

aattcaggct tgatttacaa tggtaaacca ggcggattaa acgaagcatt ttcggatatg 960

gctggtgaag ccgctgaatt ttatatgaaa ggcagcaacg attggctagt tggaaaggat 1020

atttttaaag gtaatggtgc actgcgttac atgaataacc ctacccaaga tggccgttct 1080

atagataacc aaagtaacta ttattcaggt atggatgtgc attatagttc aggtgtttat 1140

aacaaggcat tttataattt agcaaccacg ccgggttggg atacgcaaaa agc 1193

Claims (10)

1.一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp)，其特征在于所述菌株于2018年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.16067；所述菌株是从健康大菱鲆肠道中分离得到的野生假交替单胞菌株。

2.如权利要求1所述的假交替单胞菌CGMCC No.16067株，其特征在于所述菌株的16srRNA和弧菌溶血素基因的碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，这些基因具有该菌株的特征性。

3.如权利要求1所述的假交替单胞菌CGMCC No.16067株，其特征在于所述菌株，具有胞外蛋白酶活性。

4.如权利要求1所述的假交替单胞菌CGMCC No.16067株，其特征在于所述菌株，以及该菌株的各类产物和/或其产物的改造物，对对虾类不具有致病性，对可引起对虾急性肝胰腺坏死病的细菌具有拮抗作用。

5.如权利要求4所述的假交替单胞菌CGMCC No.16067株，其特征在于所述可引起致急性肝胰腺坏死病的细菌为携带具有编码PirA和/或PirB毒素的基因的质粒的弧菌属细菌。

6.如权利要求1所述的假交替单胞菌CGMCC No.16067株，其特征在于该菌株，以及该菌株的各类产物和/或其产物的改造物，对水生动物的病毒和细菌病原具有抗病作用。

7.如权利要求6所述的假交替单胞菌CGMCC No.16067株，其特征在于所述的水生动物病毒和细菌病原为白斑综合征病毒、虾血细胞虹彩病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、偷死野田村病毒病、黄头病毒、桃拉综合征病毒神经坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒，哈维氏弧菌、副溶血弧菌、坎贝氏弧菌、发光杆菌、以及可引起对虾肝胰腺坏死综合征或其他细菌病的虾类病原细菌、爱德华氏菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌。

8.如权利要求1—7任意一项所述的假交替单胞菌CGMCC No.16067株作为水生动物益生菌的应用，其特征在于所述菌株具有促进水生动物生长的作用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于可采用口服或浸泡的方式，口服方式中，该菌株在饲料中的添加剂量为10⁴—10¹¹CFU/g，连续投喂14天及以上；浸泡方式中，该菌株在养殖水体中的浓度为10⁴—10⁹CFU/ml，浸泡时间为60min及以上。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述水生动物为甲壳类、鱼类、两栖类或爬行类动物。