CN113462614B - 一株深海来源的贝莱斯芽孢杆菌rs6-14及其所产抗菌提取物的提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株深海来源的贝莱斯芽孢杆菌RS6‑14及其所产抗菌提取物的提取方法和应用。所述贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6‑14分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.22682；其菌落为近圆形至椭圆形、乳白色至白色，表面微凸、呈微褶皱状、无光泽、不透明，边缘明显清晰，菌落周围具有较宽的透明圈，菌体呈杆状。本发明利用贝莱斯芽孢杆菌RS6‑14菌株经过发酵、大孔吸附树脂初提和液相色谱精提后，得到具有很好抑制多种病原细菌的抗菌提取物，其性质稳定，活性好，不仅具有成为新型抗菌剂的潜力，同时，还能有效降低病原菌对养殖动物的危害，减少养殖损失。

Description

一株深海来源的贝莱斯芽孢杆菌RS6-14及其所产抗菌提取物的提取方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株深海来源的贝莱斯芽孢杆菌RS6-14及其所产抗菌提取物的提取方法和应用。

背景技术

革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌细胞壁薄，且结构较复杂，分为外膜和肽聚糖层。外膜阻止某些药物和抗生素穿入细胞，这是革兰氏阴性细菌一般较之革兰氏阳性细菌更耐药的原因。由于抗生素的滥用，近十年来，革兰氏阴性细菌耐药问题日益严重，突出表现在耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌和非发酵糖细菌，如大肠杆菌、志贺菌中。

在水产及禽类养殖中，革兰氏阴性病原菌是一大危害，其中大肠杆菌和沙门氏菌会导致养殖动物腹泻，危害动物肠道健康。弧菌会导致虾或某些经济鱼类发生表皮或组织溃烂，严重破坏了养殖经济。据统计，水产行业中，全球每年因为病害损失的经济高达60亿美元。

由于多重耐药菌和广泛耐药菌的大量出现，新型抗菌剂的研发迫在眉睫。为控制耐药菌感染，各国致力于筛选具有新结构类型和新作用机制或新作用靶位的新药，并在抗菌剂的作用机制、耐药机制、构效关系等研究成就的指导下，修饰现有抗菌剂的化学结构，获取优化的品种。而微生物分布广阔，代谢产物多样，是理想的新抗菌化合物的宝库，无论是直接应用或是修饰改造，都大有可为。

发明内容

本发明提供了一株深海来源的贝莱斯芽孢杆菌RS6-14及其所产抗菌提取物的提取方法和应用。所述贝莱斯芽孢杆菌RS6-14对多种病原菌具有很好的抑制作用，其提取得到的抗菌提取物具有很好的抗菌活性。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了一株深海来源的贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌  Bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 22682。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌RS6-14菌落为近圆形至椭圆形、乳白色至白色，表面微凸、呈微褶皱状、无光泽、不透明，边缘明显清晰，菌落周围具有较宽的透明圈，菌体呈杆状。

本发明还提供了一种利用所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14提取抗菌提取物的方法，包括如下步骤：

（1）将所述贝莱斯芽孢杆菌RS6-14接种于TSBYEH培养基中，28℃，180rpm条件下培养12h得到一级种子液，取培养好的一级种子100μl液接种于250ml的三角瓶中，装液量为50ml，同样条件下培养8h，得到二级种子液；将得到的种子液以2%的体积比接种到改良Landy培养基中，30℃，装液量为20L，初始pH为7.0，初始搅拌速率为200rpm，通气量为10 L/min-15 L/min，发酵25-36h，得到发酵液；

（2）将发酵液离心，将发酵上清液与经预处理的大孔吸附树脂按10:1（v/m）的比例进行动态吸附，流速为1-2BV/h，在室温条件下吸附18-24 h至发酵液被完全吸附；吸附后的废液以2-3BV的体积依次用2-5倍体积的蒸馏水、2-5倍体积的25%、45%、75%、95%的乙醇进行梯度洗脱，控制流速为1-2BV/h，收集不同浓度的洗脱液；将洗脱液于40-42℃的条件下旋转蒸发浓缩，去除乙醇；将去除乙醇后的洗脱液经真空冷冻干燥，得到粗提取物；

（3）称取0.02g粗提取物溶解于600 μl蒸馏水中，离心后用0.22 μm滤膜过滤，采用液相色谱系统进一步分离纯化，液相色谱系统采用C8柱 (4.6×250 mm，5 μm)进一步分离纯化；30%乙腈平衡C8柱，流动相A为含0.1% TFA的乙腈，流动相B为含0.1%TFA的超纯水；采用梯度洗脱，洗脱条件为：0-10min，A：30-55%；10-15min，A：55%-60%；15-25min，A：60%-70%；25-30min，A：70%-85%；30-35 min，A：85%-100%；35-45 min，A：100%；45-55 min，A：100-30%；进样量为50 μL，流速为 1 ml/min，220nm及280nm波长检测，收集不同保留时间的洗脱峰。

进一步的，所述步骤（1）中改良Landy培养基的组分包括葡萄糖2%， L-谷氨酸钠0.5%， MgSO₄·7H₂O 0.05%， KCl 0.05%，KH₂PO₄ 1%，FeSO₄·7H₂O 0.15 mg ，MnSO₄·H₂O 5.0mg，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg ，酵母粉0.5%，蒸馏水1L。

本发明还提供了由所述的方法提取得到的抗菌提取物。

本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14或者所述的抗菌提取物在用于制备抑制病原菌的抗菌剂中的应用。

进一步的，所述病原菌包括大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、坎氏弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、金黄色葡萄球菌。

本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14在用于制备改善水产养殖水体的制剂中的应用。

进一步的，在应用时，将所述贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14经发酵制成菌活为1.0×10⁹CFU/ml的液体发酵剂，并以5 ml/m^3-10 ml/m³的用量一次性泼洒水产养殖水体。

进一步的，所述水产为对虾。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明从卡洛琳海山中分离得到一株深海来源的贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14，通过抑菌试验，发现其对大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、坎氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、金黄色葡萄球菌等养殖中常见的病原菌具有抑菌活性。本发明还经实验确立了贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14的发酵条件和方式，并提供了抗菌提取物的提取方法，所得抗菌提取物具有良好的抗菌活性和稳定性。本发明所述的菌株RS6-14的应用方法不仅具有成为新型抗菌剂的潜力，同时，还能有效降低病原菌对养殖动物的危害，并改善水产养殖水体，进而减少养殖损失，增加养殖收入。

附图说明：

图1为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14的菌落形态及菌体显微镜照片。

图2为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14的系统发育树。

图3为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14对多种病原菌抑制作用结果。

图4为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14的生长曲线。

图5为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14发酵罐生长曲线和抑菌效价。

图6为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14的还原糖标准曲线。

图7为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14的谷氨酸标准曲线。

图8为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14的中试发酵参数监测结果。

图9为实施例3中有机膜过滤后的抑菌活性，其中a：>3000Da，b：<3000Da。

图10为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14提取物对大肠杆菌的抑制作用结果。

图11为温度、pH和蛋白酶对粗提物活性的影响。

图12为粗提物对大肠杆菌的作用机制的荧光显微镜下实验组（左）和对照组（右）的区别。

图13为粗提物HPLC的分离纯化图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、菌株RS6-14的筛选、鉴定与性质研究

一、菌株RS6-14的筛选

1、平板初筛

实验样品采集于地处于西太平洋的卡洛琳海山的海水，取100µl的海水样品，均匀涂布于LBH固体平板（海水素3%，蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，琼脂1.5%，蒸馏水1 L，pH 7.0，灭菌）上，于28℃倒置培养24h。挑取形态不一致的菌落进行三区划线，得到单菌落。挑取单菌落，接种在LBH平板上，在28℃下培养48h。向单菌落周围平铺上加入了大肠杆菌菌液的软琼脂，待其凝固后，置于37℃下过夜培养，观察是否产生透明圈，选择产生透明圈的菌株进行复筛。

2、液体复筛

将初筛得到的菌株接种于5ml TSBYEH液体培养基（胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，海水素3%，蒸馏水1L，灭菌）中制备成种子液，然后按照2%的接种量接种于发酵培养基（葡萄糖2%，L-谷氨酸钠0.5%，KH₂PO₄ 0.1%，KCl 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，FeSO₄·7H₂O 0.15 mg，MnSO₄·H₂O 5.0 mg，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg ，蒸馏水1L，pH 7.0，灭菌）中，培养24-36h。取发酵液上清10µl，点在涂有大肠杆菌指示菌的LB平板上，置于37℃过夜培养，观察是否产生抑菌圈。经过比较，得到了一株编号为RS6-14的菌株，其对大肠杆菌具有良好抑菌活性，透明圈清晰可见。

二、菌株RS6-14的形态及鉴定

1、菌株RS6-14的形态

挑取单菌落，用接种环在LBH固体培养基上进行三区划线，放置于28℃培养箱内倒置培养2d，观察菌落形态特征。

取适量培养至对数中后期的种子液，均匀涂刮于干净玻片上，利用酒精灯火焰微微加热进行固定，依次经历初染、煤染、脱色、复染后，用普通光学显微镜观察其革兰氏染色情况和细胞形态。

如图1所示，菌株RS6-14在LBH平板上菌落为近圆形至椭圆形、乳白色至白色，表面微凸、呈微褶皱状、无光泽、不透明，边缘明显清晰，菌落周围具有较宽的透明圈。经革兰氏染色，鉴定为革兰氏阳性菌，RS6-14菌体呈杆状。

2、菌株RS6-14的鉴定

（1）16S rRNA鉴定

从LBH平板上挑取RS6-14单菌落于装有50µl无菌水的1.5ml EP管中，100℃煮10min，取1µl作为模板，利用细菌通用引物27F和1492R对细菌的16S rRNA基因序列进行扩增。PCR扩增 体系 为25μL，1μL菌液作为模板，上下游引物各1μL，2×Mix 12.5μL，ddH₂O9.5μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火1min和72℃延伸40s，30次循环后，72℃后延伸10min。PCR未纯化产物提交给派森诺生物公司进行测序，测序的序列如SEQ ID No.1所示，并提交至NCBI数据库进行Blast比对，结果显示RS6-14属于芽孢杆菌属（ Bacillus sp.），但无法确定RS6-14属于某一个具体的种，需在全基因组测序后，经ANI分析，得出具体种属信息。

（2）全基因组分析

利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株RS6-14的基因组，对提取的DNA样品构建插入一定大小的片段，每个样品提供的原始测序数据量都不低于基因组100×覆盖深度，单端测序读长150bp，并采用双端测序，最终组装得到多条基因组scaffold。菌株RS6-14的全基因组大小为3893205 bp，GC含量为46.41%，scaffolds数量为53个，编码率为88.66%。

经16S rRNA测序鉴定，确定菌株RS6-14属于芽孢杆菌属。在NCBI Genome中下载与RS6-14亲缘关系较近的且测序质量最高的芽孢杆菌的全基因组序列，在EZbiocloud tools中进行ANI（Average Nucleotide Identity）比对分析。结果见表1，菌株RS6-14与 Bacillus  velezensis的ANI value数值均高于98%，最高为99.95%，其他三种数值均低于95%的鉴定阈值，因此，菌株RS6-14为一株贝莱斯芽孢杆菌。

表1：RS6-14与其他菌株的ANI对比值

经上述两种鉴定方法结合，最终鉴定菌株RS6-14为贝莱斯芽孢杆菌（ Bacillus  velezensis）。

将菌株RS6-14进行菌种保藏，所述贝莱斯芽孢杆菌RS6-14的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年6月10日；贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus  velezensis的保藏编号为CGMCC No.22682。

三、菌株RS6-14的生理生化特征的检测

（1）耐盐实验

取处于对数生长期的种子液0.25ml接种于装液量为25ml/250ml的灭菌LB液体培养基的锥形瓶中，初始NaCl浓度范围为0-150 mg/ml，以每10mg/ml为一个梯度，共16组。置于30℃，180rpm的摇床中培养，每个浓度设置3组平行对照，每隔12h观察其生长情况。

（2）pH耐受性

取处于对数生长期的种子液0.25ml接种于装液量为25ml/250ml的灭菌LBH液体培养基的锥形瓶中，初始pH分别为：4、5、6、7、8、9、10，置于30℃，180rpm的摇床中培养，每个浓度设置3组平行对照，每隔12h观察其生长情况。

（3）需氧性实验

挑取培养1天的单菌落，用灭菌牙签穿刺于半固体斜面培养基，置于28℃培养箱中进行培养，每隔12h观察其生长情况。

（4）甲基红实验

取处于对数生长期的种子液接种于蛋白胨水培养基，接种量为2%，然后置于28℃，180rpm条件下培养2d，用甲基红试剂进行测定，颜色为红表示反应阳性，变黄为阴性。

（5）V-P实验

取处于对数生长期的种子液接种于蛋白胨水培养基，置于28℃，180rpm条件下培养2d，滴加40%NaOH 7-8滴，同时加入少量肌酸，轻轻摇动试管，观察其颜色变化。颜色变红表示反应阳性，变黄为阴性。

（6）淀粉水解实验

挑取单菌落接种于淀粉实验固体培养基上培养2d后，将培养皿盖打开，向其中加入适量稀碘液，观察菌落周围是否产生透明圈，若有，则为阳性。

（7）硝酸盐还原实验

将培养至对数生长期的种子液接种于还原培养基中培养2d，用Griess试剂进行测定，颜色变红表示反应阳性，变黄为阴性。

（8）H₂S试验

取新鲜培养至对数生长期的种子液接种于H₂S试验培养基中，28℃，180rpm条件下培养2d，观察是否产生黑色不溶物。

（9）吲哚试验

取新鲜培养至对数生长期的种子液接种于吲哚试验培养基中，在28℃条件下培养2d后，先向试管中加入 1-2 mL乙醚，轻轻振荡后静置几分钟，加入数滴吲哚试剂，若试管中出现红色表示反应阳性，否则即为阴性。

（10）糖、醇发酵实验

向配制好的糖、醇基础发酵培养基中加入实验的糖、醇，然后取新鲜培养至对数期的种子液接种于对应培养基中，接种量为2%，培养2d，观察颜色是否发生变化，若变为黄色，则为阳性。

上述实验的结果见表2，菌株RS6-14在pH=5-10范围内能够生长，可耐受NaCl范围为1%-12%，为兼性厌氧菌，能水解淀粉，可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐， V-P试验阳性，不能产生色氨酸酶，甲基红试验阴性，不能将含硫氨基酸分解。

表2：菌株RS6-14的生理生化特征

实验项目	结果	实验项目	结果
				pH耐受	5-8	硝酸盐还原试验	弱阳性
需氧性	兼性厌氧	吲哚试验	-
				甲基红试验	-	NaCl耐受	1%-12%
V-P试验	+	<![CDATA[H<sub>2</sub>S试验]]>	-
				水解淀粉	+	葡萄糖	+
乳糖	+	蔗糖	+
				甘露醇	+	麦芽糖	-

注：“+”表示反应阳性，“-”表示反应阴性。

四、菌株RS6-14的抑菌特性

选取养殖中会造成动物病害的病原菌大肠杆菌（ Escherichia coli）、溶藻弧菌（ Vibrio alginolyticus）、副溶血性弧菌（ Vibrio parahaemolyticus）、坎氏弧菌、（ Vibriocampbellii）、霍乱弧菌（ Vibrio cholerae）、创伤弧菌（ Vibrio vulnificus），河流弧菌（ Vibrio fluvialis）、金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）验证菌株RS6-14的抑菌特性。

将菌株RS6-14的单菌落点种于LB固体培养基上，培养2d。以上述8种致病菌的新鲜菌液为指示菌，按1%添加量添加于0.8%软琼脂培养基中，再将软琼脂缓慢倾倒于长有单菌落的平板上，置于37℃或28℃下培养，观察抑菌圈的大小并测量。

菌株RS6-14的抑菌活性结果如表3和图3所示，菌株RS6-14对革兰氏阳性和阴性菌均有一定的拮抗活性，对霍乱弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌具有很好的抑制活性，对创伤弧菌、河流弧菌、坎氏弧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抑制活性，说明贝莱斯芽孢杆菌RS6-14能抑制多种病原菌的生长，具有较为宽泛的抗菌谱。

表3： 菌株RS6-14的抑菌特性

指示菌	抑菌圈大小（mm）
		大肠杆菌	16
溶藻弧菌	24
		副溶血性弧菌	24
坎氏弧菌	11
		霍乱弧菌	26
河流弧菌	18
		创伤弧菌	21
金黄色葡萄球菌	13

实施例2、贝莱斯芽孢杆菌RS6-14的发酵条件优化

1、菌株RS6-14的初始发酵条件及优化

（1）种子液的制备

挑取培养2d的RS6-14单菌落接种于5ml TSBYEH液体试管中，在28℃，180rpm条件下培养12h得到一级种子液。取培养好的一级种子100μl液接种于250ml的三角瓶中，装液量为50ml，同样条件下培养8h，得到二级种子液。

（2）初始发酵条件的确定

取二级种子液以2%接种量接种于灭菌后的发酵培养基。在28℃，180rpm条件下培养，每2h测定其OD₆₀₀，培养36h后停止发酵，获得发酵液。用Spot-on-lawn及二倍稀释法检测抑菌活性。定义1AU/ml=加入10μl上清液不产生透明圈时的稀释倍数×100。

获得贝莱斯芽孢杆菌RS6-14的生长曲线见图4，该菌在0-6h处于延滞期，6-32h处于对数期，32-36h处于稳定期。以大肠杆菌为指示菌，发酵液抑菌活性可达3200AU/ml。

（3）温度对发酵条件的影响

将发酵液以2%接种量接种于发酵培养基，分别置于28℃、30℃、32℃、37℃下培养36h，用Spot-on-lawn及二倍稀释法检测抑菌活性的差异。

结果见表4，37℃时，抑菌效价最低，为1600AU/ml，28℃，30℃，32℃抑菌效价均为3200AU/ml，结合抑菌圈直径，发现在30℃时，其抑菌圈直径最大，达到18.5mm，故选择30℃作为发酵温度。

表4：温度对抑菌活性的影响

温度（℃）	抑菌效价（AU/ml）	抑菌圈（mm）
			28	3200	17.5
30	3200	18.5
			32	3200	16.5
37	1600	16.0

（4）碳源对发酵活性的影响

选择葡萄糖、蔗糖、甘油、淀粉、D,L-苹果酸作为培养基碳源，按2%添加量加入发酵培养基中，于30℃培养36h，得到发酵液，用Spot-on-lawn及二倍稀释法检测抑菌活性的差异。

结果见表5，葡萄糖和蔗糖作为碳源时，抑菌效价相同，均为400AU/ml，其次为淀粉和甘油，均为200AU/ml，D,L-苹果酸作为碳源时，不产生抑菌活性。结合抑菌圈大小，选择葡萄糖作为发酵培养基碳源。

表5：不同碳源的抑菌活性

碳源种类	抑菌效价（AU/ml）	抑菌圈（mm）
			葡萄糖	400	18.6
蔗糖	400	17.9
			淀粉	200	17.4
甘油	200	17.5
			D,L-苹果酸	0	0

（5）氮源对发酵活性的影响

选择不同氮源及氮源组合，L-谷氨酸钠、酵母浸粉、NH₄Cl、NH₄NO₃、L-谷氨酸钠+酵母浸粉，按0.5%添加量加入发酵培养基中，30℃培养36h，得到发酵液，用Spot-on-lawn及二倍稀释法检测抑菌活性的差异。

结果见表6，其中L-谷氨酸钠和酵母浸粉均可单独作为RS6-14合成抑菌物质的有效氮源，无机氮中NH₄NO₃也能为抑菌物质合成供给氮元素，但效果与前者相比稍差。同时，在进一步探究中发现，在L-谷氨酸钠作为氮源的基础上，添加0.5%的酵母浸粉，能有效提高发酵液的抑菌效价，达到6400 AU/ml。因此发酵培养基中氮源选用L-谷氨酸钠加上0.5%的酵母粉的组合。

表6：不同氮源的抑菌活性

氮源	抑菌效价（AU/ml）
		L-谷氨酸钠	800
酵母粉	200
		<![CDATA[NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>]]>	100
<![CDATA[NH<sub>4</sub>Cl]]>	0
		L-谷氨酸钠+酵母粉	1600

（6）初始pH对发酵活性的影响

配制初始pH分别为6、7、8液体发酵培养基，按2%接种量接种二级种子液，于30℃，180rpm条件下发酵36h，得到发酵液，用Spot-on-lawn及二倍稀释法检测抑菌活性的差异。

结果见表7，在探究初始pH对抑菌活性的影响时，发现pH=6、7、8时对抑菌效价的影响并不大，考虑到抗菌物质的性质，选择pH=7.0作为发酵初始pH。

表7：初始发酵pH对抑菌活性的影响

初始pH	抑菌效价（AU/ml）
		6	3200
7	3200
		8	3200

2、菌株RS6-14的中试发酵实验

以FZ-EI型50L全自动发酵罐作为中试实验的发酵装置，装载改良Landy培养基（葡萄糖2%， L-谷氨酸钠0.5%，MgSO₄·7H₂O 0.05%， KCl 0.05%，KH₂PO₄ 1%，FeSO₄·7H₂O 0.15mg，MnSO₄·H₂O 5.0 mg，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg，酵母粉0.5%，蒸馏水1L，pH 7.0，灭菌）。发酵温度为30℃，装液量为20L，初始pH为7.0，接种量为2%，初始搅拌速率为200rpm，并添加少量消泡剂，通气量10L/min-15L/min，培养25-36h。发酵过程中，通过经校准的电极监测其溶氧、温度、pH等参数。每隔2h取样一次，测定其含糖量、含氮量、OD₆₀₀等数据及其抑菌活性。

（1）OD₆₀₀的测定

取适量发酵菌液，以无菌水作为空白对照，用紫外分光光度计测量菌液的OD₆₀₀值，并绘制成生长曲线。

生长曲线见图5，可以看出菌株RS6-14在0-2h处于延滞期，2-14h处于对数期，14-18h处于稳定期，18-25h为衰亡期。在8h时，产生抑菌活性物质，稀释至16倍可见活性，抑菌活性随发酵时间而增强。25h停止发酵，抑菌效价达到3200AU/ml。相比于摇瓶发酵，带压发酵罐明显加快了发酵速度，其发酵液的菌活在1×10¹⁰CFU/ml以上，明显高于摇瓶发酵实验。

（2）还原糖的测定

还原糖测定参照3,5-二硝基水杨酸法（DNS法），先将葡萄糖烘干配制标准溶液和DNS试剂备用，并绘制标准曲线。取适量发酵菌液，离心除去菌体，取干净试管，向其中加入不同浓度葡萄糖溶液、蒸馏水和DNS试剂，沸水浴10min，在冰水中冷却后，于540nm波长处测定其吸光值，代入回归方程，计算出还原糖的浓度。

（3）含氮量的测定

含氮量的测定采用茚三酮法，先配置标准谷氨酸溶液、茚三酮溶液及磷酸缓冲液，并绘制标准曲线。取适量发酵菌液，离心除去菌体，取干净试管，加入不同浓度谷氨酸溶液、缓冲液和茚三酮溶液，沸水浴15min，迅速冷却后，在波长为570nm下测定其吸光值，并计算出含氮量。

还原糖标准曲线和谷氨酸标准曲线分别见图6和图7。菌株RS6-14的中试发酵参数监测结果见图8，菌株RS6-14发酵过程中糖的大量消耗与生长进入对数期紧密相关，含氮物质含量的下降与抑菌活性产生时间相关，初步猜测抗菌活性物质可能是一种蛋白或者肽类等富含氨基酸的物质。发酵过程中pH先降后升，是由于发酵初期消耗碳源产生酸性物质，后期上升时，菌体处于衰亡期，是部分菌体自溶流出的碱性物质使发酵液pH升高。菌株RS6-14抑菌活性物质的产量也与培养基成分有关，增加0.5%酵母粉作为补充氮源，有利于维持发酵中后期菌体的生长，增加了菌体密度，进而增加代谢产物的含量，使得抑菌活性得以提高。

实施例3、RS6-14代谢产物分析

1、发酵液的制备

按照实施例2所述的发酵方案，得到发酵液100L。陶瓷膜设备过滤除菌后，利用多功能有机膜中的3000Da膜进行过滤，获得发酵上清液，分别检测滤过液和浓缩液的抑菌活性。

结果见图9，在3000Da膜的滤过液中没有检测到抑菌活性，而在浓缩液中发现抑菌活性，故初步猜测抗菌物质的分子量大于3000Da，实现了对抗菌物质的初步粗分。

2、大孔吸附树脂提取抗菌物质

（1）树脂的预处理

称取500g D101大孔吸附树脂，加入95%乙醇浸泡24h，使树脂颗粒充分溶胀。将溶胀好的大孔树脂加入到层析柱中，排出乙醇，用大量蒸馏水冲洗，直至无明显醇味。然后依次用3BV的5%的盐酸和3BV的5%的氢氧化钠溶液依次冲洗，最后用水冲洗至流出液pH为中性。

（2）过柱吸附：将发酵上清液与大孔吸附树脂按10:1（v/m）的比例进行动态吸附，流速为1-2BV/h，直至发酵液被完全吸附，并收集吸附后的废液。

（2）解吸：以2-3BV的体积，依次用2-5倍体积的蒸馏水、2-5倍体积的25%、45%、75%、95%的乙醇进行梯度洗脱，控制流速为1-2BV/h，并收集不同浓度的乙醇洗脱液。

（3）浓缩：将乙醇洗脱液在40-42℃下旋转蒸发浓缩，除去乙醇。

（4）冻干：将浓缩液在-80℃下预冻样品，然后转入真空冷冻干燥机中，直至干燥成冻干粉，用甲醇复溶，进行抑菌试验验证。

实验结果如图10所示，将D101大孔树脂75%乙醇洗脱液旋蒸、冻干后的粉末，取0.02g加入600μl甲醇中，充分溶解，用二倍稀释法，验证活性大小，稀释至1024倍后，依然能够产生清晰的透明圈，但该产物仍为贝莱斯芽孢杆菌RS6-14发酵产生粗提物。

3、粗提物稳定性研究

（1）热稳定性研究

取粗提物平均分成12份，每三份为一组，依次标记为对照组（CK），实验组1（60℃）、实验组2（80℃）、实验组3（100℃）。其中对照组在常温放置30min和1h，其他实验组在对应温度下处理相同时间，取出放置至室温，用Spot-on-lawn法进行二倍稀释，测试其抑菌活性变化。

（2）pH稳定性研究

取一定量粗提物平均分成33份，每三份为一组，其中一组为对照组（CK），其他10组分别调节pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10，11，并在对应pH条件下反应2h，反应完成后，调节至中性，用Spot-on-law法进行二倍稀释，测试其抑菌活性变化。

（3）蛋白酶稳定性

取一定量粗提物平均分成12份，每三份为一组，依次加入标记为对照组（CK）、胰蛋白酶组、胃蛋白酶组、木瓜蛋白酶组的离心管中，使各蛋白酶的终浓度为10mg/ml，调节各种蛋白酶至其最适反应pH范围，在37℃下孵育4h，用Spot-on-lawn法进行二倍稀释，测试其抑菌活性变化。

结果见图11，发现粗提物在60℃、80℃下处理30 min和60min，其对大肠杆菌的抑制活性没有明显变化，100℃下处理30min活性无丧失，60min保持50%活性，该抗菌物质可耐受一定时间高温；且在pH =2-11处理2 h后，抑菌性能基本维持稳定，该抗菌物质可以耐受大范围的pH变化，而不丧失活性，其pH稳定性良好。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶在对应条件下处理后，粗提物依然具有较强的抑菌效价，且没有损失，其抑菌强度与对照相比没有减弱，但是经过胃蛋白酶处理后，其对大肠杆菌的作用有所减弱。说明胃蛋白酶可以将抗菌物质粗提物中的某些部分水解，且失去一定抗菌活性。

4、粗提物对大肠杆菌的作用机制

运用染料对指示菌染色，在荧光显微镜下进行观察，探究粗提物作用于指示菌的方式，具体步骤包括：准备粗提物BAVP（20 mg/ml），碘化丙啶（PI）染液溶液（1 mg/5ml）；大肠杆菌培养4h（3%接种量）；取1ml菌液，离心菌体（8000 rpm，5min）；PBS清洗，离心两次（8000rpm，2min）；PBS重悬菌体：A组：大肠杆菌+500µl PBS；B组：大肠杆菌+400µl PBS+100µl BAVP（8MIC），反应0.5h、1h；分别向A、B组中加入500µlPI染料，使其终浓度为10µg/ml，常温反应20min，离心（4000rpm，10min）；PBS溶液清洗两次，用3%多聚甲醛固定细菌细胞；取8-10µl菌液滴在载玻片上，自然半干后，盖上盖玻片，开始观察（激发波长535nm，发射波长615nm）。

结果见图12，染料碘化丙啶（PI）的染色方式是与双链DNA进行结合，活细菌细胞膜的因具有选择透过性屏障，碘化丙啶不能进入细胞质对染色体进行着色。但细胞膜被破坏的细胞则会被染色，在荧光显微镜特定波长下就能观察到荧光。据此可以初步探究，粗提物是否以破坏大肠杆菌细胞膜的形式发挥作用。相比于对照组，实验组中，发出红色荧光的区域明显大于对照组， 且发红色荧光细胞染色结构说明经大量抗菌活性物质处理的大肠杆菌膜透性遭到破坏，揭示大肠杆菌的死亡原因与细胞膜结构被抗菌活性物质破坏有关。

5、HPLC纯化

称取0.02g粗提物冻干粉溶解于600 μl蒸馏水中，离心后用0.22 μm滤膜过滤，进行液相色谱分析。液相色谱系统采用C8柱 (4.6×250 mm，5 μm)进一步分离纯化。30%乙腈平衡C8柱，流动相A为乙腈(含0.1% TFA)，流动相B为超纯水(含0.1%TFA)。采用梯度洗脱，洗脱条件为：①0-10min，A：30-55%；②10-15min，A：55%-60%；③15-25min，A：60%-70%；④25-30min，A：70%-85%；⑤30-35 min，A：85%-100%；⑥35-45 min，A：100%；⑦45-55 min，A：100-30%。进样量为50 μL，流速为 1 ml/min，220nm及280nm波长检测，收集不同保留时间的洗脱峰。

用C8反向液相色谱柱对所分离得到的细菌素进行纯化，流动相分别是乙腈和水，均添加0.1%TFA，流速1 ml/min，收集不同保留时间的洗脱峰，并进行抑菌试验。结果见图13，最终发现17.9min及26.7min对应的洗脱峰具有抑菌活性。

实施例4、RS6-14液体发酵剂的制备及其在对虾养殖中的应用

1、液体发酵剂的制备

将贝莱斯芽孢杆菌RS6-14接种于TSBYEH培养基中，28-32℃，发酵15-22h，将得到的种子液以2-5%的体积比接种到改良Landy培养基中，28-32℃，发酵25-36h，得到RS6-14液体发酵剂，其中包含菌体及其代谢产物，菌活为1.0×10⁹CFU/ml。

2、RS6-14在对虾养殖中的应用

试验分为5组，每个虾池30³水体，应用24h检测水体中弧菌总数，其具体分组如下：

对照组：实验期间无处理，不使用消毒剂、益生菌、噬菌体、蛭弧菌、抗菌肽等制剂；正常喂料，正常使用多维、钙镁等必要产品（以下实验组同）；

高剂量组：RS6-14液体发酵剂10ml/m³一次性泼洒水体；

低剂量组：RS6-14液体发酵剂5ml/m³一次性泼洒水体；

阳性对照1组：碘伏Ⅰ10g/ 30m³泼洒水体；

阳性对照2组：长效菌毒清30g/30m³泼洒水体。

结果如表8所示，与对照组相比，使用贝莱斯芽孢杆菌RS6-14液体发酵剂24h后，高剂量组水体中弧菌总数降低了86.25%，低剂量组降低了30%，对照组及阳性对照组1、2弧菌总数均有所增加，并维持在一个较高水平，这充分证明了贝莱斯芽孢杆菌RS6-14及其抗菌提取物可以有效抑制水产养殖中病原弧菌的生长繁殖。

表8：应用24h后南美白对虾水体中弧菌数量

分组	<![CDATA[0h（×10<sup>4</sup>   CFU/ml）]]>	<![CDATA[24h（×10<sup>4</sup>   CFU/ml）]]>
			对照组	1.2	1.5
高剂量组	1.44	0.198
			低剂量组	1.6	1.12
阳性对照1组	1.9	2.2
			阳性对照2组	1.8	2.2

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

                         序列表

<110>  青岛百奥安泰生物科技有限公司

       青岛海洋生物医药研究院股份有限公司

<120>  一株深海来源的贝莱斯芽孢杆菌RS6-14及其所产抗菌提取物的提取方法和应用

<160>  1

<170>  SIPOSequenceListing 1.0

<210>  1

<211>  1457

<212>  DNA

<213>  贝莱斯芽孢杆菌( Bacillus velezensis)

<400>  1

ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120

ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag 180

atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac 240

gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300

ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420

acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag 480

acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540

cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600

tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg 660

gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca 720

gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac 780

cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc 840

ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta 900

cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960

ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt 1020

tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc 1080

cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140

cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg 1200

gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg 1260

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taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg catgtattag gcacgccgcc 1440

agcgttcgtc ctgagcc                                                1457

Claims (8)

1.一株深海来源的贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14，其特征在于：其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 22682；所述贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14菌落为近圆形至椭圆形、乳白色至白色，表面微凸、呈微褶皱状、无光泽、不透明，边缘明显清晰，菌落周围具有较宽的透明圈，菌体呈杆状。

2.一种利用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14提取抗菌提取物的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）将所述贝莱斯芽孢杆菌RS6-14接种于TSBYEH培养基中，28-32℃，发酵15-22h，将得到的种子液以2-5%的体积比接种到改良Landy培养基中，28-32℃，发酵25-36h，得到发酵液；所述TSBYEH培养基的组分包括胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，海水素3%和蒸馏水1L；

（2）将发酵液离心，取发酵上清液与经预处理的大孔吸附树脂进行动态吸附，在室温条件下吸附18-24 h；吸附后的废液分别用2-5倍体积的水洗，再依次用2- 5倍体积的梯度乙醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液于40-42℃的条件下浓缩，去除乙醇；将浓缩液经冷冻、真空干燥后，得到粗提物；

（3）取粗提物复溶后，利用滤膜过滤，采用液相色谱进一步分离纯化，流动相A为乙腈，流动相B为超纯水，然后梯度洗脱，最终得到抗菌提取物。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：所述步骤（1）中改良Landy培养基的组分包括2%的葡萄糖，L-谷氨酸钠0.5%，MgSO₄·7H₂O 0.05%， KCl 0.05%，KH₂PO₄ 1%，FeSO₄·7H₂O 0.15 mg，MnSO₄·H₂O 5.0 mg，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg，酵母粉0.5%和蒸馏水1L。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：所述步骤（2）中发酵上清液与大孔吸附树脂体积质量比为10:1。

5.由权利要求2所述的方法提取得到的抗菌提取物。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14或者权利要求5所述的抗菌提取物在制备抑制病原菌的抗菌剂中的应用，其特征在于：所述病原菌为大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、坎氏弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、金黄色葡萄球菌。

7.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14在制备改善水产养殖水体的制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：在应用时，将所述贝莱斯芽孢杆菌菌株RS6-14经发酵制成菌活为1.0×10⁹CFU/ml的液体发酵剂，并以5 ml/m³-10 ml/m³的用量一次性泼洒水产养殖水体。

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