CN112522153A - 贝莱斯芽孢杆菌及其产品和应用 - Google Patents

贝莱斯芽孢杆菌及其产品和应用 Download PDF

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程俊
汪志文
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Abstract

本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌及其产品和应用，涉及生物技术领域。本发明提供的贝莱斯芽孢菌，来源于红树林沉积物，对于包括类致贺邻单胞菌、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌和杀鲑气单胞菌在内的致病菌具有明显的抑制作用，将贝莱斯芽孢菌的发酵液作为饵料添加剂进行动物试验后，发现可显著提高白鲢对气单胞菌的抗感染能力，同时具有良好的生物安全性，因此，本发明的贝莱斯芽孢菌在气单胞菌病的防治中具有良好的应用前景。本发明提供了一种防治气单胞菌病的生物制剂，该制剂能够用于气单胞菌病的预防和治疗。

Description

贝莱斯芽孢杆菌及其产品和应用
技术领域
本发明生物技术领域，尤其是涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其产品和应用。
背景技术
气单胞菌属(Aeromonas)是一类革兰氏阴性短杆菌，在自然界中广泛分布，存在于如江河、海水、自来水等中，是养殖水生动物爆发性传染病的重要病原菌之一，其中部分种类也是人-畜-鱼共患病原菌。在环境胁迫或条件合适的情况下，气单胞菌可引起鱼类(如青、草、鲢、鳙、鲤、鲫、鲑鳟等)、贝类、以及虾蟹等发病。根据生长发育所需温度范围及是否有动力可将气单胞菌属分为两大类，即嗜温有动力气单胞菌和嗜冷无动力气单胞菌。嗜温有动力气单胞菌包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、舒氏气单胞菌等；嗜冷无动力气单胞菌仅包含杀鲑气单胞菌一种细菌，它们可单独或几种细菌混合感染致病，引发出血性败血症、肠炎、腹水病、疖疮病等，其中以出血性败血症危害鱼的种类最多、范围最大、持续时间最长且造成的损失最大，尤其对我国鲤科鱼类养殖造成持续性的威胁。
目前，我国对气单胞菌病的控制方法主要有抗生素、化学药物和疫苗等，但大量使用药物带来的环境药物残留、耐药基因传播以及耐药菌的产生等问题已严重危及环境和人体健康，而针对气单胞菌的疫苗当前我国批准的仅有嗜水气单胞菌灭活疫苗，不能有效控制多种气单胞菌病。因此，需要积极寻找低毒、天然、安全的新型绿色生物防治途径来防治多种气单胞菌引起的单独或混合感染。
所谓生物防治，就是利用拮抗菌抑制病原菌的生长繁殖，使有害微生物的浓度低于致病浓度，从而达到防控疾病的目的。目前国内在利用拮抗菌防控水产养殖疾病方面已取得一些进展，如张德锋等(CN108676756A)公开了一种分离自罗非鱼肠道的贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用，能有效抑制无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌和迟缓爱德华氏菌等病原菌的生长，安全无残留；曲凌云等(CN107964517A)公开了一株分离自印度洋深层海水的解淀粉芽孢杆菌，能抑制迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、腐败希瓦氏菌、创伤弧菌等多种水产养殖病原菌的生长；施大林等(CN110699300A)发明了一种复合微生物底质改良剂，包含枯草芽孢杆菌和格式乳杆菌，能拮抗嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、爱德华氏菌、鳗利斯顿氏菌、副溶血弧菌及溶藻弧菌等水产病原菌，改善底质生态环境；李成华等(CN106119174A)公开了一种来自海洋的弧菌可拮抗病原性灿烂弧菌；郑风荣(CN110819550A)公开了一种来自海洋的假交替单胞菌，可拮抗两种重要的海水病原性弧菌。然而，从以上结果来看，虽然已有针对一种或几种气单胞菌的拮抗菌被发现，但暂无对多种(6种及以上)气单胞菌均具有拮抗作用的拮抗菌，且没有它们在防控气单胞菌病方面的应用，因而对于我国鱼类等气单胞菌病的防控还缺少相应的生物防控拮抗菌。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌，于2020年7月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61079。
本发明的第二目的在于提供一种菌剂，包含贝莱斯芽孢杆菌。
本发明的第三目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌的发酵产物。
本发明的第四目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其菌剂或者发酵产物在制备抗菌生物制剂中的应用。
本发明的第五目的在于提供一种防治气单胞菌病的生物制剂，包括贝莱斯芽孢杆菌及其菌剂或者发酵产物。
本发明的第六目的在于提供一种饲料，包括贝莱斯芽孢杆菌及其菌剂、发酵产物或者生物制剂。
为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61079。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，包括贝莱斯芽孢杆菌。
第三方面，本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌或者菌剂的发酵产物。
第四方面，本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌、菌剂或者发酵产物在制备抗菌生物制剂中的应用。
作为进一步技术方案，所述抗菌生物制剂的抗菌对象包括类致贺邻单胞菌、耶尔森氏菌、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌或杀鲑气单胞菌。
作为进一步技术方案，所述抗菌生物制剂包括防治气单胞菌病的生物制剂。
作为进一步技术方案，所述气单胞菌病的致病菌包括气单胞菌属。
作为进一步技术方案，所述气单胞菌属包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的至少一种。
第五方面，本发明提供了一种防治气单胞菌病的生物制剂，包括贝莱斯芽孢杆菌、菌剂或者发酵产物。
第六方面，本发明提供了一种饲料，包括贝莱斯芽孢杆菌、菌剂、发酵产物或者生物制剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的贝莱斯芽孢菌，来源于红树林沉积物，对于包括类致贺邻单胞菌、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌和杀鲑气单胞菌在内的致病菌具有明显的抑制作用，将贝莱斯芽孢菌的发酵液作为饵料添加剂进行动物试验后，发现可显著提高白鲢对气单胞菌的抗感染能力，同时具有良好的生物安全性，因此，本发明的贝莱斯芽孢菌在气单胞菌病的防治中具有良好的应用前景。本发明提供了一种防治气单胞菌病的生物制剂，该制剂能够用于气单胞菌病的预防和治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为贝莱斯芽孢杆菌AQ1对6种气单胞菌的抑菌效果，图中第一行从左至右依次为杀鲑气单胞菌、维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌，第二行从左至右依次为中间气单胞菌、舒氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌；
图2为基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树；
图3为贝莱斯芽孢杆菌AQ1的拮抗物质初提物对6种气单胞菌的抑菌效果，图中第一行从左至右依次为杀鲑气单胞菌、维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌，第二行从左至右依次为中间气单胞菌、舒氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌；
图4为贝莱斯芽孢杆菌AQ1对类致贺邻单胞菌、耶尔森氏菌和爱德华氏菌的抑菌效果，图中从左至右依次为类致贺邻单胞菌、耶尔森氏菌和爱德华氏菌；
图5为贝莱斯芽孢杆菌AQ1菌液拌饵投喂白鲢对气单胞菌感染引起的死亡率的影响。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
生物防治的第一步是要筛选病原菌拮抗菌，而拮抗菌的来源在拮抗菌的筛选和应用上是非常重要的一个环节。目前大部分水产益生菌和拮抗菌产品都来自于动物，来自环境的报道较少，而从环境，尤其是特殊环境中分离具有应用价值的病原菌拮抗菌有着巨大的待发掘空间。红树林是位于热带亚热带潮间带的生态系统，其环境具有盐胁迫、高矿物组成、强还原性、强酸性、频繁潮汐、强风、高温、缺氧等特征，红树林中微生物种类丰富，从中快速发现具有活性的微生物和代谢产物已成为生物医药领域的研究热点。本发明采用点种法初筛和打孔法复筛，从深圳东涌红树林沉积物中筛选到了一株对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、杀鲑气单胞菌、舒氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌等6种病原气单胞菌均有明显拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌，该菌株对草鱼、斑马鱼不致病，且对6种气单胞菌单独或混合感染白鲢具有较好的保护率，在水产养殖中具有广阔应用前景。
第一方面，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌，该菌株的分类命名为：贝莱斯芽孢杆菌，拉丁文学名：Bacillus velezensis，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期：2020年7月6日，保藏编号：GDMCC No：61079。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌来源于深圳东涌红树林沉积物，为革兰氏阳性菌，菌落直径约为1-3mm，乳白色，表面光滑形状接近圆形，呈短杆状。
发明人对贝莱斯芽孢杆菌的实验研究发现，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌对于包括类致贺邻单胞菌、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌和杀鲑气单胞菌在内的致病菌具有明显的抑制作用，在气单胞菌病的防治中具有良好的应用前景。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，包括贝莱斯芽孢杆菌。
本发明提供的菌剂，包括本发明的贝莱斯芽孢杆菌，或者贝莱斯芽孢杆菌与辅料或者其他菌的混合，例如，可以是本发明的贝莱斯芽孢杆菌与其他的菌混合制备的菌剂，也可以是本发明的贝莱斯芽孢杆菌与辅料制备得到的菌剂。该菌剂具有本发明贝莱斯芽孢杆菌的所有有益效果。
第三方面，本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌或者菌剂的发酵产物。
经发明人研究发现，贝莱斯芽孢杆菌的发酵液提取物对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、杀鲑气单胞菌、舒氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌具有明显的抑制作用，因此，含有该发酵提取物的发酵产物也具有相应的抑菌作用。
第四方面，本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌、菌剂或者发酵产物在制备抗菌生物制剂中的应用。
在一些优选的实施方式中，所述抗菌生物制剂的抗菌对象包括类致贺邻单胞菌、耶尔森氏菌、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌或杀鲑气单胞菌。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌对于病菌具有明显的抑制作用，能够用于制备抗菌生物制剂。
在一些优选的实施方式中，所述抗菌生物制剂包括防治气单胞菌病的生物制剂。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌对于气单胞菌具有明显的抑制作用，能够用于制备防治气单胞菌病的生物制剂。
在一些优选的实施方式中，所述气单胞菌病的致病菌包括气单胞菌属。
在一些优选的实施方式中，所述气单胞菌属包括但不限于嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的至少一种。
第五方面，本发明提供了一种防治气单胞菌病的生物制剂，包括贝莱斯芽孢杆菌、菌剂或者发酵产物。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌、菌剂或者发酵产物均具有抑制气单胞菌的作用，以其为组分的生物制剂也具有防治气单胞菌病的作用。
第六方面，本发明提供了一种饲料，包括贝莱斯芽孢杆菌、菌剂、发酵产物或者生物制剂。
本发明提供的饲料，包括本发明的贝莱斯芽孢杆菌、菌剂、发酵产物或者生物制剂与营养物质的混合，例如，可以是本发明的贝莱斯芽孢杆菌与营养物质混合得到的饲料，也可以是本发明的菌剂与营养物质混合得到的饲料。该饲料具有本发明贝莱斯芽孢杆菌的所有有益效果。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1深圳红树林沉积物可培养细菌的分离及拮抗菌的筛选
(1)深圳红树林沉积物可培养细菌的分离培养
于2019年9月13日在深圳东涌红树林采集沉积物(5-10cm)，放入装有冰袋的保温箱并于12h内带回实验室处理。取3g沉积物加入无菌海水定容至30mL，将样品稀释10倍作为母液，进而对母液进行10倍倍比稀释，形成100，10-1，10-2，10-3，10-4系列浓度，每个浓度取100μL于2216E固体培养基(配方为：蛋白胨5g，酵母提取物1g，磷酸铁0.01g，牛肉膏1g，海水1L，pH7.4-7.6)无菌涂布均匀，每个浓度3个重复。涂布好的培养基平皿在28℃培养箱中倒置培养24-96h，挑取形态、颜色不同的单菌落，在2216E平板上划线纯化，培养至长出单菌落后，再次挑取单菌落于2216E平板划线纯化至获得形态颜色单一的单菌落，然后挑取单菌落于2216E液体培养基中摇菌培养24-48h，菌液中加入甘油至终浓度20％做好标记保存于-80℃冰箱备用。
(2)拮抗菌的筛选
指示菌：白鲢源嗜水气单胞菌，乌鳢源舒氏气单胞菌，武昌鱼源维氏气单胞菌，白鲢源中间气单胞菌，鲑源杀鲑气单胞菌，白鲢源豚鼠气单胞菌，均为本实验室分离保存菌株。
初筛：采用点种法对分离菌株进行初筛，以上述6种气单胞菌作为指示菌，将对数生长期的指示菌菌液100μL均匀涂布到2216E固体培养基上，再分别吸取分离菌菌液3.0μL点种，间隔相等距离于同一平板重复点种3次，置于28℃恒温培养箱培养24-48h，记录出现明显抑菌圈的菌株。
复筛：采用打孔法对上述有明显抑菌圈的菌株进行复筛。同样以6种气单胞菌作为指示菌，将对数生长期的指示菌菌液100μL均匀涂布到2216E固体培养基上，用100ul无菌枪头的上端在同一平皿上间隔相等距离打3个孔，孔直径约6mm，每个孔中加入80μL拮抗菌菌液，然后将平皿置于28℃恒温培养箱培养24-48h，观察并测定抑菌圈直径。如图1所示，经筛选获得对6种气单胞菌均具有较好拮抗能力的菌株AQ1。
实施例2拮抗菌的鉴定及生长特性分析
(1)拮抗菌的鉴定
16S rRNA序列克隆和系统发育分析：采用瑞真生物细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株AQ1基因组DNA，以DNA为模板，用16S rRNA基因引物进行目的基因扩增，得到扩增产物，引物序列如下：
正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′(SEQ ID No.1)；
反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID No.2)。
扩增产物经电泳和凝胶成像系统观察拍照，呈现单一的目的条带约为1.5kb。将PCR产物送至生工生物工程有限公司进行测序，核苷酸序列信息如SEQ ID No.3所示：
CTCTGTCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGNACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACT。
将核苷酸序列在NCBI中经BLAST进行同源性比较分析，取同源性较高的基因序列通过Mega7.0构建系统发育树，结果显示AQ1与贝莱斯芽孢杆菌亲缘关系最近，如图2所示，因此鉴定AQ1为贝莱斯芽孢杆菌。
生理生化分析：将AQ1分别接种2216E固体和液体培养基，28℃下培养约12-24h至菌液浓度达1×108CFU/mL，采用细菌生化鉴定试剂盒(广州环凯微生物科技有限公司)进行以下生理生化指标的检测：过氧化氢酶、氧化酶、淀粉、苯丙氨酸、硫化氢、明胶、扩散生长、硝酸盐还原、西蒙氏枸椽酸盐、β-半乳糖苷ONPG、靛基质、赖氨酸脱羧酶、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、肌醇、山梨醇、甘露醇、VP，并参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定，结果显示除氧化酶AQ1为阳性外，其他20项指标均与芽孢杆菌一致(表1)。
表1生理生化结果
Items AQ1 芽孢杆菌
淀粉 + +
3％过氧化氢酶 + +
明胶 + +
扩散生长 + +
硝酸盐还原 + +
西蒙氏枸椽酸盐 - -
β-半乳糖苷ONPG - -
蔗糖 + +
葡萄糖 + +
半乳糖 - -
麦芽糖 - -
乳糖 - -
肌醇 - -
山梨醇 - -
甘露醇 - -
蛋白胨水(靛基质) - -
赖氨酸脱羧酶 - -
苯丙氨酸 - -
氧化酶 - +
硫化氢 - -
(2)拮抗菌的生长特性分析
将浓度为1×108CFU/mL的拮抗菌AQ1菌液以1:100(V/V)的比例转接至100mL2216E液体培养基中，分别在温度为24℃、28℃、32℃和37℃恒温摇床中200r/min培养；按上述方法，将相同浓度的菌液按同样的比例转接至初始pH为3、5、7、9、11的2216E液体培养基中，在最适温度下200r/min恒温摇床培养；按上述方法，将相同浓度的菌液按同样的比例转接至初始盐度为0‰、5‰、20‰、35‰、50‰、65‰、80‰的2216E液体培养基中，在最适温度和pH下200r/min恒温摇床培养。每隔2h取250μL菌液于96孔酶标板小孔中，每个样品设3个重复，于酶标仪中600nm波长下测定OD值。结果表明AQ1最适生长pH为5-7，最适温度为32℃，最适盐度为0‰-20‰。
实施例3拮抗菌的拮抗物质初提及其抑菌效果评估
(1)拮抗物质初步提取
采用浓盐酸沉淀法初步提取AQ1的拮抗物质：将浓度为1×108CFU/mL的拮抗菌AQ1菌液以1:100(V/V)的比例转接至200mL的2216E液体培养基中，28℃，200r/min恒温摇床培养48-72h获得发酵液，取50mL菌液，于8000rpm下离心20min，两次离心后获得上清液。上清液中缓慢加入1mol/L HCl溶液至有白色絮状物析出，此时pH约为2，置于4℃中过夜。于8000rpm下离心20min，收集沉淀并用3-5mL PBS(磷酸缓冲盐溶液)复溶，经0.2μm微孔滤膜过滤得拮抗物质初提液。
(2)拮抗物质初提物对病原菌的抑菌效果测定
以白鲢源嗜水气单胞菌，乌鳢源舒氏气单胞菌，武昌鱼源维氏气单胞菌，白鲢源中间气单胞菌，鲑源杀鲑气单胞菌，白鲢源豚鼠气单胞菌为指示菌，运用打孔法测定AQ1拮抗物质初提液的抑菌效果，以PBS作为阴性对照，结果显示拮抗物质初提液抑菌效果良好，对6种气单胞菌均能产生明显抑菌圈，如图3所示。此外，以实验室保存的其他病原菌如类致贺邻单胞菌、耶尔森氏菌、爱德华氏菌为指示菌，测定拮抗菌的抑菌效果，发现其亦能产生明显抑菌圈(图4)，说明AQ1的抑菌效果好且抑菌谱广泛，有产业化应用的潜力。
实施例4拮抗菌的生物安全性评估
(1)拮抗菌对鱼的安全性测定
试验鱼选用白鲢(体长8-10cm，体重9-11g)、斑马鱼(体长1.5-3cm，体重2-3g),设实验组和对照组，实验组又分为3个小组，每组腹腔注射浓度为8×105CFU/mL、8×106CFU/mL、8×107CFU/mL的AQ1菌液100μL，对照组腹腔注射相同体积的PBS，各组含有20尾白鲢或斑马鱼，每组设3个重复，连续观察并记录鱼的存活状态14d。结果发现实验组和对照组均没有鱼的死亡或发病，说明AQ1在以上浓度范围内对鱼的安全性良好。
(2)拮抗菌对抗生素的抗性测定
将AQ1菌液浓度稀释至1×107CFU/mL，取200mL稀释的菌液，均匀涂布于2216E固体培养基上，采用K-B药敏纸片扩散法来检测AQ1对抗生素的敏感性，根据其抑菌圈大小，判断菌株对不同抗生素耐药性，判断标准为WS/T125-1999。试验使用抗生素主要有以下9类：β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、糖肽类、林可酰胺类、磺胺类和氯霉素类。结果如表2所示，即AQ1除对四环素不敏感、链霉素中度敏感外，对其他抗生素均敏感，说明AQ1传递耐药或耐药基因的可能性较低，安全性较好。
表2拮抗菌对抗生素的抗性测定
Figure BDA0002838748220000131
Figure BDA0002838748220000141
注：S：敏感；R：不敏感；I：中度敏感。
实施例5拮抗菌对气单胞菌感染白鲢的保护率测定
(1)饵料制备：准备AQ1菌液，离心，用PBS洗涤两次，然后用无菌水重悬菌体获得菌液，按每10g基础饲料拌4mL菌液(2×106CFU/mL)的标准制备实验组饵料，对照组饵料用相同体积的无菌水拌料。
(2)白鲢养殖：白鲢(体长8-10cm，体重9-11g)240尾，分为4组，2个实验组和2个对照组，每组设3个平行组，每个平行组20尾鱼。所有鱼暂养一周后开始投喂饲料，实验组和对照组分别投喂添加AQ1菌液和无菌水的饵料，每日投喂饵料2次，每次每组投喂5g饵料，持续投喂6周。
(3)保护率测定：在投喂6周后，2个实验组和对照组均分别腹腔注射100μL一定浓度(约106CFU/mL)的嗜水气单胞菌及6种菌液的混合液(6种菌分别为嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、杀鲑气单胞菌、舒氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌，混合液中6种菌浓度相同，且总菌浓度约106CFU/mL)，持续1周观察并记录鱼的存活状态和死亡率，根据以下公式计算保护率：保护率＝(对照组死亡率-实验组死亡率)/对照组死亡率。结果如图5所示，投喂添加AQ1菌液饵料的实验组累积死亡率较对照组显著降低，针对嗜水气单胞菌或6种菌混合感染的保护率分别为54％和49％。因此，本发明的贝莱斯芽孢杆菌AQ1对气单胞菌和其致病力具有抑制作用，有望在控制病原性气单胞菌及单种或多种气单胞菌混合感染引起的疾病，特别是我国鲤科鱼类的出血性败血症中发挥重要作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东海洋大学深圳研究院
<120> 贝莱斯芽孢杆菌及其产品和应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1428
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1024)..(1024)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
ctctgtcacc ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa 60
actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc 120
tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa 180
ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc 240
attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc 300
ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag 360
atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 420
accatgcacc acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga 480
ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540
cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg 600
gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc 660
atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc 720
ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta 780
cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt 840
tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc 900
gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc 960
tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtaccgc cctattcgaa 1020
cggnacttgt tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc 1080
ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag 1140
gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat 1200
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gtggtagccg aagccacctt ttatgtttga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt 1320
agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc 1380
cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgact 1428

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61079。
2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌。
3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或者权利要求2所述的菌剂的发酵产物。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌、权利要求2所述的菌剂或者权利要求3所述的发酵产物在制备抗菌生物制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗菌生物制剂的抗菌对象包括类致贺邻单胞菌、耶尔森氏菌、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌或杀鲑气单胞菌。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗菌生物制剂包括防治气单胞菌病的生物制剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述气单胞菌病的致病菌包括气单胞菌属。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述气单胞菌属包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的至少一种。
9.一种防治气单胞菌病的生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌、权利要求2所述的菌剂或者权利要求3所述的发酵产物。
10.一种饲料，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌、权利要求2所述的菌剂、权利要求3所述的发酵产物或者权利要求9所述的生物制剂。
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