CN106497829B

CN106497829B - 一种鲟源嗜水气单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN106497829B
Application number: CN201610899602.4A
Authority: CN
Inventors: 周勇; 曾令兵; 范玉顶; 史玉恒
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2016-10-14
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2036-10-14
Also published as: CN106497829A

Abstract

本发明公开了一种鲟源嗜水气单胞菌及其应用，所述的鲟源嗜水气单胞菌保藏编号为CCTCC NO:M 2016555。利用上述的鲟源嗜水气单胞菌用于制备的灭活疫苗，可以预防鲟鱼细菌性败血症的发生。灭活疫苗中嗜水气单胞菌HZ8（Aeromonas HydrophilaHZ8）的数量不低于1.0×10⁸CFU/ml。本发明筛选得到的鲟源嗜水气单胞菌具有高致病性，用其制备的灭活疫苗，能够预防鲟鱼细菌性败血症的发生，具有良好的市场推广前景。

Description

一种鲟源嗜水气单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体是涉及一种鲟源嗜水气单胞菌及其应用。

背景技术

鲟鱼是我国重要的淡水养殖品种之一，在我国淡水养殖业中具有重要地位。我国鲟鱼养殖主要集中在山东、湖北、云南、四川、浙江、湖南、河北、广东、贵州、福建、北京等省(直辖市)。据统计，2014年全国鲟鱼总产量为7.6万吨，比2013年产量增长17.43％，在淡水养殖主要鱼类中产量增值幅度排名第三。施氏鲟(Amur sturgeon,AcipenserschrenckiiBrandt,1869)是我国北方鲟鱼养殖的主要品种，且有较大的野生产量。随着施氏鲟养殖规模的不断扩大，集约化程度的不断提高以及养殖水环境的恶化，施氏鲟病害尤其是细菌性疾病的问题日益突出，给养殖业造成重大经济损失，目前已成为威胁我国施氏鲟养殖业健康发展的主要因素。

嗜水气单胞菌(Aeromonas Hydrophila)隶属于单胞菌科(Aermonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，广泛分布于淡水、污水及土壤中，能引起多种水产养殖动物患病。鲟鱼感染嗜水气单胞菌后，引起鲟鱼细菌性败血症，主要症状表现为腹部、口腔周围、骨板基部出血，肛门红肿，鳃丝颜色较淡；剖检有淡红色腹水，肌肉、肾脏、性腺充血，后肠出血发炎，并充满泡沫状粘液物质，可引起鲟鱼大规模死亡。长期以来，主要依赖抗生素对鲟鱼细菌性败血症进行治疗，但是随着病原菌耐药性产生，水产品质量安全问题日渐显现，寻求新的防治方法已成为科研工作关注的热点。目前，开展免疫预防是控制鱼类嗜水气单胞菌感染暴发的重要手段，国内外学者已在其疫苗研发方面做了大量的工作，但因嗜水气单胞菌血清型多，对异种血清型菌株的免疫预防效果都不太理想，难以大范围推广使用，嗜水气单胞菌的抗原多样性已成为开发有效疫苗的主要障碍。因此，防止鲟鱼感染嗜水气单胞菌，选择来源于鲟鱼的嗜水气单胞菌是研制高效疫苗及筛选疫苗生产菌株的关键。已知嗜水气单胞菌不同菌株间存在着毒力差异，致病力的有无及强弱取决于毒力因子的种类组成。因此，筛选出致病力强、免疫原性好的鲟源嗜水气单胞菌对于制备疫苗具有重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供了一种鲟源嗜水气单胞菌HZ8，所述的鲟源嗜水气单胞菌HZ8已于2016年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO： M 2016555，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonas Hydrophila)HZ8，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了一种嗜水气单胞菌HZ8在制备鲟鱼细菌性败血症疫苗中的应用，该菌株为鲟鱼细菌性败血症的预防提供了产品和方法。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种嗜水气单胞菌HZ8：

本发明所述的鲟源嗜水气单胞菌HZ8为申请人自鲟鱼中分离获得，该菌株在Arg，Leu，Asp和Met4种氨基酸为碳源的合成培养基生长良好，最适生长条件为pH 7.0，28℃以及液体培养基中溶解氧7.5～10g/L。在合成培养基础上，氨基酸Ser，Val，Trp，Aaf和Phe有较强的促进嗜水气单胞菌生长的能力。锌离子抑制细菌的生长；低浓度的铁离子对细菌生长有一定的促进作用。该菌株含有气溶素(aer)、鞭毛基因(fla)、热稳定性细胞兴奋性肠毒素(ast)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、溶血素(hly)、弹性蛋白酶(ahyB)，横项鞭毛蛋白(laf)、肠毒素蛋白(act)和脂酶(lip)。该菌株对头孢他啶、头孢呋辛、头孢哌酮钠、头孢噻肟、头孢曲松钠、氨曲南和头孢吡肟抗生素敏感。

所述的嗜水气单胞菌HZ8已于2016年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2016555，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonas Hydrophila)HZ8，地址：中国武汉武汉大学。

一种嗜水气单胞菌HZ8在制备鲟鱼细菌性败血症疫苗中的应用，包括利用该菌株作为主效成分，或是主效成分之一制备成鲟鱼细菌性败血症疫苗；所述的疫苗包括目前存在的灭活疫苗，减毒疫苗等目前已知的疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次筛选得到的鲟源的具有高致病性的嗜水气单胞菌，该菌株共有9个毒力因子，包括气溶素(aer)、鞭毛基因(fla)、热稳定性细胞兴奋性肠毒素(ast)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、溶血素(hly)、弹性蛋白酶(ahyB)，横项鞭毛蛋白(laf)、肠毒素蛋白(act)和脂酶(lip)。利用该菌株制备的灭活疫苗，能够预防鲟鱼细菌性败血症的发生，本发明解决了目前市场上无高致病性的鲟源嗜水气单胞菌疫苗，以及异种血清型嗜水气单胞菌疫苗用于鲟鱼效果不理想的问题，具有良好的市场推广前景。

附图说明

图1为鲟源嗜水气单胞菌HZ8—革兰氏阴性菌示意图；

标尺：5微米。

图2为嗜水气单胞菌HZ8磷钨酸负染结果(×2000倍)

图3为8株菌株系统发育树。

图4为8株嗜水气单胞菌ERIC扩增结果示意图。

其中：泳道M：5kb DNA ladder Marker；1：YW2；2：TR3；3：TH5；4：HZ8；5：ZG9；6：ZJ10；7：QJ11；8：ZJ12；9：阴性对照。

图5为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血红细胞数量变化示意图。

图6为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血白细胞数量变化示意图。

图7为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血单核细胞分类百分比变化示意图。

图8为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血嗜中性粒细胞分类百分比的变化示意图。

图9为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血淋巴细胞分类百分比的变化示意图。

图10为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血细胞吞噬指数的变化示意图。

图11为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血细胞吞噬百分率变化示意图。

图12为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼血清中酸性磷酸酶活性变化示意图。

图13为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼血清中溶菌酶活性变化示意图。

图14为试验鱼的血清抗体效价随时间的变化曲线。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料如未特别说明，均来源于商业渠道；本发明所述试验鱼为施氏鲟(Amur sturgeon，Acipenserschrenckii Brandt，1869)

实施例1：

嗜水气单胞菌HZ8的分离及鉴定：

本发明采用分子生物学方法，对8株鲟源嗜水气单胞菌病原菌开展了以致病性、表型分析、分子鉴定及毒力基因检测为内容的实验研究。基于所有菌株gyrB基因序列构建了系统发育树，8个菌株都与嗜水气单胞菌聚为一支；用PCR方法检测了9个毒力基因在菌株中的分布模式。仅HZ8菌株含有所有检测毒力基因：气溶素(aer)、鞭毛基因(fla)、热稳定性细胞兴奋性肠毒素(ast)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、溶血素(hly)、弹性蛋白酶(ahyB)，横项鞭毛蛋白(laf)、肠毒素蛋白(act)和脂酶(lip)。此外,以施氏鲟为感染对象,HZ8菌株半数致死剂量最低，毒力最强，为2.28×10⁴cfu/ml。

具体步骤如下：

(1)将从湖北、广州、浙江、江苏等地收集的病症典型的鲟鱼，无菌条件下从肝脏分离细菌，画线接种于LB固体培养基平皿上，37℃培养24h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，获得8株分离菌，分别命名为YW2、TR3、TH5、HZ8、ZG9、ZJ10、QJ11、ZJ12。

(2)取纯培养的细菌单个菌落涂于干净的载玻片上，然后用革兰氏染色和磷钨酸染色，镜检，观察其形态特征。结果显示，革兰氏染色菌体颜色为红色，说明菌体为革兰氏阴性菌。菌体呈杆状，单个或成对分布(图1，图2)。

(3)毒力基因的检测

选取嗜水气单胞菌的9种主要胞外毒力因子气溶素(aerolysin，aer)、溶血素(hemolysin，hly)、热稳定细胞肠毒素(heat-stable cytotonic enterotoxin，ast)、热敏感细胞肠毒素(heat-labile cytotonic enterotoxin，alt)、细胞毒性肠毒素(cytolyticenterotoxin，act)、溶血毒素(hemolysin，hly)、弹性蛋白酶(elastase，ahyB)、脂肪酶(lipase，lip)、鞭毛蛋白(flagellin，fla)和侧鞭毛蛋白(lateral flagella，laf)

HZ8菌株含有所有检测毒力基因。

(4)序列分析与系统发育树的构建

将8菌株的gyrB基因序列用Blast在Genbank中进行检索，发现其与嗜水气单胞菌属的gyrB基因序列自然聚类，它们的同源性为95％～99％。系统发育数分析，结果如图3所示，8菌株与Aerononas hydrophila聚合，且置信度很高，为97％。因此，8株细菌均为来源于鲟鱼的嗜水气单胞菌。

(5)指纹图谱分析

根据肠道细菌基因间重复序列(Enterobacterial repetitive intergenicconsensus，ERIC)指纹图谱的规律，ERIC将菌株分为4个遗传分型，YW2、TH5、ZG9和QJ11为同一型，TR3为一型，HZ8为一型，ZJ10和ZJ12为统一性(图4)。四个分型正好与菌株毒力基因分布情况一致。

(6)嗜水气单胞菌半数致死量测定

根据毒力基因和指纹图谱结果将8株嗜水气单胞菌分成4型，挑选4株菌株作为各自型的代表菌株(YW2、TR3、HZ8和ZJ10)，进行摇菌培养。将培养后的嗜水气单胞菌3 000r/min离心10min，去除上清液体，菌体沉淀用PBS稀释成10³-10⁸CFU/ml，然后分别对试验鲟鱼进行腹腔注射感染，每组试验鱼30尾，每尾注射剂量为0.1ml，并设置PBS组作为对照。攻毒后连续观察14天，每天记录试验鱼的死亡情况，计算半数致死量。结果如表1所示，HZ8半数致死剂量最低，所以其毒力最强。

表1 4株代表菌株的半数致死剂量

至此，筛选得到一株鲟源嗜水气单胞菌，该菌株已于2016年10月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonas Hydrophila)HZ8地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2016555。

实施例2：

免疫原和吞噬原的制备

免疫原的制备：

挑取嗜水气单胞菌HZ8单菌落于LB培养基中，37℃，200转/分钟培养12～16小时。

将福尔马林加入已培养好的嗜水气单胞菌菌液中至终浓度为0.3％，恒温培养箱37℃灭活48h，即为嗜水气单胞菌灭活疫苗。将灭活好的疫苗用5 000r/min离心10min沉淀菌体，PBS悬浮菌体后再离心沉淀菌体，反复3次。将菌浓度调整至1.0×10⁸CFU/ml，即为免疫原，置4℃冰箱中备用，用于以下实施例。

同上述方法相同，将制备金黄色葡萄球菌灭活作为吞噬原，置4℃冰箱中备用，用于以下实施例。

实施例3：

鲟源嗜水气单胞菌HZ8安全性检测

(1)平面无菌检测

将制备好的免疫原，取100μL，在无菌操作台中涂布于LB固体培养基上，37℃恒温培养箱，培养72h，观察结果，没有细菌生长。

(2)试验鱼安全性检测

取健康试验鱼(体长15～20厘米)30尾，将制备好的免疫原经腹腔注射进行免疫，免疫剂量为1ml/尾。另取健康试验鱼30尾腹腔注射等剂量PBS作为对照组。试验鱼正常饲养，连续观察14天，没有鱼体死亡或受嗜水气单胞菌感染后的典型症状。

实施例4：

免疫与血液样品制备

取健康试验鱼(体长15～20厘米)90尾，将制备好的免疫原经腹腔注射进行免疫，免疫剂量为0.2ml/尾。另取健康试验鱼90尾腹腔注射等剂量PBS作为对照组。于免疫接种后第1、4、7、14、21、28天分别从各组中随机取8尾试验鱼，断尾取血。其中4尾鱼血液混合并加肝素钠抗凝剂，用于红、白细胞计数、白细胞分类计数、吞噬活性和吞噬指数测定；另外4尾鱼血液取出后，室温静置1h，4℃冰箱静置5-6h，4 000r/min离心，10min，取上清，即为鱼血清，用于酸性磷酸酶活力、溶菌酶活力和血清抗体效价测定。

实施例5：

鲟源嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫效果检验

(1)血细胞计数

用Dacie氏稀释液将抗凝血稀释200倍,利用Neubarer计数板计数红、白细胞。免疫组与对照组试验鱼分别注射疫苗与PBS后，其外周血红、白细胞计数结果分别如图5和图6所示，在免疫接种后4天免疫组红、白细胞数量均达到峰值，分别为(8.50±0.17)×10⁸个/ml和(8.96±0.44)×10⁶个/ml。随后免疫组红、白细胞数量逐渐下降，但在注射后第28天仍然高于对照组红、白细胞数量。对照组的红、白细胞数量分别在7.50×10⁸个/ml和6.80×10⁶个/ml上下浮动。

(2)白细胞分类计数

用Wright-Giemsa染液对抗凝血涂片进行混合染色，冲洗晾干，油镜下随机观察100个白细胞，记录白细胞中单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞所占的百分比。从注射后第1天开始，免疫组试验鱼外周血白细胞中单核细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞分类百分比明显高于对照组。免疫组试验鱼的单核细胞和嗜中性粒细胞分类百分比上升较快，在免疫后第7天达到峰值，分别为10.50％和15.53％。此后缓慢减少，但至免疫后第28天仍高于对照组(图7和图8)。免疫组淋巴细胞分类百分比在第1～21天缓慢升高，在第21天达峰值73.51％，但与对照组差异不显著。在免疫后第28天发现淋巴细胞分类百分比开始下降，但仍高于对照组，与对照组淋巴细胞分类百分比差异不显著(图9)。

(3)吞噬细胞吞噬活性

取0.1ml抗凝血，在其中加入25μL灭活的金黄色葡萄球菌，充分混匀后置于28℃恒温水浴锅中孵育60min，每间隔10min摇匀1次；1 000r/min离心3min；吸取血清和血细胞之间的白细胞层制涂片。将涂片用Wright-Giemsa染液混合染色，冲洗晾干，油镜观察记录结果。吞噬活性以吞噬百分比和吞噬指数表示。注射后，免疫组试验鱼外周血细胞吞噬指数和吞噬百分率变化趋势大致相同。免疫后，免疫组吞噬指数和吞噬百分比迅速升高，在第4天达到峰值，吞噬指数为4.53，吞噬百分比为30％，从第7天开始逐渐降低，但至免疫后第28天仍高于对照组(图10和图11)。对照组吞噬指数和吞噬百分率都在某一数值上下波动，较稳定。

(4)酸性磷酸酶活力测定

取50uL血清，按照酸性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作说明进行测定，按以下公式进行计算酸性磷酸酶活力：

酸性磷酸酶(U/100ml)＝(测定管OD值/标准管OD值)×标准管酚的含量(0.005mg)×(100ml/0.05ml)

注射后，免疫组试验鱼的酸性磷酸酶活力在14天内不断增强(图12)，第14天时达到峰值30.21U/ml，随后逐渐下降，但整体水平明显一直高于对照组。

(5)溶菌酶活力检测

取20uL血清，按照溶菌酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作说明进行测定，按以下公式进行计算溶菌酶活力：

溶菌酶活力(μg/ml)＝[(测定管OD₂-测定管OD_l)/(标准管OD₂-标准管OD_l)×标准管浓度(200U/ml)×样本测试前稀释倍数

注射后，免疫组和对照组的试验鱼血清中溶菌酶活力变化如图13所示，免疫组试验鱼血清中溶菌酶活力在免疫后第7天达到峰值为214.65U/ml，随后溶菌酶活力逐渐下降，但一直保持比对照组的溶菌酶活力高。

(6)血清抗体效价

采用96孔血凝板法进行，将免疫原作为反应抗原。取100μL血清,按二倍稀释法用PBS依次稀释，加入等体积的免疫原，置于恒温培养箱中37℃孵育1h，4℃条件下过夜，显微镜观察血清凝集反应的强度。

免疫组试验鱼血清抗体效价在免疫后21天内逐渐增强，21天时达到最大值效价单位为1：203。而对照组的血清抗体效价一直低于1：8(图14)。

(7)疫苗免疫保护率测定

免疫接种后第21天，用浓度为100倍LD₅₀(约3.0×10⁶CFU/ml)的嗜水气单胞菌HZ8对免疫组和对照组鲟鱼进行攻毒。攻毒后第14天，免疫组累计死亡率为22.22％，而对照组累计死亡率为92.22％，嗜水气单胞菌灭活疫苗对试验鱼的相对保护率为75.91％(表2)。

表2攻毒后免疫组和对照组试验鱼死亡情况及相对免疫保护率

上述的试验结果表明，本发明筛选得到的鲟源嗜水气单胞菌具有高致病性，用其制备的灭活疫苗，能够预防鲟鱼细菌性败血症的发生，具有良好的市场推广前景。

Claims

1.一种鲟源嗜水气单胞菌，所述的嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌（Aeromonas Hydrophila）HZ8，其保藏编号为CCTCC NO：M 2016555。

2.权利要求1所述的鲟源嗜水气单胞菌在制备疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的疫苗为鱼类败血症疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，所述的鱼类为鲟鱼。