CN114774310B - 一种假交替单胞菌菌株及其应用 - Google Patents

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    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
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Abstract

本发明涉及一种假交替单胞菌菌株及其应用，假交替单胞菌为DL3菌株，其菌株保藏号为CGMCC No.8721，该菌株可通过产生密度感应淬灭酶和抑菌蛋白等方式防控水产养殖中的病害，并且能够抑制多种常见的病原菌，本发明表明，菌株DL3对鳗弧菌有显著的拮抗作用，并且对AHL类信号分子具有降解能力。

Description

一种假交替单胞菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别是涉及一种假交替单胞菌菌株。
背景技术
病害是制约水产养殖业发展的重要因素之一，随着海水养殖产业的发展和集约化养殖规模的不断扩大，海水养殖业中细菌性疾病的发病率越来越高。我国每年因病害导致的水产经济损失高达数百亿元。近年来，随着养殖环境的不断变化，弧菌问题一直困扰着广大水产养殖者。在导致养殖水产动物感染的病原菌中，致病性弧菌占有较高比例，大有成为对虾养殖“头号杀手”之势。这不仅给水产动物健康带来高风险，也给海水养殖产业造成严重的经济损失。弧菌是在进海口、浅海区域内最常见的细菌之一，该病菌对于对虾生长繁殖危害非常严重，感染了弧菌病的对虾会突然发病，外观特征为红腿、黄黑鳃、断须等，且对虾活力减弱、吃料减缓、空肠空胃、肝胰脏萎缩，对虾尾部呈白色并会逐渐蔓延其他部位，进而全身发白，如不能得到有效的治疗会造成大规模死亡。
为提高对水产品成活率，抗生素的使用成为现阶段最直接、最经济的方法。由于抗生素的抗菌作用显著、抗菌谱广，其目前在防治细菌性疾病方面具有不可替代的作用。然而在水产养殖中常过量使用抗生素，2013年我国约有半数以上的抗生素使用量用于海洋水产养殖。抗生素的不合理使用不仅容易引发病原菌的耐药性，降低了养殖动物的抗病能力，其药物残留对海洋生态造成了不同程度的污染。世界卫生组织在21世纪初宣布抗生素滥用产生的抗性基因是对人类健康的构成最大威胁。因此，寻找一种有效的替抗手段是解决抗生素滥用问题的关键。
筛选病原菌的拮抗菌成为一种安全高效的替抗手段。尤其对海洋菌来说，利用其土著优势，通过分泌特殊代谢物质或改变环境条件抑制或杀灭病原微生物已经得到了广泛研究和应用。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种假交替单胞菌菌株及其应用，即一种能够抑制鳗弧菌的有益菌，从而弥补现有技术的不足。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种假交替单胞菌菌株，所述假交替单胞菌菌株的保藏名称为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DL3，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8721。
所述的一种假交替单胞菌菌株在制备抑制水产养殖病原菌生长制品中的应用。
进一步地说，所述水产养殖病原菌为鳗弧菌。
一种由所述的假交替单胞菌菌株制成的菌剂。
所述的一种假交替单胞菌菌株制成得菌剂在制备饲料添加剂或养殖水体添加剂的应用。
本发明的有益效果：本发明的假交替单胞菌DL3可以抑制多种常见的病原菌。
附图说明
图1是本发明基于16S rRNA序列构建的菌株DL3系统发育树；
图2是本发明不同培养时间对菌株DL3生物量(图2a)以及抑菌活性的影响(图2b)；
图3是本发明菌株DL3对AHL类信号分子结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1、假交替单胞菌DL3菌株的筛选
发明人从水产养殖池中防污附钢片的微生物粘膜中分离培养出一种新的菌种，于海洋培养基2216E平板上，28℃恒温培养24h，随即挑取该单菌落进行继代培养，直至得到纯化菌株，编号为DL3。该菌种已在国家知识产权局中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏日期为2014年1月13日，保藏号为CGMCC No.8721。
提取菌株DL3的基因组DNA，使用细菌16S rRNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)对其16S rRNA基因序列进行扩增，利用序列比对方法进行分子鉴定，采用MEGA5.1构建系统发育进化树(如图1所示)，确定本发明筛选的菌株DL3为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。16S rRNA序列如SEQ ID NO.1。
实施例2、假交替单胞菌DL3菌株能够降解短链AHL类信号分子
将菌株DL3接种于2216E液体培养基中，于摇床170rpm、28℃培养24h。在培养获得的菌液中加入3-oxo-C6-HSL后在28℃反应24h，离心取上清。用AHL报告菌紫色色杆菌CV026检测菌株DL3对C6-HSL和3-oxo-C6-HSL的降解活性，发现菌株DL3具有很强的3-oxo-C6-HSL降解活性，能够完全降解3-oxo-C6-HSL，但对C6-HSL的降解活性较弱。说明DL3可能通过淬灭病原菌分泌的信号分子而发挥其拮抗作用。
实施例3、假交替单胞菌DL3菌株能够降解长链AHL分子
将菌株DL3接种于2216E液体培养基中，于摇床170rpm、28℃培养24h。在培养获得的菌液中加入C8、3-oxo-C8、C10、3-oxo-C10、C12、3-oxo-C14-HSL后在28℃反应24h。离心取上清用AHL报告菌紫色色杆菌VIR24检测剩余的AHL分子，发现菌株DL3除了对C8-HSL、3-oxo-C8-HSL和3-oxoC10-HSL降解活性较弱外，对C10、C12、3-oxo-C14-HSL具有强降解活性(如图3所示)。因此表明菌株DL3具有进一步开发为有益菌的潜力。
实施例4、假交替单胞菌DL3菌株能够抑制常见病原菌
通过以上实验得出假交替单胞菌DL3具有成为有益菌的潜质，因此，对其进行进一步研究。从本实验室菌种库中选取23株常见病原菌，分别接种于2216E或LB液体培养基，制成菌液。用生理盐水稀释至一定浓度后涂布于2216E固体培养基上，挑取菌株DL3点种在平板上。28℃培养24-96h后，观察菌株DL3周围是否有透明圈，并测量抑菌圈直径(如图2所示)。结果发现菌株DL3对很多的病原菌有抑制作用，尤其是对鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的拮抗作用最强，对哈维氏弧菌(V.harveyi)、东方弧菌(V.orientalis)的作用次之。具体结果见表1。
表1菌株DL3对不同指示菌的抑菌活性
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 一种假交替单胞菌菌株及其应用
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggggggggc aggctaccat gcagtcgagc ggtaacattt ctagcttgct agaagatgac 60
gagcggcgga cgggtgagta atgcttggga acatgccttg aggtggggga caaccattgg 120
aaacgatggc taataccgca taatgtctac ggaccaaagg gggcttcggc tctcgccttt 180
agattggccc aagtgggatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatcc 240
ctagctggtt tgagaggatg atcagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac 300
gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt 360
gtgtgaagaa ggccttaggg ttgtaaagca ctttcagtca ggaggaaagg ttagtagtta 420
atacctgcta gctgtgacgt tactgacaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc 480
cgcggtaata cggagggtgc gagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgtacgcagg 540
cggtttgtta agcgagatgt gaaagccccg ggcttaacct gggaactgca tttcgaactg 600
gcaaactaga gtgtgataga gggtggtaga atttcaggtg tagcggtgaa atgcgtagag 660
atctgaagga ataccgatgg cgaaggcagc cacctgggtc aacactgacg ctcatgtacg 720
aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcta 780
ctaggagctg gggtcttcgg acaacttttc caaagctaac gcattaagta gaccgcctgg 840
ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900
gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct acacttgaca tacagagaac 960
ttaccagaga tggtttggtg ccttcgggaa ctctgataca ggtgctgcat ggctgtcgtc 1020
agctcgtgtt gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct atccttagtt 1080
gccagcgatt cggtcgggaa ctctaaggag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg 1140
gacgacgtca agtcatcatg gcccttacgt gtagggctac acacgtgcta caatggcagg 1200
tacagagagc agcgagctag cgatagtgag cgaatccctt aaagcctgtc gtagtccgga 1260
ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcga atcagaatgt 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg 1380
ctccagaagt tggatagtct aaccttcggg gggaccgttc caaccccacc gggaaggtta 1440

Claims (2)

1.一种假交替单胞菌菌株在制备抑制水产养殖病原菌生长制品中的应用；
所述水产养殖病原菌为鳗弧菌、绿脓杆菌、哈维氏弧菌和东方弧菌中的至少一种；
所述假交替单胞菌菌株的保藏名称为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DL3，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8721。
2.一种假交替单胞菌菌株制成得菌剂在制备饲料添加剂或养殖水体添加剂的应用；
所述假交替单胞菌菌株的保藏名称为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DL3，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8721。
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