CN115873744B - 一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌及其应用，所述菌株WL‑23为贝莱斯芽孢杆菌，该菌株已于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022978。从猕猴桃叶片上分离出来的对猕猴桃多种病原真菌和病原细菌具有较强抑制活性的内生细菌WL‑23，经形态学和分子生物学鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌，该菌株的无菌发酵液对Psa同样具有较好的抑制活性，并能诱导猕猴桃产生抗性，实验表明WL‑23的无菌发酵液可以破坏Psa的细胞膜完整性和其细胞结构，从而抑制Psa的正常生长，使得其对溃疡病的发生具有良好的防效。因此具有潜在的商业开发和应用价值，在猕猴桃溃疡病生物防治中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，更具体地说，特别涉及一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及其应用。
背景技术
猕猴桃(Actinidia spp.)又名中华猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.)，因为其富含维生素C、钾、钙、以及胡萝卜素等，被人们称为“水果之王”。中国是种植猕猴桃面积最大的国家，占到了全球猕猴桃种植面积的72％，但是随着种植面积的增加，猕猴桃在生产过程中遭到了各种病原菌的迫害，这影响了猕猴桃的生长发育，其中对猕猴桃产业发展影响最为严重是由丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringaepv.Actinidiae,Psa)引起的猕猴桃溃疡病，在被 Psa侵染后，猕猴桃树体会流出白色细菌性菌浓，会导致猕猴桃花朵不能正常绽放，影响授粉，严重时会导致整个果园树体大面积死亡。
因为Psa具有传播速度快、侵染能力强、难以防治等特点。目前，防治猕猴桃溃疡病发生的方法主要是通过喷施铜制剂和抗生素类药物，但长期不规范的使用，极易对猕猴桃树体造成毒害、加速Psa抗药性的产生、造成农药残留超标。随着人们生活质量的提高，对食品的安全性也越来越重视，因此环境友好型，安全无害的防治方法逐渐受到人们的关注。
生物防治方法中的微生物农药，因为其无公害、无污染、无残留、防治成本低，不易产生抗药性等特点，成为当前病害防治研究的热点。研究主要涉及的生防微生物包括链霉菌、假单胞杆菌、木霉菌、芽孢杆菌等。其中芽孢杆菌具有分布广泛、种类繁多、抗逆性好等特性，使得它更有利于开发成具有较高潜力生物防治剂。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌及其应用，本发明从健康的猕猴桃叶面筛选出一株对猕猴桃溃疡病致病菌等多种病原菌具有较强拮抗作用，根据形态学特征和分子生物学方法将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，通过试验测定了活菌及其无菌发酵液的抑菌性，可用于猕猴桃溃疡病等多种病害的防治。
本发明一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌及其应用的目的与功效，由以下具体技术手段所达成：
一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌，所述菌株分类命名为贝莱斯芽孢杆菌WL-23(Bacillus velezensis WL-23)，其保藏编号为：CCTCC NO:M2022978，保藏日期为：2022年 6月27日。
所述菌株从猕猴桃叶片上分离获得。
所述菌株对猕猴桃果实腐烂病致病菌有拮抗作用。
所述方法为：将菌株WL-23的发酵液喷施于猕猴桃叶面或灌根。
所述方法为：制备WL-23菌悬液或无菌发酵液喷施叶面或灌溉根部。
所述方法为：制备菌株WL-23无菌发酵滤液，将滤液喷施于猕猴桃树体上。
所述发酵液的制备方法为：将贝莱斯芽孢杆菌WL-23在营养琼脂培养基(NA)中画线活化，在35℃培养48h后，挑取单菌落接种于营养肉汤(NB)液体培养基中，在35℃、180rmp培养96h-120h，即可获得所属菌株的发酵液。
一种猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌WL-23在以下1)-6)中全部或部分中有应用：
1)在抑制病原菌中的应用；
2)在抑制病害中的应用；
3)在诱导植物抗性中的应用；
4)在制备病原菌抑制剂中的应用；
5)在制备病害抑制剂中的应用；
6)在制备植物诱抗剂中的应用。
所述的病原菌抑制剂对下述全部或部分病原菌具有抑制作用：丁香假单胞猕猴桃致病变种、根癌农杆菌、葡萄座腔菌、交互链格孢、拟茎点霉菌；病害抑制剂对下述全部或部分病原菌具有抑制作用：猕猴桃溃疡病、猕猴桃根癌病、猕猴桃软腐病、猕猴桃叶斑病、猕猴桃枝枯病；植物诱抗剂可以提高对下述全部或部分防御酶活性：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)。
本发明至少包括以下有益效果：
上述技术方案首次筛选获得的贝莱斯芽孢杆菌WL-23对猕猴桃生产过程中发生的多种病原菌具有较强的抑制活性，且抑菌谱广。经实验证明，其能够有效控制猕猴桃溃疡病的发生，并提高猕猴桃体内相关抗性酶的活性。从而提高猕猴桃树体的健康程度，降低猕猴桃树体被Psa侵染的可能性。表明该菌株在猕猴桃病害的生物防治领域具有广阔的应用前景和价值。
附图说明：
图1为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23菌落形态；
图2为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23的多基因系统发育树；
图3为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23对猕猴桃病原真菌葡萄座腔菌的抑制效果；
图4为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23对猕猴桃病原真菌拟茎点霉菌的抑制效果；
图5为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23对猕猴桃病原真菌链格孢的抑制效果；
图6为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23对猕猴桃病原细菌根癌农杆菌的抑制效果；
图7为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23对猕猴桃病原细菌Psa的抑制效果；
图8为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23无菌发酵液对Psa的抑制效果；
图9为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23无菌发酵液对Psa生长曲线的抑制效果；
图10为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23无菌发酵液作用Psa后的电导率；
图11为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23无菌发酵液作用Psa后的SEM；
图12为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23处理后猕猴桃叶片中SOD活性变化；
图13为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23处理后猕猴桃叶片中PPO活性变化；
图14为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23处理后猕猴桃叶片中CAT活性变化；
图15为本发明贝莱斯芽孢杆菌WL-23处理后猕猴桃叶片上溃疡病的防效。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“同轴”、“底部”、“一端”、“顶部”、“中部”、“另一端”、“上”、“一侧”、“顶部”、“内”、“前部”、“中央”、“两端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置”、“连接”、“固定”、“旋接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例：
本发明提供一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌及其应用，如附图1-15所示，本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株(WL-23)已于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052)，保藏编号：CCTCCNO:M2022978。
1、猕猴桃拮抗内生细菌的分离纯化：从贵州省六盘水市水城县红心猕猴桃产区采集健康猕猴桃的叶片，用无菌水冲洗干净表明的杂质，用手术刀切成5mm×5mm的小片，在75％乙醇中浸泡30s，再用无菌水浸泡清洗3次，每次停留10s。将处理后的叶片组织放入到2mL 研磨管中，加入1mL无菌水和已灭菌的研磨珠，在60Hz下研磨1min。然后使用梯度稀释法稀释研磨液至10-3、10-4和10-5，分别取100μL涂布于NA培养基，于30℃恒温培养箱中培养2d，挑取单菌落在新的NA培养基上画线纯化2-3次。获得的菌种保存于-80℃备用。
2、内生拮抗细菌的筛选：将活化好的Psa菌悬液与45℃的NA培养基以1：100(v:v)混合均匀，取10mL倒入培养皿中，将浸泡过拮抗菌菌悬液的6mm滤纸片放于含菌NA的中央，于30℃恒温培养箱中培养3d，观察抑菌圈的大小，获得抑菌圈最为明显的拮抗菌，命名为WL-23。
3、WL-23菌株形态特征鉴定：将WL-23在NA培养基上画线，30℃培养48h后，菌落为灰白色，表面湿润不透明，表面有皱褶，边缘不整齐略(图1)。在显微镜下观察，菌体呈现出短杆状。
4、WL-23分子生物学鉴定：提取WL-23DNA，用细菌16S通用引物27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')扩增 16S rDNA序列。采用特异性引物gyrA-F(5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT3')和gyrA-R (5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3')扩增gyrA保守基因序列。把PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将有单一条带的PCR产物送到测序公司测序。使用NCBI的BLAST工具对得到的核苷酸序列进行相似性比较，其16S rDNA和gyrA序列均与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)WLYS23最相似，同源性分别为99.93％和100％。采用MEGA 7.0软件的最大似然法(ML)联合拮抗菌16S rDNA和gyrA序列构建其多基因系统发育树。WL-23与 Bacillusvelezensis聚为一支，支持率为100％(图2)。
5、WL-23菌株抑制病原真菌的广谱效果：用6mm打孔器将葡萄座腔菌、拟茎点霉菌、交互链格孢制成6mm菌饼，然后接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中央，用浸泡过 WL-23菌悬液的6mm滤纸片放于距离病原菌菌饼25mm的四个对称方向上，以不放滤纸片作为对照，在28℃恒温培养箱中培养5d，观察病原菌生长情况。按如下公式计算抑制率：
抑制率(％)＝(对照组病原菌直径-处理组病原菌直径)/对照组病原菌直径×100实验结果表明，WL-23对多种猕猴桃病原菌具有较好的抑制活性(图3、4、5)，抑制率分别为：72.33％、76.64％、74.49％。
6、WL-23菌株抑制病原细菌的广谱效果：将病原细菌菌悬液与45℃的NA培养基以1： 100(v:v)混合均匀，取10mL倒入培养皿中，将浸泡过WL-23菌悬液的6mm滤纸片放于含菌NA的中央，于30℃恒温培养箱中培养3d，观察抑菌圈的大小。按如下公式计算抑制率：
抑制率(％)＝(抑菌圈直径-滤纸片直径)/抑菌圈直径×100
实验结果表明，WL-23对猕猴桃上的两种病原细菌均具有较好的抑制活性(图6、7)，抑制率分别为：81.78％、68.94％。
7、WL-23菌株无菌发酵液对Psa的抑制效果：将Psa菌悬液与45℃的NA培养基以1：100(v:v)混合均匀，取10mL倒入培养皿中，将浸泡过WL-23无菌发酵液的6mm滤纸片放于含菌NA的中央，于30℃恒温培养箱中培养3d，观察抑菌圈的大小。按如下公式计算抑制率：
抑制率(％)＝(抑菌圈直径-滤纸片直径)/抑菌圈直径×100
实验结果表明，WL-23菌株无菌发酵液对Psa具有更好的抑制活性(图8)，抑制率为：76.54％。
8、WL-23无菌发酵液对Psa生长曲线的抑制效果：将Psa在28℃，150rpm的摇床中振荡培养至浓度为1×108CFU mL-1，再按1：50(v:v)将Psa接种到新的NB培养液中，然后适量的无菌发酵液被加入使其最终的有效浓度为250mL L-1和500mL L-1(v:v),在28℃，150rmp 的摇床中培养36h，在这期间每隔4h进行一次取样测定在波长为600nm处的吸光值。结果表明，加入两种不同浓度的无菌发酵液后，Psa生长受到了明显的抑制。在Psa生长的每个时间段，无菌发酵液的浓度越高OD600值越低(图9)。
9、WL-23无菌发酵液作用Psa后的电导率：将活化的Psa在4℃，10000r min-1下离心 5min，用5％的葡萄糖溶液洗涤细菌，直到Psa的电导率接近5％的葡萄糖溶液的电导率，然后用含有250mL L-1和500mL L-1无菌发酵液(v:v)的NB培养基在28℃，150rmp的摇床中培养洗涤后的Psa 12h，每隔1h取5mL培养液，在4℃，10000rmp下离心5min后取上清液测电导率记为EL，含有50mL L-1和100mL L-1CFS的NB培养液分别被加入到5％葡萄糖溶液中，混合物的电导率记为EY1和EY2，Psa被与5％葡萄糖溶液混合并在沸水中加热5min，该电导率记为EQ。使用下列公式计算结果：
相对电导率(％)＝(EL-EY)×100/EQ
实验结果说明在加入两种不同浓度的无菌发酵液处理后，Psa细胞膜的通透性增大(图10)，胞内物质泄漏。
10、WL-23无菌发酵液作用Psa后的SEM：收集250mL L-1无菌发酵液处理12h的Psa，用0.1mol L-1的磷酸钠缓存溶液(PBS，PH 7.2)反复冲洗3次，加入2.5％的戊二醛于4℃的冰箱中固定24h，然后用30％、50％、70％、80％、90％的乙醇对样品进行洗脱，每步15min，之后再用100％乙醇脱水2次，每次15min。将一部分处理后的样品置于-20℃预冷后冷冻干燥12h，取出菌体喷金用SEM观察Psa细胞形态并采集图像。从收集到的图片中可以看出， Psa失去了正常的形态变得扁瘪(图11)，大量的Psa细胞膜发生严重破裂，部分细胞膜被分解融为一体。
11、WL-23处理后猕猴桃叶片中防御酶活性变化：分别对猕猴桃叶片进行以下四种处理，接种Psa后喷施WL-23菌悬液、只喷施WL-23菌悬液、只接种溃疡病病菌和不接种不喷施。将处理后的叶片放置在温度为25-27℃，相对湿度为75％的条件下，每组处理10片猕猴桃叶片，重复3次。分别在处理后的0，2，6，10，15，20d取1g叶片组织检测其SOD、PPO和 CAT的值。实验结果表明，WL-23能够诱导猕猴桃树体中多种防御酶活性的升高(图12、13、 14)，从而提高了猕猴桃树苗抵抗Psa侵染的能力。
12、WL-23处理后猕猴桃叶片上溃疡病的防效：采集健康的猕猴桃叶片，用无菌水将叶片表面冲洗干净，待其风干后，用75％乙醇擦洗叶面2～3次对其消毒处理，再用无菌水擦洗叶面2次。将处理后的叶片放置在消毒后的无菌保鲜盒中，对叶面均匀喷施1×108CFUmL-1的Psa菌悬液，并在无菌操作台中吹干。将保险盒置于温度为16℃，相对湿度为75％的人工气候培养箱中。12h后用挡板遮住叶片的左面，仅在叶片右面分别喷施一下四种溶液：A、浓度为1×108CFU mL-1的WL-23菌悬液，B、未稀释的无菌发酵液，C、75％的无菌发酵液，D、50％的无菌发酵液。以喷施无菌水作为对照组，各处理重复三次，并在同样的条件下培养6天观察病斑发生情况。以叶面左边病斑面积占叶面右边病斑面积的百分比来对叶片上的症状划分病级(0-5)，相对应的：0＝0％，1＝1％-10％，2＝10％-20％，3＝20％-30％， 4＝30％-40％，5＝40％-50％。用如下公式计算病情指数和防效：
实验结果表明，4种不同浓度的无菌发酵液对猕猴桃溃疡病的发生均有较好的防治效果(图 15)，对照组的病情指数为80％，A、B、C、D四种不同组分的病情指数和防治效果分别为： 15.56％和80.55％、20％和75％、46.67％和41.66％、57.78％和27.78％。其中A和B的防治效果均在70％以上。
13、序列表：
从猕猴桃叶片上分离出来的对猕猴桃多种病原真菌和病原细菌具有较强抑制活性的内生细菌WL-23，经形态学和分子生物学鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。该菌株的无菌发酵液对Psa同样具有较好的抑制活性，并能诱导猕猴桃产生抗性，实验表明 WL-23的无菌发酵液可以破坏Psa的细胞膜完整性和其细胞结构，从而抑制Psa的正常生长，使得其对溃疡病的发生具有良好的防效。因此具有潜在的商业开发和应用价值，在猕猴桃溃疡病生物防治中具有广泛的应用前景。
本发明未详述之处，均为本领域技术人员的公知技术。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
Claims (6)
1.一株猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)WL-23，其保藏编号为：CCTCC NO:M2022978，保藏日期为：2022年6月27日。
2.一株如权利要求1所述的猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述菌株对猕猴桃果实腐烂病致病菌有拮抗作用，所述猕猴桃果实腐烂病致病菌为葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、交互链格孢（Alternaria alternaria）、拟茎点霉菌（Phomopsis cauloides）。
3.根据权利要求2所述的猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌的应用，其特征在于：将菌株WL-23的发酵液喷施于猕猴桃叶面或灌根。
4.根据权利要求2所述的猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌的应用，其特征在于：制备WL-23菌悬液或无菌发酵液喷施叶面或灌溉根部。
5.根据权利要求2所述的猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌的应用，其特征在于：制备菌株WL-23无菌发酵滤液，将滤液喷施于猕猴桃树体上。
6.根据权利要求3所述的猕猴桃内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述发酵液的制备方法为：将贝莱斯芽孢杆菌WL-23在营养琼脂培养基（NA）中画线活化，在35℃培养48h后，挑取单菌落接种于营养肉汤（NB）液体培养基中，在35℃、180 rmp培养96 h-120 h，即可获得所述菌株的发酵液。
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