CN103555613B - 一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌及其应用，该菌株为对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌YZ037，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.7624。该枯草芽孢杆菌YZ037对罗非鱼源无乳链球菌有拮抗作用。所述的枯草芽孢杆菌可作为水产饲料的添加剂的应用，将该枯草芽孢杆菌添加到罗非鱼饲料中制成一种微生物饲料，用该微生物饲料喂养罗非鱼后能有效的预防罗非鱼链球菌病的发生。
Description
技术领域
本发明涉及一株对无乳链球菌，特别是一种对罗非鱼源无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
罗非鱼是全球主要经济鱼类之一，具有生长快、抗病力与抗逆性强、肉质好、繁殖力强、适应性广以及群体产量高等一系列优点，现已成为南方各省出口型养殖规模最大的鱼类，产量占全世界的50％，罗非鱼产业对于增加就业机会、提高农民收入都有十分重要的意义。然而近年来，由于高密度饲养，种群退化，加上养殖水质、环境及气候恶化，各类病害时常大面积爆发，严重影响了罗非鱼产业的健康发展。2009年以来，国内主要的罗非鱼养殖区每年均爆发了非常严重的罗非鱼流行病，患病罗非鱼在水面离群独游，游姿失衡，眼球突出，被养殖户形象的称为“突眼病”。该病发病率一般达20％～30％，死亡率在80％以上。病原分析表明引起罗非鱼“突眼病” 的病原为链球菌，主要为海豚链球菌(Streptococcusiniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。据统计，近几年因链球菌病导致罗非鱼产业的损失超过20亿元，如何防治罗非鱼链球菌病已成为鱼农和渔业管理部门最为关注的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌，该菌株对罗非鱼源无乳链球菌有拮抗作用，将该菌应用于罗非鱼养殖，可明显降低罗非鱼链球菌病的发病率。
解决上述技术问题的技术方案是：一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YZ037，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No. 7624，保藏日期为2013年5月16日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的进一步技术方案是：所述的枯草芽孢杆菌在拮抗无乳链球菌中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在拮抗罗非鱼源无乳链球菌中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在制备预防罗非鱼链球菌病的微生物菌剂的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在制备水产饲料的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在制备水产饲料添加剂的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在制备罗非鱼饲料添加剂的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在制备罗非鱼饲料的应用，将所述的枯草芽孢杆菌添加到罗非鱼饲料中制成一种微生物饲料，用该微生物饲料喂养罗非鱼后能有效的预防罗非鱼链球菌病的发生。
所述的罗非鱼饲料，其特征在于：每吨饲料中枯草芽孢杆菌的添加量为0.5×1013-2.5×1013 CFU。
由于采用上述技术方案，本发明之一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌，具有以下有益效果：
本发明所述的枯草芽孢杆菌为对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌YZ037，该菌株能抑制无乳链球菌的生长，且该菌株易于在罗非鱼肠道内定植，所以将该菌株添加到罗非鱼饲料中制成一种微生物饲料，用该微生物饲料喂养罗非鱼后能有效的预防罗非鱼链球菌病的发生。
下面，结合说明书附图和具体实施例对本发明之一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌及其应用的技术特征作进一步的说明。
附图说明
图1：为枯草芽孢杆菌的YZ03716S rDNA进化树分析图。
图2：为枯草芽孢杆菌YZ037对无乳链球菌的拮抗作用实验结果图，
图2中，a为本发明所述的枯草芽孢杆菌YZ037，b和c为实验过程中筛选到的另外2株对无乳链球菌有拮抗作用的细菌。
具体实施方式
一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌，该菌株为对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌YZ037，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC 7624。所述的枯草芽孢杆菌为对罗非鱼源无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌YZ037。
一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的应用，所述的枯草芽孢杆菌可用于制备水产饲料或水产饲料添加剂，特别适合用于制备罗非鱼饲料、罗非鱼饲料添加剂或能预防罗非鱼链球菌病的微生物菌剂。将所述的枯草芽孢杆菌添加到罗非鱼饲料中制成一种微生物饲料，用该微生物饲料喂养罗非鱼后能有效的预防罗非鱼链球菌病的发生。
下面将更详细的说明本发明的内容：
1. 筛选具有无乳链球菌拮抗作用的微生物，具体操作如下：
（1）用接种针挑取无乳链球菌在血平板上划一条直线进行接种。
（2）在已爆发罗非鱼链球菌病的养殖塘中挑选未患病的健康罗非鱼，解剖该罗非鱼，将接种针在酒精灯火焰上灼烧灭菌后，插入该罗非鱼肠道中，轻微搅动3-5次，在垂直于步骤（1）中的无乳链球菌接种线的方向上划一直线接种罗非鱼肠道中的混合微生物，使肠道微生物穿过无乳链球菌。
（3）接种完成后，于30℃培养24 h。培养结束后，观察划线接种交叉部位微生物的生长情况，选取出对无乳链球菌有拮抗作用的混合微生物用于下一步分离。
（4）用接种针挑取步骤（3）中选取的对无乳链球菌有拮抗作用的混合微生物，划线接种于预先涂布了无乳链球菌的血平板，于30℃培养24 h。
（5）通过步骤（4）的划线培养，混合微生物得到分离。挑选对无乳链球菌具有拮抗作用的单菌落进行反复划线培养，直至纯化，即可得到具有无乳链球菌拮抗作用的微生物。
2. 微生物16s rDNA序列分析
将上述得到的纯化后的细菌接种于LB（Luria-Bertani）液体培养基中，于温度为30℃条件下培养24h。以菌液作为PCR（polymerase chain reaction）模板，采用引物27F：(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和引物1492R：(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)扩增细菌的16S rDNA。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行胶回收，回收产物经TA克隆后转化到JM109大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃培养12h，所得阳性克隆，经质粒提取和PCR验证后送至上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。将序列提交至GenBank数据库进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析，采用MEGA5软件将同源性相近的序列构建进化树。BLAST显示菌株的16S rDNA基因与枯草芽孢杆菌的16S rDNA基因具有高度同源性，进化树分析表明YZ037与枯草芽孢杆菌具有最近的亲缘关系(参见图1)。因此，我们初步认为所分离得到的对无乳链球菌有拮抗作用微生物为枯草芽孢杆菌。该枯草芽孢杆菌YZ037的16s rDNA序列已提交至GenBank数据库，accession number KF006991。
3. 微生物生理生化鉴定：
参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠 等，科学出版社，2001)中所述的枯草芽孢杆菌生理生化指标，对所筛选微生物进行生理生化鉴定，结果如表1所示。根据生理生化鉴定结果，再结合16s rDNA序列分析，可以确认所分离得到的对无乳链球菌有拮抗作用微生物为枯草芽孢杆菌。
表1 菌株生理生化试验结果
4. 枯草芽孢杆菌YZ037的形态特征：
枯草芽孢杆菌YZ037革兰氏染色阳性，单细胞呈杆状，细胞长度约为1.5-3μm，宽约0.5μm，单个或呈短链排列，有芽孢。在LB固体平板上形成的菌落形态为：白色，中等菌落、圆形、中间突起、边缘不整齐、不透明、表面干燥，穿刺培养呈假根状，水封片观察细菌具运动性。
5. 枯草芽孢杆菌YZ037对无乳链球菌的拮抗作用：
取200μl培养至对数生长期的新鲜无乳链球菌菌液，涂布血平板上。然后用接种环挑取保存在斜面培养基上的枯草芽孢杆菌YZ037，点种于该血平板上。于30℃培养24 h后观察结果。结果见图2，从图中可以看出本发明所述的枯草芽孢杆菌YZ037对无乳链球菌有着极强的拮抗作用，其中a为本发明所述的枯草芽孢杆菌YZ037，b和c为实验过程中筛选到的另外2株对无乳链球菌有拮抗作用的细菌。
6. 人工感染试验：
选取150 g左右的健康罗非鱼80条，分为2组，每组40条。将枯草芽孢杆菌培养液(菌体浓度约1.5×109 CFU/ml)与普通罗非鱼饲料按体积质量比2：100的比例混合均匀后，按正常食用量喂养试验组罗非鱼；对照组罗非鱼则喂养普通罗非鱼饲料。喂养1个月后，进行无乳链球菌的人工感染试验，试验方法如下：
将无乳链球菌用无菌生理盐水稀释成1.0×108 CFU/mL的菌悬液，将此菌悬液与罗非鱼饲料按体积质量比2：100的比例混合均匀后，按正常食用量喂养罗非鱼。连续喂养7天后，试验组罗非鱼继续喂养含枯草芽孢杆菌的罗非鱼饲料，对照组罗非鱼继续喂养普通罗非鱼饲料，观察15天，统计罗非鱼死亡数，结果见表2。
表2 人工感染试验结果
| 组别 | 喂养情况 | 15d死亡数/总数 | 死亡率％ |
| 试验组 | 枯草+饲料 | 6/40 | 15.0 |
| 对照组 | 饲料 | 33/40 | 82.5 |
从表2可以看出，喂养了枯草芽孢杆菌YZ037的罗非鱼在喂养了无乳链球菌后的死亡率要大大低于对照组，说明饲喂枯草芽孢杆菌YZ037能对罗非鱼无乳链球菌病的爆发起到很好的预防作用。
GGCGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTG
Claims (7)
1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YZ037，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No. 7624，所述的枯草芽孢杆菌为在健康罗非鱼肠道组织中分离、纯化，并对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备预防罗非鱼链球菌病的微生物菌剂的应用。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备水产饲料的应用。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备水产饲料添加剂的应用。
5.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备罗非鱼饲料添加剂的应用。
6.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备罗非鱼饲料的应用，将所述的枯草芽孢杆菌添加到罗非鱼饲料中制成一种微生物饲料，用该微生物饲料喂养罗非鱼后能有效的预防罗非鱼链球菌病的发生。
7.如权利要求6所述的罗非鱼饲料，其特征在于：每吨饲料中枯草芽孢杆菌的添加量为0.5×1013-2.5×1013 CFU。
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