CN110016451A - 一株贝莱斯芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一株贝莱斯芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法，该贝莱斯芽胞杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019218，分类命名为：贝莱斯芽胞杆菌BvL03，拉丁学名：Bacillus velezensis BvL03。由该菌株制成的适用水产养殖的微生态制剂通过饲料添加、水体泼洒或腹腔注射等给药途径，具有广谱的抑制鱼类病原菌的作用，保护率达到85%，作用鱼体后能有效对抗嗜水气单胞菌等鱼类病原菌对草鱼、鲫鱼等淡水鱼类的感染，尤其是对草鱼的保护效果最好。

Description

一株贝莱斯芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生态制剂领域，具体涉及一株贝莱斯芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法。

背景技术

近年来，在水产养殖过程中，细菌性疾病发生的频率很高，其波及到的范围也很广。其中对鱼类危害较大的是爆发性出血病，这种病一旦爆发，将造成非常严重的经济损失。然而对于细菌性疾病的防治主要依靠抗生素和化学药物，但是使用的方式和剂量不科学，同样也存在许多隐患，如突变型耐药菌株的出现，水体生态环境的破坏，扰乱水产养殖动物肠道微生物的生态平衡，引起水产品安全隐患，使水产养殖动物的免疫力降低等。此外，与水生动物相关的共生细菌在频繁接触抗生素的情况下进化出抗生素耐药性表型，这些抗性基因可能转移到人类的病原体上。为了实现环境友好型、资源节约型的可持续发展模式，生产安全、绿色、环保的食品，需要寻找可替代抗生素药物的防治措施，因此，生物防治势必成为今后的研究热点。

益生菌是指对宿主有益的活性微生物，可以促进宿主生长，调节宿主的免疫功能，并通过产生抑菌活性物质来抑制病原菌的生长同时竞争营养物质、改良水质。芽胞杆菌作为益生性拮抗菌在水产养殖中进行病害防控的研究最为火热，以其独特的优势，如产生的芽胞具有耐热、耐酸碱、货架期长，商品芽胞杆菌剂应用相对广泛。

贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）是芽胞杆菌属的一个新种，作为重要的生防菌和益生菌已有不少研究与应用。例如Gao X Y,报道贝莱斯芽胞杆菌可以明显拮抗鱼类病原菌杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）和嗜水气单胞菌（A. hydrophila）的生长，同时发现其对虹鳟的生长有促进作用（Gao X Y，L刘Y，Miao L L et.al Characterization andmechanism of anti- Aeromonas salmonicida activity of a marine probioticstrain,Bacilus velezensis V4 [J].《Appl Microbiol》,2017,101(9):3759-3768.）。.该研究对于海水鱼疾病的防治具有较好应用前景。

尽管贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）作为重要的生防菌和益生菌已有很多研究报道，其中也有涉及对海水鱼类的病原菌具有拮抗作用的研究报道，但是，迄今为止，却尚未见到涉及淡水鱼的病原菌具有拮抗作用的研究报道；更未见到其对淡水鱼的疾病具有防治作用的报道；同样，也未见到可以用贝莱斯芽胞杆菌制成菌剂或微生态制剂应用于鱼类疾病防治的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株新的贝莱斯芽胞杆菌，由该贝莱斯芽胞杆菌制备的微生态制剂，可以对多种淡水鱼病原菌具有良好的拮抗作用。

本发明进一步要解决的技术问题是，提供一种适用于水产养殖进行鱼类疾病防治的微生态制剂及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一株贝莱斯芽胞杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2019218；分类命名为：贝莱斯芽胞杆菌BvL03，拉丁学名Bacillus velezensis BvL03。

本发明之贝莱斯芽胞杆菌BvL03的16S rRNA序列如序列表SEQ ID №1所示。

本发明贝莱斯芽胞杆菌BvL03筛选自湖南省长沙市望城区的鱼塘底泥中。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种适用于水产养殖的微生态制剂，由所述菌种保藏号为CCTCC NO: M 2019218的贝莱斯芽胞杆菌BvL03发酵制成，菌株发酵液中的抑菌活性物质的相对分子量为511.2313或367.2279。

本发明之适用于水产养殖的微生态制剂能抑制嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等多种鱼类病原菌的生长。菌株发酵液中的抑菌活性物质的理化性质对蛋白酶不敏感，在高温条件下下活性降低。

进一步，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。

进一步，所述水产养殖的动物为淡水鱼类。

进一步，所述淡水鱼为草鱼、鲫鱼或鲤鱼。

本发明更进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将贝莱斯芽胞杆菌BvL03接种于斜面固体LB培养基上，挑取单克隆到LB摇瓶种子培养基中进行培养；

（2）将培养好的种子液按1～1.5%的接种量接种到发酵罐中扩大培养，发酵培养基配方为：玉米粉35-50 g、豆粕粉30-40 g、葡萄糖15-20 g、蛋白胨 10-20 g、MgSO₄•7H₂O 0.1-0.5g、KH₂PO₄ 1-5 g、NaCl 1-5 g、FeSO₄•7H₂O 0.01-0.015 g；

（3）将扩大培养的种子液按8～10%的接种量接种到装有70～75%的发酵培养基的500 L发酵罐中，发酵培养基配方同步骤（2）所述发酵培养基配方，在溶氧量为35%-55%，温度为30～40 ℃培养24～48 h，实时在线补加消泡剂；

（4）放罐后，收集发酵液，浓缩，得到微生态液体菌剂，陶瓷膜过滤，喷雾干燥，得微生态菌体粉剂。

对贝莱斯芽胞杆菌作为鱼类病害防治的特点进行了研究。本发明之贝莱斯芽胞杆菌的鉴定和研究方法如下。

（一）贝莱斯芽胞杆菌的细菌形态学特征观察；

（二）利用16S rRNA基因进行鉴定；

（三）对贝莱斯芽胞杆菌活性物质进行分离鉴定；

（四）贝莱斯芽胞杆菌BvL03拌入饲料中投喂然后用嗜水气单胞菌感染观察其对内脏的保护；

（五）贝莱斯芽胞杆菌BvL03注射到鱼体内观察其对草鱼的保护力。

本发明有益效果：（1）经16S rRNA基因序列测定鉴定的贝莱斯芽胞杆菌BvL03对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等抑菌效果好；（2）贝莱斯芽胞杆菌BvL03可以作为一种益生菌制剂在水产养殖中具有很大的开发潜力，其可以在鱼体肠道内定殖，贝莱斯芽胞杆菌BvL03喂养草鱼两周后，用嗜水气单胞菌浸泡感染6 h，结果显示，喂食贝莱斯芽胞杆菌BvL03处理组草鱼的肠道、肾脏、脾脏、肝脏组织形态完好，贝莱斯芽胞杆菌BvL03对草鱼有很好的保护作用；（3）在活体实验中，通过体内的腹腔注射的方法作用于草鱼，表明贝莱斯芽胞杆菌对草鱼基本是安全的，同时可以对由鱼类病原菌嗜水气单胞菌引起的鱼类疾病有很好的生物防控效果，保护率达到85%，显示出作用鱼体后能有效对抗嗜水气单胞菌对草鱼、鲫鱼等淡水鱼类的感染。

微生物保藏情况说明

本发明之贝莱斯芽胞杆菌，于2019年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心 (简称CCTCC，地址：中国武汉 武汉大学），菌种保藏号为CCTCC NO: M 2019218；分类命名为：贝莱斯芽胞杆菌BvL03，拉丁学名Bacillus velezensis BvL03。

附图说明

图1是本发明贝莱斯芽胞杆菌BvL03形态学特征观察；

图2 是本发明贝莱斯芽胞杆菌BvL03的扫描电镜观察；

图3 是本发明基于菌株BvL03的16S rDNA序列构建系统发育树；

图4 是本发明贝莱斯芽胞杆菌BvL03的生长曲线；

图5是本发明贝莱斯芽胞杆菌BvL03 代谢产物的HPLC初次分离；

图6是本发明贝莱斯芽胞杆菌BvL03洗脱峰抑菌活性测定；

图7是本发明贝莱斯芽胞杆菌BvL03 代谢产物的HPLC二次分离色谱分析；

图8是本发明贝莱斯芽胞杆菌BvL03洗脱峰活性检测；

图9 是本发明BvL03抑菌活性峰D-C的一级质谱图；

图10 是本发明BvL03抑菌活性峰D-D的一级质谱图；

图11 是本发明BvL03抑菌活性峰D-E的一级质谱图；

图12 是本发明小动物活体成像系统观察BvL03标记菌株在草鱼中的定位情况；

图13 是本发明BvL03注射到草鱼体内后对主要内脏器官形态的影响H&E染色结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

（一）贝莱斯芽胞杆菌BvL03的采集分离纯化筛选过程

采集湖南省长沙市望城区乔口镇的鱼塘底泥样品，称取5 g底泥加入45 mL的无菌水中，用漩涡振荡器振荡摇匀，然后以10倍梯度稀释法稀释，将其稀释至10^-4g/mL、10^-5 g/mL、10^-6 g/mL，用移液器取100 μL到LB平板上，用一次性涂布器将其均匀地涂布，设置3个平行，30 ℃培养过夜，挑取单克隆进行纯化，纯化3次，将纯化的菌株挑取单克隆接入LB液体培养基中，30 ℃、135 rpm培养过夜后保藏在菌种保藏液中，于-80 ℃保存。

（二）贝莱斯芽胞杆菌BvL03的细胞形态学特征

分离纯化得到135株菌，筛选其中一株对多种鱼类病原菌均具有很好的拮抗作用的的优良菌株（参见表1），命名为BvL03，该菌株在LB固体培养基上，菌落呈乳白色、黏液性膜状物、皱褶状凸起，菌体为产芽胞的革兰氏阳性细菌（参见图1），扫描电镜下观察BvL03菌株为短杆状（参见图2）。

表1

注：“-”表示无拮抗效果;“+”表示有拮抗效果

（三）BvL03菌株16S rRNA基因的同源序列分析

挑取菌株BvL03的单克隆接种到20 mL LB液体培养基中，30 ℃，135 rpm培养过夜，使用购自上海生工生物公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株BvL03的基因组，利用16SrRNA基因扩增引物序列为：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，

以上述引物扩增菌株对应的基因序列，序列预期长度分别约1500 bp。

PCR反应体系（20 μL）：无菌双蒸水，12 μL；5×Buffer，4 μL；dNTP，1.6 μL；Bf-R（10 µM），0.6 μL；Bf-F（10 μM），0.6 μL；基因组模板，1 μL ；PrimerSTAR DNA Polymerase(Takara)，0.2 μL；

PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；30个循环：95 ℃，45 sec；55 ℃，45 sec；72 ℃，1.5min；72 ℃，10 min。

16S rRNA基因PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测并回收。然后将纯化后的PCR产物用pMD-18T vector进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行氨苄抗性筛选，挑取阳性转化子后提取质粒送上海生工生物技术有限公司测序。

菌株BvL03的16S rDNA序列经测序显示长度为1452 bp，扩增测序结果在NCBI上经过BLAST比对分析，利用MEGA6.0的Kimura-2-Parameter模型，运用邻接（NJ）构建系统发育树（参见图3）。与Bacillus velezensis strain GH1-13距离最近，根据BLAST所得结果以及相差显微镜观察推测该菌株属于Bacillus velezensis亚种，命名为Bacillus velezensisBvL03。

LB培养基（ / L）：10 g 氯化钠，10 g 蛋白胨，5 g 酵母粉，20 g 琼脂（液体培养基不加），pH 6.8-7.2；

具体实施过程：从LB平板上挑取单菌落，转接到含有1.2 mL LB培养基的1.5 mL Ep管中，在管盖上用注射器针头扎小孔，26-30℃，850 rpm/min，振荡培养12 h后，按1.5%转接于100mL LB培养基，26-30℃,120-180 rpm 振荡培养，每2h取样，测定OD₆₀₀值。

贝莱斯芽胞杆菌BvL03在LB培养基的生长曲线如图4所示。结果表明，该菌株的延滞期为0-6 h，对数生长期为6-18 h，其中菌体进入稳定期的时间20 h。此外进入衰退期的时间34 h。

（四）BvL03菌株抑菌活性物质的分离纯化

将培养36 h的贝莱斯芽胞杆菌的发酵液，4 ℃，9000 rpm离心20 min收集上清，然后加入等体积的乙酸乙酯萃取，在分液漏斗中反复震荡，使其萃取充分，4 h后将有机相收集，水相再萃取一次，将有机相全部收集到一起，37 ℃旋转蒸发有机溶剂全部挥发，然后加入5mL的甲醇溶解作为BvL03活性物质的粗提物。

将贝莱斯芽胞杆菌的粗提物样品用0.22 μm的有机相滤膜过滤，调试，上样200 μL注入色谱仪 Agilent 1260中进行分离，所用柱子为YMC-Pack ODS-AQ反相 C18 柱（4.6×150mm，S-5 μm），流动相：A相为10 %的乙腈，B相为90 %的乙腈，流速为5 mL/min，检测波长为230 nm。洗脱程序如表2所示，收集每组峰（参见图5）于冷冻浓缩离心机中冻干，并检测其对嗜水气单胞菌的抑菌活性（参见图6）。

表2

将第一次分离纯化的样品通过色谱仪Agilent 1260进行二次分离，流动相：A相为10 %的乙腈，B相为90 %的乙腈，流速为3 mL/min，检测波长为230 nm。洗脱程序如表3所示，收集每组峰（参见图7）于冷冻浓缩离心机中冻干。

表3

将鱼类病原菌嗜水气单胞菌活化后，取100 μL的菌液于固体LB培养基平板，用涂布器将其均匀涂布并在超净台中风干，将滤纸片置于平板表面。取各洗脱峰10 μL滴加在滤纸片上，30 ℃培养过夜，测量抑菌圈的直径（参见图8）。将有抑菌活性的洗脱峰冻干进行质谱鉴定，通过质核比进一步确定其结构（参见图9-11）。

（五）贝莱斯芽胞杆菌BvL03发酵菌剂的制备

（1）将贝莱斯芽胞杆菌BvL03接种于斜面固体LB培养基上，挑取单克隆到LB摇瓶种子培养基（蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；氯化钠10 g/L）中培养12 h，培养条件为30 ℃，135rpm；

（2）将培养好的种子液按1.5%的接种量接种到50 L发酵罐中扩大培养，发酵培养基配方为（1 L）：玉米粉40 g、豆粕粉35 g、葡萄糖18 g、蛋白胨 15 g、MgSO₄•7H₂O 0.3 g、KH₂PO₄3g、NaCl 3g、FeSO₄•7H₂O 0.0125g；发酵培养基装液量为70%，整个培养过程在线监控，控制溶氧浓度为45%，控制温度为30 ℃，培养12h，实时在线补加消泡剂，OD₆₀₀为4.0；

（3）将扩大培养的种子液按10%的接种量接种到装有70%的发酵培养基的500 L发酵罐中，发酵培养基配方同步骤（2）步所述发酵培养基配方，在溶氧量为45%%，温度为30 ℃培养36 h，实时在线补加消泡剂。

（4）放罐，收集发酵液，浓缩，得到液体菌剂，陶瓷膜过滤，喷雾干燥，得到菌体粉剂，直接泼洒在养殖水体或拌入饲料中等方式进行应用。

（六）BvL03菌株在活体实验中的应用

实验一：草鱼保护力实验

实验分为四组：

A组注射200 μL无菌生理盐水作为阴性对照组；

B组注射200 μL 浓度为1×10⁹ cfu/mL 的BvL03；

C组注射200 μL 浓度为1×10⁸ cfu/mL 的AhX040；

D组注射200 μL 浓度为1×10⁸ cfu/mL 的AhX040和浓度为1×109 cfu/mL 的BvL03混合液。

表4

结果如表4，C组只注射嗜水气单胞菌的一组草鱼全部死亡，B组注射贝莱斯芽胞杆菌与注射生理盐水的阴性对照A组的结果几乎没有差别，说明贝莱斯芽胞杆菌对草鱼没有毒性，当两种菌同时注射时，死亡率明显的低于单独注射嗜水气单胞菌的分组，说明贝莱斯芽胞杆菌可以在一定程度上拮抗嗜水气单胞菌。

实验二：在草鱼体内的定殖及对内脏的保护

实验分为四组：实验组：每组10条（体重约45 g），投饲料量大约为体重的1 %-2 %，将用GFP标记的贝莱斯芽胞杆菌BvL03菌株添加量约为10⁹ cfu/g饲料，每日喂1次，4天后进行小动物活体成像观察，每3天观察一次。对照组：喂普通饲料（10条），喂养2周。两周后实验组和对照组分别取5条用10¹⁰ cfu/mL的AhX040菌株浸泡感染6 h，剩下的继续观察。浸泡6 h后取出恢复自然生长条件，观察其荧光定殖情况（参见图12）。恢复自然生长48 h后每组选取2条做组织切片，包括鳃，肠道，心脏，肝，肾，脾。每条鱼分别做H&E染色（参见图13）。

结果显示，BvL03菌株处理草鱼后，动物的肠、肝、肾、心、鳃、脾没有出现明显的炎症反应，对照组和BvL03菌株处理组草鱼的主要免疫器官在组织病理形态上没有明显的变化，而AhX040菌株组中心脏虽然没有明显的差异，但是主要免疫器官肝，肾，脾，鳃有明显的炎症反应，肠组织也有脱落坏死的现象。对照组和BvL03菌株处理组鱼肠上皮细胞正常，有分散的杯状细胞，肠细胞的管腔表面具有紧密排列的平行微绒毛肠黏膜、粘膜下层、肌层和浆膜；肝脏呈正常多边形肝细胞，血管正常；肾的结构中肾小管为正常的椭圆形，造血组织正常；心的横切结果显示呈均匀的阶梯状；观察鱼鳃的结构，可见鳃结构与正常的鱼类的鳃组织结构一致；脾脏切片显示正常的红髓结构，呈正常紧密排布的椭圆形。AhX040菌株处理组肠道的整个粘膜层表面约75%坏死，肠腔内有很多坏死的细胞；脾肿大，红髓大量扩张，还伴有红细胞碎片和转运白细胞的淡粉红色透明物质；鳃的结构破坏，同时又有淋巴细胞的浸润；肝出现轻度肝炎，扩张的血管周围有局部淋巴细胞的聚集；肾小管不是规则的椭圆形，肾小管上皮细胞出现坏死。而BvL03预处理再用AhX040感染组观察到粘膜层虽然有坏死，但肠腔内坏死的细胞较少，同时显示肝、肾、脾、鳃的炎症反应都有不同程度的减缓。这说明BvL03菌株在草鱼体内的定殖在一定程度上可以保护其免受AhX040菌株的感染，增强其免疫力。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一株贝莱斯芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽胞杆菌BvL03(Bacillus velezensis)

<400> 1

aactttgtca cttcggcggc tggctccata aaggttacct caccgacttc gggtgttaca 60

aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg 120

ctgatccgcg attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga 180

actgagaaca gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc 240

cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac 300

cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa 360

gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 420

aaccatgcac cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag 480

aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc 540

gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc 600

ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact 660

catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct 720

cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct 780

acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt 840

ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg 900

cgagcccttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg 960

ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga 1020

acggcacttg ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg 1080

cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140

ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca 1200

tcgtcgcctt ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta 1260

agtggtagcc gaagccacct tttatgtctg aaccatgcgg ttcaaacaac catccggtat 1320

tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac 1380

ccgtccgccg ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactg catgtatagc 1440

acccgcatgc ac 1452

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一株贝莱斯芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽胞杆菌BvL03(Bacillus velezensis)

<400> 1

aactttgtca cttcggcggc tggctccata aaggttacct caccgacttc gggtgttaca 60

aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg 120

ctgatccgcg attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga 180

actgagaaca gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc 240

cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac 300

cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa 360

gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 420

aaccatgcac cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag 480

aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc 540

gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc 600

ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact 660

catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct 720

cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct 780

acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt 840

ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg 900

cgagcccttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg 960

ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga 1020

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cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140

ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca 1200

tcgtcgcctt ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta 1260

agtggtagcc gaagccacct tttatgtctg aaccatgcgg ttcaaacaac catccggtat 1320

tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac 1380

ccgtccgccg ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactg catgtatagc 1440

acccgcatgc ac 1452

Claims (7)

1.一株贝莱斯芽胞杆菌，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2019218；分类命名为：贝莱斯芽胞杆菌BvL03，拉丁学名Bacillusvelezensis BvL03。

2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽胞杆菌BvL03的16S rRNA序列如序列表SEQ ID №1所示。

3.一种适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，由权利要求1所述菌种保藏号为CCTCC NO: M 2019218的贝莱斯芽胞杆菌BvL03发酵制成，菌株发酵液中的抑菌活性物质的相对分子量为511.2313或367.2279。

4.根据权利要求2所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。

5.根据权利要求2或3所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述水产养殖的动物为淡水鱼类。

6.根据权利要求4所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述淡水鱼为草鱼、鲫鱼或鲤鱼。

7.一种如权利要求3或4所述适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

（1）将贝莱斯芽胞杆菌BvL03接种于斜面固体LB培养基上，挑取单克隆到LB摇瓶种子培养基中进行培养；

（2）将培养好的种子液按1～1.5%的接种量接种到发酵罐中扩大培养，发酵培养基配方为：玉米粉35-50 g、豆粕粉30-40 g、葡萄糖15-20 g、蛋白胨 10-20 g、MgSO₄•7H₂O 0.1-0.5g、KH₂PO₄ 1-5 g、NaCl 1-5 g、FeSO₄•7H₂O 0.01-0.015 g；

（3）将扩大培养的种子液按8～10%的接种量接种到装有70～75%的发酵培养基的500 L发酵罐中，发酵培养基配方同步骤（2）所述发酵培养基配方，在溶氧量为35%-55%，温度为30～40 ℃培养24～48 h，实时在线补加消泡剂；

（4）放罐，收集发酵产物，浓缩，得到微生态液体菌剂，陶瓷膜过滤，喷雾干燥，得微生态菌体粉剂。