CN110331103B - 一株溶藻链霉菌n1-32、其微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

一株溶藻链霉菌n1-32、其微生态制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一株溶藻链霉菌N1‑32、其微生态制剂及其制备方法。该溶藻链霉菌N1‑32保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO：M 2019381。该溶藻链霉菌N1‑32能有效抑制鱼类常见病原菌生长，特别是维氏气单胞菌。将溶藻链霉菌N1‑32的微生态制剂作用于草鱼肝脏细胞表明该菌对鱼类无毒害作用。通过将溶藻链霉菌N1‑32的微生态制剂作为饲料添加剂饲喂草鱼、鲫鱼等淡水鱼类，结果显示草鱼的生长率、饵料效率均得到提高，同时能增强淡水鱼类的免疫力，从而显著提高草鱼等淡水鱼类对鱼类病原菌的抵抗力。

Description

一株溶藻链霉菌N1-32、其微生态制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生态制剂领域，具体涉及一株溶藻链霉菌N1-32、其微生态制剂及其制备方法。
背景技术
目前，在鱼类养殖的疾病防控中以使用抗生素为主，抗生素能够控制病害的爆发，但是也会破坏养殖水体环境和鱼类肠道中正常存在的微生物群落结构，导致鱼类对病源微生物的抵抗力降低和耐药病原菌的产生；另外，抗生素的大量使用会使得水产品药物残留，危害人类健康，同时会破坏生态环境，不利于生态养殖的发展。而水产微生态制剂具有无毒副作用、无致病性、能产生活性物质抑制病原菌的增殖，稳定性好，能促进水产动物生长等优点。随着人们的安全意识越来越强，对抗生素使用的警惕性越来越高，水产微生态制剂将成为今后水产养殖病害防治的首选。
目前，水产微生态制剂常用有益微生物的种类有芽胞杆菌、乳酸菌、光合细菌、酵母菌、硝化细菌、反硝化细菌和蛭弧菌。而放线菌在水产养殖应用方面的研究很少。
Das等从海岸沉积物中分离获得的链霉菌作为饲料添加剂能改善斑节对虾养殖池水质(Das S,Lyla P S,Ajmal Khan S.Application of Streptomyces as a probioticin the laboratory culture of Penaeus monodon(Fabricius)[J].The Israelijournal of aquaculture＝Bamidgeh,2006,58(3):198-204.)。You等的研究结果表明，海洋放线菌能抑制致病性弧菌菌膜的形成，从而起到预防和治疗致病性弧菌引起的病害(YouJ L,Cao L X,Liu G F,Zhou S N,Tan H M,Lin Y C.Isolation and characterizationof actinomycetes antagonistic to pathogenic Vibrio spp.from nearshore marinesediments[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2005,21(5):679-682.)。Kumar等筛选的25株海洋放线菌，并将其与饲料混合饲喂凡纳滨对虾，发现其能降低凡纳滨对虾对白斑综合症的感染能力(Kumar S S,PHILIP R,Achuthankutty CT.Antiviral property of marine actinomycetes against white spot syndromevirus in penaeid shrimps[J].Current Science,2006,91(6):807-811.)。
以上研究结果说明放线菌具有成为海水水产养殖益生菌的潜力。
但迄今为止，尚未见有将溶藻链霉菌应用于水产养殖病害防治的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株新的溶藻链霉菌，及由该溶藻链霉菌制备的微生态制剂，该微生态制剂对多种淡水鱼病原菌具有良好的拮抗作用，对淡水鱼类常见疾病具有较好的防治作用。
本发明进一步要解决的技术问题是，提供一种适用于水产养殖进行鱼类疾病防治的微生态制剂的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一株溶藻链霉菌N1-32，于2019年5月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019381；分类命名为：溶藻链霉菌N1-32，拉丁学名Streptomyces amritsarensis。
本发明之溶藻链霉菌N1-32的16S rRNA序列如序列表SEQ ID№1所示。
本发明之溶藻链霉菌N1-32是从湖南省长沙市岳麓区洋湖湿地公园的鱼塘底泥中筛选得到。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种适用于水产养殖的微生态制剂，由所述菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019381的溶藻链霉菌N1-32发酵制成。
进一步，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。
进一步，所述水产养殖的动物为淡水鱼类。
进一步，所述淡水鱼为草鱼、鲫鱼或鲤鱼。
本发明更进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将溶藻链霉菌N1-32斜面种子在摇瓶种子培养基中进行活化培养；
(2)将活化好的种子液接种到发酵罐中进行扩大培养；
(3)将扩大培养的种子液接种量接种到发酵罐中进行培养，实时在线补加消泡剂；
(4)放罐，收集发酵产物，浓缩，得到微生态液体菌剂，陶瓷膜过滤，喷雾干燥，得微生态菌体粉剂。
进一步，步骤(1)中，所述活化培养的时间为64-72h，所述摇瓶种子培养基的配方为：可溶性淀粉18-22g/L；NaCl 0.4-0.6g/L；KNO3 1-1.2g/L；K2HPO4·3H2O 0.4-0.6g/L；MgSO4·7H2O 0.3-0.5g/L；FeSO4·7H2O 0.008-0.01g/L；所述活化培养的温度为25～30℃，所述摇瓶的转动速率为150～200rpm。
进一步，所述扩大培养包括以下步骤：将活化好的种子液按1～1.5％的接种量接种到发酵罐中；所述发酵罐中发酵培养基的配方为：TSB 40-50g/L，酵母提取物5-10g/L，葡萄糖10-15g/L，MgSO4·7H2O 2.2-2.5g/L；所述发酵培养基装液量为发酵罐容积的60～70％，整个培养过程在线监控，控制溶氧浓度为40％-50％，控制温度为25～30℃，培养90-100h，实时在线补加消泡剂，控制OD600为4.0。
进一步，步骤(3)所述将扩大培养的种子液按10～15％接种量接种到装液量为60～70％的发酵罐中，发酵培养基配方同步骤(2)所述发酵培养基配方，在溶氧量为40％-50％，温度为25～30℃的条件下进行培养48～96h。
本发明之溶藻链霉菌(Streptomyces amritsarensis)鉴定和研究方法如下。
一、拮抗菌的细胞形态学特征观察；
二、利用16SrRNA基因进行鉴定；
三、溶藻链霉菌(Streptomyces amritsarensis)N1-32抑菌活性物质的理化性质及毒性试验；
四、溶藻链霉菌(Streptomyces amritsarensis)N1-32菌剂的制备；
五、溶藻链霉菌(Streptomyces amritsarensis)N1-32菌剂作为饲料添加剂对草鱼进行饲喂。
本发明溶藻链霉菌菌株具备以下优点：溶藻链霉菌对鱼类常见病原菌的拮抗效果好，尤其对类志贺邻单胞菌和厦门希瓦氏菌的抑菌效果最为明显，抑菌圈直径分别达到22.3mm和21.3mm；(2)使用溶藻链霉菌N1-32菌株发酵制备的微生态制剂在水产中应用具有较大的潜能，将其作为饲料添加剂饲喂草鱼后，对草鱼血清和粘液中免疫相关酶超氧化物歧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶的活性进行了测定，同时分析了肝脏、肾脏、脾脏和头肾等主要免疫器官的抗氧化相关基因(核因子相关因子E2(Nrf2)和核因子相关因子2-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1))、免疫相关基因(Toll样受体4基因、免疫球蛋白M基因、髓样分化因子88、肿瘤坏死因子α)，结果表明，喂食有溶藻链霉菌N1-32菌株的草鱼，血清中溶菌酶和酸性磷酸酶的活性分别升高了1.83倍和1.36倍；粘液中的溶菌酶和酸性磷酸酶活性分别升高了1.48倍和1.51倍。同时草鱼肝脏中抗氧化剂因Nrf2和Keap1基因的表达量分别提高了1.22倍和1.28倍，脾脏中的Nrf2和Keap1基因的表达量分别提高了1.42倍和1.36倍。肾脏的Toll样受体4基因表达量上调了3.24倍，髓样分化因子88基因的表达量上调了3.27倍，肝脏、脾脏、肾脏和头肾四个组织的免疫球蛋白M基因的表达量分别提高了5.53倍、6.58倍、5.58倍和5.83倍。说明溶藻链霉菌N1-32菌株能够调节草鱼的免疫相关酶的活性和免疫相关基因的表达，增强草鱼对病原菌维氏气单胞菌的抵抗力，显著提高草鱼的存活率(60-80％)，显示出作用鱼体后能有效对抗维氏气单胞菌对草鱼、鲫鱼等淡水鱼类的感染。
微生物保藏情况说明
本发明之溶藻链霉菌N1-32，于2019年5月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)，菌种保藏号为CCTCC NO:M2019381。分类命名为：溶藻链霉菌N1-32，拉丁学名Streptomyces amritsarensis。
附图说明
图1是本发明溶藻链霉菌N1-32对鱼类病原菌的抑菌效果图；
图2是本发明溶藻链霉菌N1-32菌落形态学观察图；
图3是本发明溶藻链霉菌N1-32菌体扫描电镜图(放大5000倍)；
图4是本发明根据溶藻链霉菌N1-32的16S rRNA基因序列构建的系统发育树状图；
图5是本发明溶藻链霉菌N1-32抑菌活性物质热稳定性和蛋白酶降解耐受性分析图；
图6是本发明溶藻链霉菌N1-32抑菌活性物质酸碱耐受性分析图；
图7是本发明溶藻链霉菌N1-32对草鱼体液免疫相关酶活性变化柱状图；
图8是本发明溶藻链霉菌N1-32对草鱼免疫相关基因表达变化柱状图；
图9是本发明溶藻链霉菌N1-32对维氏气单胞菌攻毒后的草鱼的存活率折线图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
(一)拮抗菌的细胞形态学特征
从长沙市岳麓区洋湖湿地的12份泥土样品中分离出126株菌，其中一株对鱼类病原菌具有抑菌活性的菌株，命名为N1-32，在高氏1号培养基上菌落呈圆形、紧密坚实、灰白色且不透明，表面干燥有褶皱，基内菌丝发达，有可溶性色素(参见图2)，具有典型的放线菌形态。扫描电子显微镜观察到菌株N1-32菌丝体发达，多分枝(参见图3)。
(二)分子生物学鉴定
菌株于28℃振荡摇床培养72h，利用细菌基因组提取试剂盒(生工公司)提取细菌基因组，利用16S rRNA基因扩增引物
27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。
扩增菌株的基因序列，序列预期长度约为1500bp。
PCR反应体系(20μL)：14μL H2O，2μL ExTaqBuffer(10×)，1.6μLdNTPMixture(2.5mmol/L)，1μL模板，上下游引物各0.6μL，0.2μLTaKaRaExTaq(5U/μL)。
PCR反应程序：95℃预变性5min；30个循环：95℃，45sec；55℃，45sec；72℃，1.5min；72℃，10min。
16S rRNA基因PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。然后将纯化后的PCR产物用pMD-18Tvector进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行氨苄抗性筛选，挑取阳性转化子后提取质粒送上海生工生物技术有限公司测序。
对测序结果经BLAST比对分析，发现该新菌株N1-32的16S rRNA基因的碱基序列与已公布的溶藻链霉菌(Streptomyces amritsarensis)的序列存在差异，同源性均为99.0％(参见图4)。
(三)溶藻链霉菌抑菌活性物质理化性质分析
(1)热稳定性
溶藻链霉菌N1-32菌株发酵液于10000rpm，离心20min，取上清，分别在40℃、60℃、80℃、100℃水浴中处理1h，滤纸片法测定其抑菌活性(参见图5)。
(2)酸碱耐受性
溶藻链霉菌N1-32菌株发酵液于10000rpm，离心20min，取上清，分别经pH梯度(1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0)处理1h，之后调回pH 7.0，牛津杯法测定其抑菌活性(参见图6)。
(3)蛋白酶降解耐受性
溶藻链霉菌N1-32菌株发酵液于10000rpm，离心20min，取上清，分别用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶于37℃处理2h，100℃水浴30min灭活蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶，滤纸片法测定其抑菌活性(参见图5)。
(四)溶藻链霉菌N1-32菌株发酵菌剂的制备
(1)将溶藻链霉菌N1-32斜面种子在高氏一号摇瓶种子培养基(可溶性淀粉20g/L；NaCl 0.5g/L；KNO3 1g/L；K2HPO4·3H2O 0.5g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；FeSO4·7H2O 0.01g/L)中活培养72h，培养条件为28℃，180rpm；
(2)将活化好的种子液按1％的接种量接种到20L发酵罐中扩大培养，发酵培养基配方为(1L)：TSB 45g，酵母提取物9g，葡萄糖10g，MgSO4·7H2O2.2g。发酵培养基装液量为70％，整个培养过程在线监控，控制溶氧浓度为45％，控制温度为28℃，培养90h，实时在线补加消泡剂，OD600为4.0；
(3)将扩大培养的种子液按10％接种量接种到装液量为70％的100L发酵罐中，发酵培养基配方同步骤(2)步所述发酵培养基配方，在溶氧量为45％，温度为28℃培养96h，实时在线补加消泡剂，
(4)放罐，收集发酵液，浓缩，得到液体菌剂，陶瓷膜过滤，喷雾干燥，得到菌体粉剂，直接泼洒在养殖水体或拌入饲料中等方式进行应用。
(五)溶藻链霉菌N1-32菌株在水产应用
实例1：溶藻链霉菌菌剂拌入饲料喂食草鱼之后对鱼类病原维氏气单胞菌病的抵抗
供试健康草鱼(10-12.5g)270条，随机分为9组，饲养于实验室圆柱形养殖箱(直径1m，水体积300L)内，每天投喂相当于鱼体重2％的饲料，饲喂2周，确保草鱼健康，停食24h后进行试验。实验期间，光照周期为12L/12D，水温25±2℃，pH约为7.2±0.5，饲料为通威156颗粒膨化料购自通威股份有限公司。
试验设计：第一组：喂食灭菌的鱼饲料，第二组：喂食添加了浓度为1×107cfu/g的N1-32菌株活菌饲料，第三组：喂食添加了1×109cfu/g的N1-32菌株活菌饲料；每组设置三个重复，喂养28d后，将鱼进行24h饥饿处理，每个组随机取5尾草鱼，进行称重后，用MS-222麻醉断尾取血，用盖玻片刮取鱼体表面，收集粘液，使用试剂盒(溶菌酶活性测定试剂盒、过氧化物歧化酶活性测定试剂盒、碱性磷酸酶活性测定试剂盒、酸性磷酸酶活性测定试剂盒购自南京建成生物有限公司)测定血清和粘液中溶菌酶、过氧化物歧化酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性(图7)，发现草鱼血清中的溶菌酶、酸性磷酸酶和过氧化物歧化酶活性显著升高，粘液中溶菌酶、酸性磷酸酶活性同样呈现显著升高。无菌环境下在冰盘中快速解剖，取肝脏、肾脏、脾脏、头肾组织，分别提取各组织的总RNA，qRT-PCR检测各组织免疫相关基因表达变化(参见图8)，草鱼四种组织中的IgG基因的表达量都显著升高。脾脏中的TLR-4基因、肾脏中的TLR-4和MyD-88基因的表达均显著上调。向鱼体内注射1×108cfu/mL的维氏气单胞菌，每尾0.2mL，观察统计鱼死亡数(参见图9)，对草鱼的保护率达到60％-80％。
表1 溶藻链霉菌N1-32通过饲料添加的方式对草鱼生长性能的影响
Figure GDA0003589768330000071
表2 qRT-PCR引物序列
Figure GDA0003589768330000072
实例2：溶藻链霉菌菌剂通过水体泼洒方式对鱼类维氏气单胞菌病的防治
供试健康草鱼(10-12.5g)270尾，随机分为9组，饲养于实验室圆柱形养殖箱(直径1m，水体积300L)内，每天投喂相当于鱼体重2％的饲料，饲喂2周，确保草鱼健康，停食24h后进行试验。实验期间，光照周期为12L/12D，水温25±2℃，pH约为7.2±0.5，饲料为通威156颗粒膨化料购自通威股份有限公司。
试验设计：第一组：将溶藻链霉菌N1-32添加到养殖水体中，使终浓度控制在1×105cfu/mL，泼洒周期为28天，第29天时向草鱼体内注射浓度为1×108cfu/mL的维氏气单胞菌，注射剂量为0.2mL/尾；第二组：将溶藻链霉菌N1-32添加到养殖水体中，使终浓度控制在1×107cfu/mL，泼洒周期为28天；第三组：前28天不做任何处理，第29天向草鱼体内注射浓度为1×108cfu/mL的维氏气单胞菌，注射剂量为0.2mL/尾；第四组：前28天不做任何处理，第29天向草鱼体内注射浓度为0.65％的生理盐水，注射剂量为0.2mL/尾，连续观察2周并统计鱼死亡数(见表3)，对草鱼的保护率达到60％-70％。
表3 溶藻链霉菌N1-32通过水体泼洒的方式对草鱼的保护力实验结果
Figure GDA0003589768330000081
注：表格中为草鱼存活情况
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 一株溶藻链霉菌N1-32、其微生态制剂及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1426
<212> DNA
<213> 溶藻链霉菌(Streptomyces amritsarensis)
<400> 1
ggggggggga gcttacacat gcagtcgaac gatgaagccc ttcggggtgg attagtggcg 60
aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc cttcactctg ggacaagccc tggaaacggg 120
gtctaatacc ggatacgact gcggaaggca tcttctgcgg tggaaagctc cggcggtgaa 180
ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg tggggtaatg gcctaccaag gcgacgacgg 240
gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300
gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt 360
gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg aaagtgacgg 420
tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc 480
aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggcttgtca cgtcggatgt 540
gaaagcccga ggcttaacct cgggtctgca ttcgatacgg gctagctaga gtgtggtagg 600
ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg 660
cgaaggcgga tctctgggcc attactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgttgggaa ctaggtgttg gcgacattcc 780
acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840
ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg gcttaattcg 900
acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatataccg gaaagcatta gagatagtgc 960
cccccttgtg gtcggtatac aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtcctgtgt tgccagcatg cccttcgggg 1080
tgatggggac tcacaggaga ccgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa 1140
gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca cacgtgctac aatggccggt acaatgagct 1200
gcgataccgt gaggtggagc gaatctcaaa aagccggtct cagttcggat tggggtctgc 1260
aactcgaccc catgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat 1320
acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc 1380
cggtggccca acccttgtgg agggagcttc gaaaggggaa aaggtt 1426

Claims (11)

1. 一株溶藻链霉菌N1-32，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M2019381；分类命名为：溶藻链霉菌N1-32 ，拉丁学名Streptomyces amritsarensis。
2. 根据权利要求1所述的溶藻链霉菌N1-32，其特征在于，所述溶藻链霉菌N1-32的16SrRNA序列如序列表SEQ ID №1所示。
3. 一种适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，由权利要求1所述保藏号为CCTCCNO: M 2019381的溶藻链霉菌N1-32发酵制成。
4.根据权利要求3所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。
5.根据权利要求3或4所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述水产养殖的动物为淡水鱼类。
6.根据权利要求5所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述淡水鱼为草鱼、鲫鱼或鲤鱼。
7.一种如权利要求3～6之一所述适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将溶藻链霉菌N1-32斜面种子在摇瓶种子培养基中进行活化培养；
（2）将活化好的种子液接种到发酵罐中进行扩大培养；
（3）将扩大培养的种子液接种量接种到发酵罐中进行培养，实时在线补加消泡剂；
（4）放罐，收集发酵产物，浓缩，得到微生态液体菌剂，陶瓷膜过滤，喷雾干燥，得微生态菌体粉剂。
8.根据权利要求7所述适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述活化培养的时间为64-72 h，所述摇瓶种子培养基的配方为：可溶性淀粉18-22g/L；NaCl 0.4-0.6 g/L；KNO3 1-1.2 g/L；K2HPO4•3H2O 0.4-0.6 g/L；MgSO4•7H2O 0.3-0.5g/L；FeSO4•7H2O 0.008-0.01 g/L；所述活化培养的温度为25～30℃，所述摇瓶的转动速率为150～200rpm。
9.根据权利要求7或8所述适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述扩大培养包括以下步骤：将活化好的种子液按1～1.5%的接种量接种到发酵罐中；所述发酵罐中发酵培养基的配方为：TSB 40-50g/L，酵母提取物5-10 g/L，葡萄糖10-15 g/L，MgSO4•7H2O 2.2-2.5 g/L；所述发酵培养基装液量为发酵罐容积的60～70%，整个培养过程在线监控，控制溶氧浓度为40%-50%，控制温度为25～30℃，培养90-100 h，实时在线补加消泡剂，控制OD600为4.0。
10.根据权利要求7或8所述适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述培养的方法是，将扩大培养的种子液按10～15%接种量接种到装液量为60～70%的发酵罐中，发酵培养基配方同步骤（2）所述发酵培养基配方，在溶氧量为40%-50%，温度为25～30℃的条件下，培养48～96 h。
11.根据权利要求9所述适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述培养的方法是，将扩大培养的种子液按10～15%接种量接种到装液量为60～70%的发酵罐中，发酵培养基配方同步骤（2）所述发酵培养基配方，在溶氧量为40%-50%，温度为25～30℃的条件下，培养48～96 h。
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