CN116970521B - 一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHT p116及其应用 - Google Patents
一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHT p116及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116970521B CN116970521B CN202310742191.8A CN202310742191A CN116970521B CN 116970521 B CN116970521 B CN 116970521B CN 202310742191 A CN202310742191 A CN 202310742191A CN 116970521 B CN116970521 B CN 116970521B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus
- gumht
- kiwi
- soft rot
- fermentation product
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 31
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 claims abstract description 51
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 claims abstract description 44
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims abstract description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims 1
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 abstract description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 13
- 241000223602 Alternaria alternata Species 0.000 description 12
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 10
- 244000298715 Actinidia chinensis Species 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 241000461379 Diaporthe lithocarpus Species 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 241000555706 Botryosphaeria dothidea Species 0.000 description 6
- 241001480007 Phomopsis Species 0.000 description 6
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 5
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- 241000219068 Actinidia Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 244000298800 Actinidia arguta Species 0.000 description 2
- 235000016416 Actinidia arguta Nutrition 0.000 description 2
- 244000148863 Actinidia melanandra Species 0.000 description 2
- 235000002242 Actinidia melanandra Nutrition 0.000 description 2
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 241000208173 Apiaceae Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001503951 Phoma Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241001478342 Pseudomonas syringae pv. actinidiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000002856 computational phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 238000010227 cup method (microbiological evaluation) Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- WZJVQUUBEVDURL-UHFFFAOYSA-N pentanedial;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.O=CCCCC=O WZJVQUUBEVDURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005080 plant death Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 125000000830 polyketide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G13/00—Protecting plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G7/00—Botany in general
- A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P3/00—Fungicides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Abstract
本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHTp116及其应用,属于生物防治技术领域。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)GUMHTp116,保藏编号为CCTCCM2023748。本发明还公开了一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHTp116在防治猕猴桃软腐病和溃疡病中的应用、以及在生产脂肽类抗菌物质方面的应用。本发明贝莱斯芽孢杆菌GUMHTp116对猕猴桃软腐病和溃疡病具有良好的抑菌效果。
Description
技术领域
本发明属于生物防治技术领域,尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHTp116及其应用。
背景技术
目前我国猕猴桃产业仍处于供不应求阶段,市场上对于高品质果品需求量大。但是猕猴桃产业中细菌性溃疡病及果实软腐病发生严重,极大影响果实品质和农民的收入。
由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病是猕猴桃生产上最具毁灭性的病害,常造成木质组织溃疡、绿色组织坏死萎蔫和花腐症状,不仅导致大幅度减产,还引起植株死亡乃至毁园等后果。该病害于1984年在日本首次发生,随后在我国发现(1986年),多年来对我国猕猴桃产业造成持续危害,于1996年列入我国森林植物检疫对象名单。猕猴桃溃疡病的发生易受到环境因素的影响,低温、冻害、大雾有利于病害发生。过量使用铜制剂防治,一方面加重病害对农药的抗性,同时过量农药也会对生态环境造成一定影响。
猕猴桃软腐病是贮藏期危害最为严重的病害,最终可导致果实腐烂,该病发病迅速且难于防治,给猕猴桃产业带来巨大的威胁。葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、链格孢菌(Alternariaalternata)以及拟茎点霉(Phomopsislithocarpus)是引起猕猴桃软腐病的主要致病菌。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)为芽孢杆菌中新发现的一个种,在自然界中广泛分布,可从海洋和河流沉积物、土壤、植株根际、植物组织中分离得到,对人畜无害,对环境无污染,并且能产生对多种病原微生物有拮抗作用的次生代谢物,多用于植物病害防控、促进植物生长等方面。贝莱斯芽孢杆菌可以分泌产生多种生物活性物质,包括酶、抗菌物质、植物激素等,而其抗菌物质主要为通过非核糖体途径和核糖体途径的基因簇合成脂肽类抗生素和聚酮类抗生素等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHTp116及其应用。
为达上述目的,本发明采用如下的技术方案:
一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)GUMHTp116,保藏编号为CCTCCM2023748。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)GUMHTp116的发酵产物。
优选的,所述发酵产物为脂肽类抗菌物质。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GUMHTp116的发酵产物在防治植物病害中的应用。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GUMHTp116在防治植物病害中的应用。
优选的,所述植物为猕猴桃。
优选的,所述植物病害为猕猴桃软腐病和猕猴桃溃疡病。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明从贵州省贵阳市息烽县石硐镇中康公司北京园产区猕猴桃软腐病和溃疡病发病严重地块采集根际土壤,从中筛选分离得到芽孢杆菌GUMHT p116,具有明显的拮抗猕猴桃软腐病的能力,以及拮抗猕猴桃溃疡病的能力。通过形态学、生理生化特性及16SrDNA基因鉴定GUMHTp116为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
保藏信息:贝莱斯芽孢杆菌GUMHT p116,拉丁名为Bacillus velezensis,于2023年05月15日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏编号为CCTCC M 2023748。
附图说明
图1为实施例1中菌株GUMHT P116对猕猴桃软腐病菌和溃疡病菌的拮抗效果;
图2为实施例1中菌株GUMHT P116形态观察(A、B:在LB固体培养基上的菌落形态;C:革兰氏染色观察,标尺=10μm);
图3为实施例1中菌株GUMHT p116的系统发育树分析结果;
图4为实施例1中菌株GUMHT p116对贵长猕猴桃软腐病的室内防效测定;
图5为实施例1中菌株GUMHT p116对金艳猕猴桃软腐病的室内防效测定;
图6为实施例1中菌株GUMHT p116对弥你红猕猴桃软腐病的室内防效测定;
图7为实施例1中菌株GUMHT p116脂肽类抗菌物质粗提物对猕猴桃软腐病菌和溃疡病菌的抑菌效果;
图8为实施例1中菌株GUMHT p116脂肽类抗菌物质粗提物对猕猴桃软腐病菌的抑菌效果扫描电镜观察;
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
1生防芽孢杆菌的分离、筛选及鉴定
1.1土样采集
2022年3月,在贵州省贵阳市息烽县石硐镇中康公司北京园产区(26.6°N,106.9°E),在猕猴桃软腐病和溃疡病发病严重地块,采集健康猕猴桃植株根际土壤,采用的方法为五点取样法,将同一地块土样混合算1份土样。使用纸袋收集土样,土壤采集工具提前消毒,避免土壤微生物混杂。将土样带回实验室分离芽孢杆菌。
1.2培养基
LB液体和固体培养基用于菌株活化和筛选拮抗猕猴桃溃疡病菌的平板对峙实验;PDA培养基用于筛选拮抗猕猴桃软腐病菌的平板对峙实验。
1.3芽孢杆菌的分离
采用稀释平板法取每份土壤样品1g装入9mL无菌水的试管中,将试管置于85℃水浴锅中,水浴30min以杀死绝大部分非芽孢细菌,梯度稀释至10-4、10-3、10-2浓度,分别取稀释液100μL来进行LB平板涂布,每个浓度重复3次,37℃培养12h。观察菌落生长情况,根据平板上长出菌落的大小、形态、颜色等,随机挑取不同的细菌单菌落,进行纯化并保存于-80℃冰箱。
1.4拮抗芽孢杆菌的筛选
供试菌株猕猴桃软腐病菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、链格孢菌(Alternaria alternata)以及拟茎点霉(Phomopsis lithocarpus)和猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)由贵州大学农学院植物病理学教研室保存并提供。采用平板对峙法筛选拮抗猕猴桃软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌效果明显的菌株,观察是否产生抑菌圈,采用十字交叉法测量菌落直径,并计算抑菌率,选择拮抗效果较好的芽孢杆菌1株,编号为GUMHT p116(见图1,表1)。
结果表明:菌株GUMHT p116对葡萄座腔菌(B.dothidea)、链格孢菌(A.alternata)、拟茎点霉(P.lithocarpus)的抑制率分别为85.95%、77.40%、93.38%,对溃疡病菌(Psa)的抑制直径达16±0.23mm,对4种病原菌表现出良好的抑制效果。
表1菌株GUMHT p116对猕猴桃软腐病菌和溃疡病菌的拮抗效果
1.5生防菌株鉴定
通过形态学、生理生化特征及16S rRNA、gyrA等基因对筛选的菌株进行鉴定。
1.5.1菌落形态观察
接种菌株至含有5mL LB培养液的试管中,37℃过夜摇培,离心收集菌体,菌体用无菌水清洗3次,用无菌水重悬并稀释至浓度1×108CFU/mL,在LB液体和固体培养基上滴加10μL菌液,37℃培养3d后观察菌落形态。
1.5.2生理生化特征
根据《伯杰氏系统细菌学手册》,对菌株的生理生化特性进行测定。
1.5.3分子生物学鉴定
50mg/mL溶菌酶37℃水浴1h处理菌体,采用Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以基因组DNA为模板,采用16S rRNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’)和gyrA基因引物gyrA-F(5’-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’)/gyrA-R(5’-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3’)进行PCR扩增,PCR产物验证正确后送上海生工进行PCR产物测序。测序结果于NCBI数据库进行BLAST比对分析,并利用CLUSTALX软件进行多序列比对和系统进化分析软件MEGA11,采用最大似然法maximum-likelihood算法构建系统发育树。
经分析:菌株GUMHT p116可在LB培养基上形成比较复杂的菌落结构(图2A)。菌株为革兰氏阳性细菌G+,生理生化特性为:可分解葡萄糖、鼠李糖和甘露醇,产生过氧化氢酶和硝酸还原酶,甲基红染色阳性,可液化明胶等特征(图2B,表2)。通过16S rRNA和gyrA基因序列分析,构建了菌株GUMHT p116的系统发育树,结果显示,菌株GUMHT p116与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)聚到一个分支,支持率100%;且与模式菌株FZB42的16S rRNA和gyrA基因同源性均为100%(图3)。因此,通过形态学、生理生化特性及分子生物学鉴定,将GUMHTp116鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)。
表2菌株GUMHT p116生理生化特征
+:阳性反应;-:阴性反应
因猕猴桃溃疡病对猕猴桃果实并不致病,主要危害猕猴桃树的枝干,因此仅进行了平板对峙实验。具体操作步骤为将猕猴桃溃疡病菌活化后摇培,以1%接种量倒入冷却到一定程度的LB固体培养基,制成带有病原菌的平板。菌株GUMHTp116活化后摇培,集菌后,滴加1μL菌悬液,25℃恒温培养箱培养3d。培养后观察并记录抑菌圈大小(采用十字交叉法测量抑菌圈直径)。
2.菌株GUMHTp116对采后病害猕猴桃软腐病的防治效果
供试猕猴桃品种:修文贵长猕猴桃(感病品种)、浦江金艳猕猴桃(感病品种)以及六盘水弥你红猕猴桃(感病品种)。
试验地:贵州大学农学院植物病理学实验室。
试验设计:将GUMHTp116接种到LB液体培养基上,在37℃下摇培养至1×108CFU·mL-1菌悬液的浓度。使用无菌接种针在猕猴桃表面形成一个均匀伤口,将处理后的猕猴桃浸泡在GUMHTp116菌悬液中1h,后取出自然风干。选取在PDA平板上培养5天的猕猴桃软腐病菌,用无菌水冲洗菌落表面,制作浓度为1×105孢子·mL-1的孢子悬浮液,滴加20μL孢子悬浮液至每个伤口中。使用无菌水处理的作为阳性对照。将所有处理后的果实放置在25℃、75%相对湿度的恒温培养箱中。每处理5个猕猴桃,实验共重复3次。于接种后3d、5d和7d分别测量病斑直径,计算发病率(Incidence rate)及防腐效果(Decay incidence)。数据采用DPS数据处理系统Duncan新复极差法进行显著性分析。
采用GUMHTp116菌悬液处理不同品种猕猴桃后再接种猕猴桃软腐病菌,已只接种软腐病菌的猕猴桃作为对照,计算发病率及防腐效果。从表3、4、5和图4、5、6来看,采用GUMHT p116处理猕猴桃果实后,3种猕猴桃均表现出很低的发病率0-30%,表明GUMHTp116对猕猴桃软腐病有很好的防效。此外,GUMHT p116处理后,可显著增加猕猴桃的贮藏期,具有良好的防腐效果(表6)。
表3菌株GUMHT p116对贵长猕猴桃软腐病发病率的影响
表4菌株GUMHT p116对金艳猕猴桃软腐病发病率的影响
表5菌株GUMHT p116对弥你红猕猴桃软腐病发病率的影响
表6菌株GUMHT p116对猕猴桃的防腐效果
3菌株GUMHT p116脂肽类抗菌物质的研究
3.1菌株GUMHT p116脂肽类抗菌物质粗提物的制备
挑取GUMHTp116新鲜单菌落接种到LB液体培养基中,37℃、200rpm振荡培养过夜,为种子液。按1%接种量取0.1mL种子液接种于10mL LB液体培养基(100mL锥形瓶)中预培养6h至OD600约等于3.0,以1:100比例(1mL预培养6h至OD600约等于3.0的p116扩培液:装于1000mL锥形瓶中的100mL landy培养基)接种至100mL Landy培养基(10倍溶氧)中,30℃、200rpm培养36h至深咖啡色。50mL离心管收集菌悬液,5000rpm离心10min,取上清。称取6gXAD16吸附树脂装入柱子中,用50mL去离子水洗去树脂表面的盐,将离心取得的上清加入此基质中,置于吸附树脂中吸附30min。再用50mL去离子水洗涤树脂柱,加14mL甲醇洗脱至颜色为透明,收集洗脱液。用旋转蒸发仪干燥甲醇样品(干燥至变深黄贴壁)。干燥的样品先在100μL去离子水中溶解,再加1mL二甲基亚砜(DMSO)至样品中(可在-20℃下长期保存)。
3.2菌株GUMHTp116脂肽类抗菌物质粗提物对猕猴桃软腐病菌和溃疡病菌的抑菌效果
采用0.22μm的无菌滤膜过滤GUMHTp116脂肽类抗菌物质粗提物,制备无菌粗提物。采用牛津杯法,在无菌条件操作,并将无菌牛津杯置入倒好的PDA培养基中,往牛津杯滴加150μL脂肽类抗菌物质粗提物,用5mm的无菌打孔器打取活化后的猕猴桃软腐病菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、链格孢菌(Alternaria alternata)以及拟茎点霉(Phomopsis lithocarpus)接种于距牛津杯5cm处的PDA平板上,7d后采用十字交叉法测量病原菌直径,并计算抑菌率。
用Landy培养基培养GUMHTp116脂肽类抗菌物质粗提物对猕猴桃软腐病菌葡萄座腔菌(B.dothidea)、链格孢菌(A.alternata)、拟茎点霉(P.lithocarpus)的抑制率分别达79.69%、82.86%及85.7%;对猕猴桃软腐病菌葡萄座腔菌(B.dothidea)、链格孢菌(A.alternata)、拟茎点霉(P.lithocarpus)和溃疡病菌(Psa)的抑菌圈直径分别为16.89±1.30mm、17.59±2.70mm、18.98±3.08mm和13.20±0.01mm(表7,图7)。
表7菌株GUMHT p116脂肽类抗菌物质粗提物对猕猴桃软腐病菌和溃疡病菌的抑菌效果
2.3脂肽类抗菌物质粗提物对猕猴桃软腐病菌的抑菌效果扫描电镜观察
选取脂肽类抗菌物质粗提物处理过的,用5mm的无菌打孔器打取在LB平板上生长良好的在抑菌圈周围的猕猴桃软腐病菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、链格孢菌(Alternaria alternata)以及拟茎点霉(Phomopsis lithocarpus)菌落,以及未处理过的菌落边缘的菌落。用2.5%(v/v)戊二醛磷酸缓冲液(50mM,pH 7.2)固定2h,0.1mL磷酸缓冲液(50mM,pH 7.2)冲洗3次,每次15min,0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)配置1%(v/v)锇酸室温固定2h,分别用30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇梯度脱水(3次),每次15min,0.1%磷酸缓冲液冲洗3次,每次15min,LEICAEM CPD临界点干燥仪干燥,EIKO IB-3喷金,日立HITACHI S-3400N扫描电镜15kV观察。
通过扫描电镜观察,菌株GUMHTp116脂肽类抗菌物质粗提物使病原真菌菌丝产生畸形、膨大、破裂,抑制菌丝的生长,对3种病原真菌具有良好的抑制效果;对猕猴桃溃疡病菌也具有良好的抑制效果(图7、图8)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GUMHT p116,保藏编号为 CCTCC NO:M2023748。
2.如权利要求 1 所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GUMHT p116 的发酵产物,其特征在于:所述发酵产物的制备方法为:
取如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌GUMHT p116接种到LB液体培养基中,震荡过夜培养作为种子液;取种子液接种于LB液体培养基中预培养至OD600为3.0,然后接种至Landy培养基中,培养至深咖啡色;收集菌悬液、离心,取上清;取上述上清液经大孔树脂吸附,用去离子水对树脂柱进行洗涤,加甲醇洗脱至颜色透明,收集洗脱液;对洗脱液进行旋蒸,然后加去离子水溶解,再加二甲基亚砜至样品中,即得。
3.如权利要求 2 所述的发酵产物,其特征在于,所述发酵产物为脂肽类抗菌物质。
4.如权利要求 2 所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GUMHT p116 的发酵产物在防治猕猴桃软腐病和猕猴桃溃疡病病害中的应用。
5.如权利要求 1 所述的一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GUMHT p116 在防治猕猴桃软腐病和猕猴桃溃疡病病害中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310742191.8A CN116970521B (zh) | 2023-06-21 | 2023-06-21 | 一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHT p116及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310742191.8A CN116970521B (zh) | 2023-06-21 | 2023-06-21 | 一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHT p116及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116970521A CN116970521A (zh) | 2023-10-31 |
CN116970521B true CN116970521B (zh) | 2024-04-19 |
Family
ID=88484056
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310742191.8A Active CN116970521B (zh) | 2023-06-21 | 2023-06-21 | 一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHT p116及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116970521B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115873744B (zh) * | 2022-07-27 | 2024-03-19 | 贵州大学 | 一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌及其应用 |
CN116218736B (zh) * | 2023-03-20 | 2024-03-19 | 贵州大学 | 一株贝莱斯芽孢杆菌oot-47及其产高效抑菌物质的方法和应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114107124A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-03-01 | 江西农业大学 | 一株贝莱斯芽孢杆菌d-1及其制剂和应用 |
CN115873744A (zh) * | 2022-07-27 | 2023-03-31 | 贵州大学 | 一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌及其应用 |
CN116218736A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-06-06 | 贵州大学 | 一株贝莱斯芽孢杆菌oot-47及其产高效抑菌物质的方法和应用 |
-
2023
- 2023-06-21 CN CN202310742191.8A patent/CN116970521B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114107124A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-03-01 | 江西农业大学 | 一株贝莱斯芽孢杆菌d-1及其制剂和应用 |
CN115873744A (zh) * | 2022-07-27 | 2023-03-31 | 贵州大学 | 一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌及其应用 |
CN116218736A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-06-06 | 贵州大学 | 一株贝莱斯芽孢杆菌oot-47及其产高效抑菌物质的方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116970521A (zh) | 2023-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN116970521B (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌GUMHT p116及其应用 | |
CN109207412B (zh) | 一种抗青枯病生防菌株及其应用 | |
CN110452832B (zh) | 一株耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5及其应用 | |
CN112280716B (zh) | 一种高地芽孢杆菌yg045及其应用 | |
CN107043713B (zh) | 一株蜡状芽孢杆菌y10及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用 | |
CN112143686B (zh) | 一种拮抗水稻黄单胞菌的高地芽孢杆菌st15及其应用 | |
CN109504639B (zh) | 贝莱斯芽胞杆菌gumt319及其应用 | |
CN108728374B (zh) | 一株粘着剑菌dt8菌株及其在降解多效唑中的应用 | |
CN114854618A (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌sf327及其应用 | |
CN109988732B (zh) | 一株类肠膜魏斯氏菌及其应用 | |
CN108570432B (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
CN107760630B (zh) | 一种甲基营养型芽孢杆菌b18及其菌剂和应用 | |
CN106635926B (zh) | 沙福芽孢杆菌yjc-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用 | |
CN109593682B (zh) | 枯草芽孢杆菌gumt332及其应用 | |
CN109504640B (zh) | 枯草芽孢杆菌gumt323及其应用 | |
CN113832071B (zh) | Brevibacillus halotolerans菌及其制备生防菌剂中的应用 | |
CN113881576B (zh) | 一株爪哇虫草菌株Bd01及其应用 | |
CN114085788B (zh) | 一株雅马纳假单胞菌菌株及其应用 | |
CN107058183B (zh) | 一种甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用 | |
CN113462599B (zh) | 一种包含植物源成分和微生物源成分的生物制剂及其在防治植物线虫病中的应用 | |
CN116240126A (zh) | 一株多功能贝莱斯芽孢杆菌sb10及其应用 | |
CN114990009A (zh) | 植物根际促生菌株f13在制备抗病促生增产微生物菌剂中的应用 | |
CN112358984A (zh) | 一种生防菌株yw-1及其生防菌剂的制备和应用 | |
CN111647540A (zh) | 一种防治连作植物根病的生防菌的获取方法 | |
CN114774291B (zh) | 棘孢木霉10564菌株及在番茄枯萎病生防中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |