CN114561315A

CN114561315A - 一株维吉尼亚链霉菌w18和微生态制剂及其制备方法与应用

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Publication number: CN114561315A
Application number: CN202111365532.1A
Authority: CN
Inventors: 夏立秋; 胡文斌; 易敢峰; 刘熊; 丁学知
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2022-05-31

Abstract

一株维吉尼亚链霉菌W18和微生态制剂及其制备方法与应用，该维吉尼亚链霉菌W18（Streptomyces virginiae W18）保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021727。由所述维吉尼亚链霉菌W18发酵制成的微生态制剂适用于水产养殖，作用于草鱼肝脏细胞表明该菌对鱼类无毒害作用，将维吉尼亚链霉菌W18的微生态制剂作为饲料添加剂饲喂鲫鱼，提高了鲫鱼的生长性能，同时能够调节鲫鱼细胞免疫因子，增强鲫鱼对病原菌的抵抗力，提高其抗病能力。

Description

一株维吉尼亚链霉菌W18和微生态制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种微生物维吉尼亚链霉菌，尤其是涉及一株维吉尼亚链霉菌W18和用其发酵制成的微生态制剂及其制备方法与应用。

背景技术

我国是水产养殖大国，近年来，随着水产养殖业的迅速发展，我国已实现了高密度、集约化养殖。但是，由于放养密度的不断提高，水产养殖业的病虫害也随之频繁发生并呈上升趋势。

目前应用于水产病原菌引起的病害的防治措施大多是抗生素疗法，抗生素的使用虽然起到了一定的效果，然而在大量使用抗生素的同时，也给养殖环境带来了负面影响，不仅使病原菌的耐药性越来越严重，而且环境和水产品中残留的抗生素会危害人类的健康，也阻碍了水产品的进出口贸易。因此，寻找新的防治方法已然成为水产养殖行业的重要任务。

水产微生态制剂具有绿色、环保、能产生活性物质抑制病原菌的增殖，稳定性好，能促进水产动物生长等优点，已成为具有广泛研究的新方向。目前，水产微生态制剂常用有益微生物的种类有芽胞杆菌、乳酸菌、光合细菌、酵母菌、硝化细菌、反硝化细菌和蛭弧菌。而放线菌在水产养殖应用方面的研究才刚刚新起。

Manimaran,M等人从海洋土壤沉积物样品中分离出来一株链霉菌菌株VITMK2，该菌株对感染白斑综合症病毒(WSSV)的南美白对虾有着抗病毒活性(参见“Manimaran M,Rajkumar T,Vimal S,Taju G,Majeed S A,Hameed A S S,Kannabiran K.Antiviralactivity of 9(10H)-Acridanone extracted from marine Streptomyces fradiaestrain VITMK2 in Litopenaeus vannamei infected with white spot syndrome virus[J].Aquaculture,2018,488(66-73)”)。M.García-Bernal等发现链霉菌RL8和N7能够抑制水生致病菌副溶血性弧菌的生长，当其与饲料混合饲喂凡纳滨对虾后进行攻毒，凡纳滨对虾的存活率得到提高(参见“Garcia-Bernal M,Medina-Marrero R,Rodriguez-JaramilloC,Marrero-Chang O,Campa-Cordova A I,Medina-Garcia R,Mazon-Suastegui JM.Probiotic effect of Streptomyces spp.on shrimp(Litopenaeus vannamei)postlarvae challenged with Vibrio parahaemolyticus [J].Aquaculture Nutrition,2018,24(2):865-71.”)。You等的研究结果表明，海洋放线菌能抑制致病性弧菌菌膜的形成，从而起到预防和治疗致病性弧菌引起的病害(参见“You J L,Cao L X,Liu G F,Zhou SN,Tan H M,Lin Y C.Isolation and characterization of actinomycetesantagonistic to pathogenic Vibrio spp.from nearshore marine sediments[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2005,21(5):679-682”)。以上研究结果说明放线菌具有成为水产养殖益生菌的潜力。

但迄今为止，尚未见有将维吉尼亚链霉菌应用于水产养殖病害防治的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株对多种淡水鱼病原菌具有良好拮抗作用的维吉尼亚链霉菌。

本发明进一步要解决的技术问题是，提供一种对多种淡水鱼病原菌具有良好的拮抗作用，对淡水鱼类常见疾病具有较好的防治作用的微生态制剂。

本发明更进一步要解决的技术问题是，提供一种操作简便的所述维吉尼亚链霉菌微生态制剂的制备方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一株维吉尼亚链霉菌W18(Streptomyces virginiae W18)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO：M 2021727。

本发明之维吉尼亚链霉菌W18的16S rRNA序列如序列表SEQ ID№1所示。

本发明之维吉尼亚链霉菌W18筛选自湖南师范大学校园内土壤中的微生物。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种由菌种保藏号为CCTCCNO：M 2021727的维吉尼亚链霉菌W18发酵制成的微生态制剂。

进一步，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。

研究表明，本发明微生态制剂能抑制维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌等多种鱼类病原菌的生长，菌株发酵液中的抑菌活性物质的较稳定，对蛋白酶不敏感，但在温度超过100℃时活性会有降低。

本发明更进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种微生态制剂的制备方法，包括下列步骤：

(1)将维吉尼亚链霉菌W18斜面种子在摇瓶种子培养基中进行活化培养，得活化种子液；

(2)将步骤(1)所得的活化种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，得扩大培养的种子液；

(3)将步骤(2)所得的扩大培养的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，再次进行培养；然后收集培养产物，进行浓缩，得微生态液体制剂；或者再进一步将微生态液体制剂用陶瓷膜过滤，收集菌体沉淀，将沉淀喷雾干燥，即得微生态固体制剂。

进一步，步骤(1)中，所述活化培养的温度为25～30℃，优选26～28℃，摇瓶的转速为100～150rpm/min，优选120～130rpm/min。

进一步，步骤(2)中，所述种子液接种到发酵罐中的接种量是培养基体积的1～3％；所述发酵培养基配方为：豆饼粉3～6g/L、葡萄糖8～12g/L、NaCl 3～6g/L、细菌学蛋白胨3～6g/L、玉米粉10～25g/L。

进一步，步骤(2)中，所述种子液接种到发酵罐中的接种量优选为培养基体积的2.0～2.5％；所述发酵培养基配方优选为：豆饼粉4～5g/L、葡萄糖9～10g/L、NaCl 4～5g/L、细菌学蛋白胨4～5g/L、玉米粉15～20g/L。

进一步，步骤(2)中，所述扩大培养的时间是96～120h；所述发酵培养基的装液量为发酵罐容积的60～70％；所述扩大培养的溶氧量40～50％；所述第一次扩大培养的温度25～30℃。

进一步，步骤(3)中，所述培养的时间为96～120h，优选100～110h，更优选108h。

进一步，步骤(2)和步骤(3)中，整个培养过程在线监控，实时在线补加消泡剂。

本发明之维吉尼亚链霉菌W18(Streptomyces virginiae W18)的鉴定和研究方法如下：

一、拮抗菌的细胞形态学特征观察；

二、利用16S rRNA基因进行鉴定；

三、维吉尼亚链霉菌W18(Streptomyces virginiae W18)抑菌活性物质的理化性质及毒性试验；

四、维吉尼亚链霉菌W18(Streptomyces virginiae W18)菌剂的制备；

五、维吉尼亚链霉菌W18(Streptomyces virginiae W18)菌剂作为饲料添加剂对草鱼进行饲喂。

利用维吉尼亚链霉菌W18通过发酵制得的微生态制剂，可以应用于水产养殖，特别是淡水鱼养殖，所述淡水鱼包括草鱼、鲫鱼或鲤鱼。已有的研究试验表明，将维吉尼亚链霉菌W18的微生态制剂作为鱼饲料添加剂饲喂淡水鱼，可以提高鱼的生长性能，同时能够调节鱼细胞免疫因子，增强鱼对病原菌的抵抗力，提高其抗病能力。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明维吉尼亚链霉菌W18对鱼类病原菌有广谱抑菌活性，在优化发酵条件后，其对维氏气单胞菌的抑菌圈能达到25.02mm；

(2)研究表明，本发明使用维吉尼亚链霉菌W18菌株发酵制备的微生态制剂在水产中应用具有较大的潜能，将其作为饲料添加剂饲喂鲫鱼后，对鲫鱼中免疫相关酶超氧化物歧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶的活性进行了测定，同时分析了主要免疫器官肝脏、肾脏和脾脏中的细胞免疫因子相关基因(IL-1β、C3、TNF-α、Keap1、LZM和IL-8)的表达，结果表明，投喂了维吉尼亚链霉菌W18菌株微生态制剂的鲫鱼血清中与对照组相比超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活力都显著提高；对鲫鱼的肝脏、脾脏以及肾脏的一些细胞免疫因子的基因表达进行了测定，结果发现IL-8基因表达量在脾脏和肾脏中上调，在肝脏中则无明显差异；LZM基因表达量肝脏和脾脏中都上调，但在肾脏中则出现下调趋势；IL-1β基因表达量只在肾脏中显著上调，在其他两组中则上调不明显；TNF-α基因表达量也只在肾脏中上调；Keap1和C3基因表达量在三者中都呈上调趋势，随着菌体在饲料中所占比例的不同，上调幅度也不相同；

(3)本发明维吉尼亚链霉菌W18微生态制剂提高了鲫鱼对病原菌侵染的非特异性免疫以及特异性免疫能力，进而提高鲫鱼的抗病性，显著提高了鲫鱼的存活率(60％和40％)，显示出作用鱼体后能有效对抗维氏气单胞菌对鲫鱼等淡水鱼类的感染；在病原菌入侵时更加快速准确地进行防御与清除。

微生物保藏情况说明

本发明之维吉尼亚链霉菌W18(Streptomyces virginiae W18)，于2021年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2021727，分类命名为：维吉尼亚链霉菌W18，拉丁学名Streptomycesvirginiae W18。

附图说明

图1是本发明维吉尼亚链霉菌W18对鱼类病原菌的抑菌效果图。

图2是本发明维吉尼亚链霉菌W18在7种培养基上的培养特征。

图3是本发明维吉尼亚链霉菌W18菌体形态特征观察图。

图4是本发明根据维吉尼亚链霉菌W18的16S rDNA基因序列构建的系统发育树状图。

图5是本发明维吉尼亚链霉菌W18的生长曲线图。

图6是本发明维吉尼亚链霉菌W18的抗生素敏感试验分析对比图。

图7是本发明维吉尼亚链霉菌W18抑菌活性物质紫外照射下稳定性试验结果柱形图。

图8是本发明蛋白酶K处理下维吉尼亚链霉菌W18抑菌活性物质的稳定性柱形图。

图9是本发明不同pH对维吉尼亚链霉菌W18抑菌活性物质的影响柱形图。

图10是本发明不同温度对维吉尼亚链霉菌W18抑菌活性物质的影响柱形图。

图11是本发明维吉尼亚链霉菌W18对鲫鱼过氧化物歧化酶活性影响柱形图。

图12是本发明维吉尼亚链霉菌W18对鲫鱼碱性磷酸酶活性影响柱形图。

图13是本发明维吉尼亚链霉菌W18对鲫鱼酸性磷酸酶活性影响柱形图。

图14是本发明维吉尼亚链霉菌W18对鲫鱼溶菌酶活性影响柱形图。

图15是本发明维吉尼亚链霉菌W18对鲫鱼IL-8和C3基因表达变化柱状图。

图16是本发明维吉尼亚链霉菌W18对鲫鱼Keap1和LZM基因表达变化柱状图。

图17是本发明维吉尼亚链霉菌W18对鲫鱼IL-1β和TNF-α基因表达变化柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

(一)拮抗菌的细胞形态学特征

从湖南、新疆、河北等地区采集的土壤样品以及池塘淤泥、鱼的肠道中进行拮抗菌的筛选，最终筛选到并成功分离纯化到一株对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、异常嗜糖气单胞菌(Aeromonas allosaccharophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)及豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)都具有一定抑菌效果的拮抗菌，并命名为菌株W18(参见图1)。将菌株W18接种到7种观察培养基上进行培养特征观察，菌株W18在这7种培养基上都能生长，但是在葡萄糖酵母膏培养基以及伊莫松琼脂培养基上生长情况较差(参见图2)。在这些培养基上菌株W18的气生菌丝绝大部分呈白色，基内菌丝呈深灰色或白色，且在培养后期菌株W18在高氏一号等三种培养基上会产生灰黑色色素。用正置显微镜以及扫描电镜可以观察到菌株W18的菌丝体发达，菌丝细长，分支较多(参见图3)。

(二)分子生物学鉴定

将菌株W18接种到液体培养基中，28℃，120rpm培养5d后，收集菌体，用试剂盒(上海生工公司产)对菌株W18的全基因组进行提取，并用琼脂糖凝胶电泳检测提取情况。

以提取的基因组为模板，对16S rDNA基因进行PCR扩增，所用引物序列为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系和扩增条件如表1和2所示，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增情况。将扩增产物送到上海Sangon生物公司进行测序，测序结果在NCBI上利用局部相似性基本查询工具(BLAST)进行比对，使用MEGA6.0，根据比对结果构建系统发育树。通过16S rRNA测序后构建了系统发育树，发现菌株W18与维吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)亲缘关系最为接近(参见图4)，再结合菌株W18的形态学特征、培养特征及生理生化特征，推定菌株W18应当为维吉尼亚链霉菌的一个变种，故将其命名为维吉尼亚链霉菌W18。

表1 PCR反应体系

表2 PCR扩增循环

(三)维吉尼亚链霉菌W18生长曲线的测定

采用称干重法测定维吉尼亚链霉菌W18的生长曲线，用接种环刮取适量维吉尼亚链霉菌W18的孢子至装有玻璃珠的100mL无菌水中，震荡混匀作为孢子悬液。然后取2mL菌株W18的孢子悬液转接至多个装有50mL AM6培养基的300mL的锥形瓶中，28℃，120rpm培养，从24h开始每隔12h取出3瓶。取待测培养液在9000/min下离心10min，用无菌水离心洗涤菌体沉淀2-4次，然后放入烘箱进行干燥处理，干燥后称重并记录数据，最后绘制出维吉尼亚链霉菌W18的生长曲线(参见图5)。

(四)维吉尼亚链霉菌W18抗生素敏感试验

用红霉素、庆大霉素、氧氟沙星、利福平和氯霉素等15种常用抗生素测试维吉尼亚链霉菌W18的敏感度。在超净工作台内用灭好菌的10μL白枪头挑取维吉尼亚链霉菌W18的孢子,接种于加了15种抗生素的高氏一号固体培养基上，28℃培养5d，观察菌株生长情况。设置三组抗生素浓度分别为20μg/mL、40μg/mL和50μg/mL(参见图6)。

(五)维吉尼亚链霉菌W18抑菌活性物质理化性质分析

(1)紫外稳定性试验

将维吉尼亚链霉菌W18发酵液在10000rpm/min下离心20min，取上层清液，在紫外灯下分别处理10min、20min、30min、40min、50min、60min，保持与紫外灯距离一致，打孔法测定其抑菌活性(参见图7)

(2)蛋白酶降解耐受性

将维吉尼亚链霉菌W18发酵液于10000rpm/min下离心20min，取上层清液，向一组中加入5μL蛋白酶K(20μg/mL)，并与发酵上清液混匀后放置于37℃恒温培养箱中处理半小时，100℃水浴30min灭活蛋白酶K，打孔法测定其抑菌活性(参见图8)。

(3)酸碱耐受性

将维吉尼亚链霉菌W18发酵液于10000rpm/min下离心20min，取上层清液，将每组发酵上清液pH分别调为1、3、5、7、9、11反应60min，随后将各组发酵液pH调到7，打孔法测定其抑菌活性(参见图9)。

(4)热稳定性

将维吉尼亚链霉菌W18发酵液于10000rpm/min下离心20min，取上层清液，分别在-40℃、-20℃、0℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的温度下处理1h，打孔法测定其抑菌活性(参见图10)。

(六)维吉尼亚链霉菌W18菌株发酵微生态制剂的制备

(1)将维吉尼亚链霉菌W18斜面种子在高氏一号摇瓶种子培养基(可溶性淀粉20g/L；NaCl 0.5g/L；KNO₃ 1g/L；K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.5g/L；FeSO₄·7H₂O0.01g/L)中培养72h，培养条件为28℃，180rpm，得活化种子液；

(2)将步骤(1)所得的活化种子液按2％的接种量接种到20L发酵罐中扩大培养，发酵培养基配方为(1L)豆饼粉5g/L、葡萄糖10g/L、NaCl 5g/L、细菌学蛋白胨5g/L、玉米粉20g/L。发酵培养基装液量为70％，整个培养过程在线监控，控制溶氧浓度为45％，控制温度为28℃，培养108h，实时在线补加消泡剂，得扩大培养的种子液；

(3)将步骤(2)所得的扩大培养的种子液按10％接种量接种到装液量为70％的100L发酵罐中，发酵培养基配方同步骤(2)步所述发酵培养基配方，在溶氧量为45％，温度为28℃培养108h，实时在线补加消泡剂；

(4)放罐，收集发酵液，浓缩，得到维吉尼亚链霉菌W18菌株发酵微生态液体制剂；进一步，将所述微生态液体制剂用陶瓷膜过滤，喷雾干燥，得到维吉尼亚链霉菌W18菌株发酵微生态粉剂制剂。

将所得维吉尼亚链霉菌W18菌株发酵微生态制剂直接泼洒在养殖水体或拌入饲料中等方式进行应用。

(七)维吉尼亚链霉菌W18菌株发酵微生态制剂在水产养殖中的应用试验

试验1：维吉尼亚链霉菌W18菌株发酵微生态制剂拌入饲料喂鲫鱼之后能提高鲫鱼的生长性能及抗病力试验。

选取90条鲫鱼(饲养鱼的水提前两天进行曝气处理)，正常饲喂两周后，随机分为三组，将微生态粉末制剂与饲料分别按质量比1:1和1:2的比例混合，每天饲喂鱼的饲料重量为鱼体体重的2％，以喂正常饲料的鲫鱼为对照组，停食24h后进行试验。试验期间，光照周期为12L/12D，水温25±2℃，水体pH为7.2±0.5，饲料为通威156颗粒膨化料，购自通威股份有限公司。在开始喂养前随机抽取10条鱼称量体重作为初始体重，在喂养30d后随机抽取10条鱼对鱼的体重再一次进行称量并统计结果，计算其增长率以及存活率(增长率＝(终重-初重)/初重)，用“平均值±标准差”表示试验结果。在连续喂养一个月后，每组随机选取3条鲫鱼，运用静脉采血法，从每条鱼的尾静脉处采集1mL血液至EP管中，4℃静置8-12h后收集上层血清。试验通过酶活性测定试剂盒按说明书测定了不同组血清中过氧化物歧化酶(SOD，参见图11)、碱性磷酸酶(AKP，参见图12)、酸性磷酸酶(ACP，参见图13)和溶菌酶(LZM，参见图14)的活力来说明饲喂含本发明微生态制剂饲料后所引起的鱼体非特异性免疫的变化。同时每组随机取三条鲫鱼进行解剖，取其脾脏、肾脏和肝脏装入无菌EP管中，马上放入液氮中进行速冻(如若不立即进行接下来的试验，应放置于-80℃保存)。

1、总RNA的提取：使用Total RNA Extractor(Trizol)试剂按手工法来提取鲫鱼的脾脏、肾脏和肝脏组织的总RNA。

2、cDNA的合成：使用PrimeScript^TM RT Reagent试剂盒合成cDNA。

3、荧光定量PCR：使用SYBR Green II染料法进行qRT-PCR反应。将合成的cDNA稀释10倍作为模板，按5μL TB Green、1μL模板、上下游引物各0.5μL和3μL水这一反应体系进行qRT-PCR反应。所测基因(IL-8、C3、IL-1β、TNF-α、Keap1和LZM)及其所对应的引物序列见表3，其中β-actin基因作为内参。反应程序如表4共40个循环。采用2^-△△Ct法分析免疫因子的表达量,发现用含维吉尼亚链霉菌W18发酵微生态制剂饲料饲喂草鱼后提高了其免疫力(参见图15、图16和图17)。

表3荧光定量PCR反应程序

表4荧光定量PCR引物

表5维吉尼亚链霉菌W18微生态制剂对鲫鱼生长的影响

注：Ⅰ：普通饲料喂养；Ⅱ：本发明微生态制剂与饲料1：1混合喂养；Ⅲ：本发明微生态制剂与饲料1：2混合喂养

Note:Ⅰ:ordinary feed feeding；Ⅱ:mixed feeding of bacteria and feed 1:1；Ⅲ:mixed feeding of bacteria and feed 1:2。

试验2：用维吉尼亚链霉菌W18发酵微生态制剂通过饲料添加方式对鱼类维氏气单胞菌病的保护力试验

选取90条鲫鱼(饲养鱼的水至少提前两天进行曝气处理)，正常饲喂两周后，随机分为三组，将本发明维吉尼亚链霉菌W18发酵微生态制剂与饲料按1:1和1:2的比例混合，每天饲喂鱼的饲料重量为鱼体体重的2％，以喂正常饲料的鲫鱼为对照组，停食24h后进行试验。试验期间，光照周期为12L/12D，水温25±2℃，水体pH为7.2±0.5，饲料为通威156颗粒膨化料，购自通威股份有限公司。在喂养30d后，将维氏气单胞菌接种到LB液体培养基中，30℃培养到菌液浓度为1.0×10⁸CFU/mL，1000rpm离心2min去上清，用无菌水洗涤2-3遍，最后用PBS重悬菌体。每组随机取10条鱼注射100μL处理好的维氏气单胞菌菌液进行攻毒实验，连续观察一周鲫鱼的生长情况并统计鱼死亡数(见表6)，对草鱼的保护率达到40％和60％。

表6对鲫鱼保护力试验

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一株维吉尼亚链霉菌W18和微生态制剂及其制备方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1466

<212> DNA

<213> 维吉尼亚链霉菌W18(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

ncstngtrtm ycsvrgnatg cagtggcggg gtgcttacac atgcaagtcg aacgatgaag 60

cccttcgggg tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggcaatct gcccttcact 120

ctgggacaag ccctggaaac ggggtctaat accggatacc actcctgcct gcatgggcgg 180

gggttgaaag ctccggcggt gaaggatgag cccgcggcct atcagcttgt tggtggggta 240

atggcccacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac 300

tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa 360

agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag 420

cagggaagaa gcgaaagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc 480

agccgcggta atacgtaggg cgcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagagctcgt 540

aggcggcttg tcacgtcgga tgtgaaagcc cgaggcttaa cctcgggtct gcattcgata 600

cgggctagct agagtgtggt aggggagatc ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca 660

gatatcagga ggaacaccgg tggcgaaggc ggatctctgg gccattactg acgctgagga 720

gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgttgg 780

gaactaggtg ttggcgacat tccacgtcgt cggtgccgca gctaacgcat taagttcccc 840

gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900

ggcggagcat gtggcttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacatata 960

ccggaaagca ttagagatag tgcccccctt gtggtcggta tacaggtggt gcatggctgt 1020

cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcctg 1080

tgttgccagc atgcccttcg gggtgatggg gactcacagg agaccgccgg ggtcaactcg 1140

gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc 1200

tacaatggcc ggtacaatga gctgcgatac cgtgaggtgg agcgaatctc aaaaagccgg 1260

tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag tcggagtcgc tagtaatcgc 1320

agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca 1380

cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ccaacccttg tggagggagc tgtcgaagtg 1440

acacgtccaa cccccaaccg tcggcc 1466

Claims

1.一株维吉尼亚链霉菌W18（Streptomyces virginiae W18），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2021727。

2.一种如权利要求1所述的菌种保藏号为CCTCC NO：M 2021727的维吉尼亚链霉菌W18发酵制成的微生态制剂。

3.根据权利要求2所述的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。

4.一种如权利要求2或3所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）将维吉尼亚链霉菌W18斜面种子在摇瓶种子培养基中进行活化培养，得活化种子液；

（2）将步骤（1）所得的活化种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，得扩大培养的种子液；

（3）将步骤（2）所得的扩大培养的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，再次进行培养；然后收集培养产物，进行浓缩，得微生态液体制剂；或者再进一步将微生态液体制剂用陶瓷膜过滤，收集菌体沉淀，将沉淀喷雾干燥，即得微生态固体制剂。

5.根据权利要求4所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述活化培养的温度为25～30℃，摇瓶的转速为100～150 rpm/min。

6.根据权利要求4或5所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子液接种到发酵罐中的接种量是培养基体积的1～3%；所述发酵培养基配方为：豆饼粉3~6g/L、葡萄糖8~12g/L、NaCl 3~6 g/L、细菌学蛋白胨3~6 g/L、玉米粉10~25 g/L。

7.根据权利要求4~6之一所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述扩大培养的时间是96~120h；所述发酵培养基的装液量为发酵罐容积的60～70%；所述扩大培养的溶氧量为40~50%；所述第一次扩大培养的温度为25～30 ℃。

8.根据权利要求4~7之一所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述培养的时间为96～120 h。

9.如权利要求2或3所述的微生态制剂在水产养殖中的应用。

10.根据权利要求9所述的微生态制剂在水产养殖中的应用，其特征在于，所述水产养殖的动物为淡水鱼。