CN109293769A - 一种qx型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清及其制备方法。使用特定基因型(QX型)的IBV毒种，即使用IBV QXL87株毒种及油乳剂灭活疫苗，对35日龄的SPF雏鸡进行基础免疫和加强免疫，采血并分离血清；对血清进行无菌、外源病毒检测、中和效价测定和特异性检验，获得了特异性好、效价高的QX型IBV阳性血清；本发明QX型IBV阳性血清制备的方法，填补了QX型IBV毒种无标准阳性血清的空白，为IBV的鉴别分型、疫苗的效力及纯净性检验提供保障。选定了SPF雏鸡作为制备血清的试验动物，优化了血清制备过程中的免疫程序，提升了血清抗体中和效价。降低了生产成本，有利于阳性血清的批量制备。

Description

一种QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Infection bronchitis)是由传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病，其主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统等。IBV的基因组核酸在复制过程中易发生突变和重组，不同型毒株之间生物学特性、致病性和组织嗜性复杂多变，根据其免疫原性的差异可将IBV分为众多的血清型，不同血清型IBV之间交叉保护性及血清中和效力相对较差，从而给疾病诊断和防治工作带来极大困难。因此，针对特定基因型的IBV毒种研制检测技术，对于快速有效诊断IB的发生和流行具有重要意义。

本发明针对QX型IBV，研制其阳性血清的制备方法，为IBV的鉴别分型、疫苗的效力及纯净性检验提供保障。

发明内容

本发明的目的在于通过SPF鸡对QX型鸡传染性支气管炎病毒刺激所产生免疫反应获得免疫抗体——阳性血清，为IBV的鉴别分型、疫苗的效力及纯净性检验提供保障。。

本发明技术方案：

1.本发明所述一种用QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清，其特征在于该阳性血清是选用QX型的IBV国内流行毒株作为免疫原免疫SPF鸡制备的阳性血清。

2.本发明所述一种用QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的制备方法，其特征在于该血清的制备方法的步骤为：

(1)选择QX型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QXL87株，对其病毒含量、纯净性及基因型进行检测鉴定，确定其为纯净的QX型IBV毒种；

(2)用IBV QXL87株毒种接种SPF鸡胚，进行毒种扩繁；将扩繁好的鸡胚尿囊液进行浓缩、灭活和乳化，制备出免疫用的QX型IBV灭活疫苗；

(3)使用IBV QXL87株毒种滴鼻点眼免疫35日龄的SPF鸡，首免后14天用QXL87株毒种滴鼻点眼接种及其灭活疫苗颈部皮下、胸部肌肉注射加强免疫，二免后14天用QXL87株毒种及灭活疫苗加强免疫，三免后21天用灭活疫苗加强免疫，四免后7天用灭活疫苗加强免疫，阳性血清制备过程共进行五次疫苗免疫；

(4)五免后14天，无菌采血，分离血清；

(5)将采集的SPF鸡血放入37℃恒温水浴锅中孵育30min，然后3000r/min离心10min，分离血清，再用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的血清无菌分装2ml/瓶，-20℃保存；

(6)对分装保存的血清进行无菌、支原体、外源病毒、血清中和效价测定和特异性检验，确定血清的纯净性、中和效力及特异性。

3.本发明所述的QX型IBV阳性血清的制备方法，其特征在于所述的鸡传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus，IBV)为QX型的IBVQXL87株，该毒株已于2018年09月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCC No：16381。

4.本发明所述的QX型IBV阳性血清的制备方法，其特征在于所使用的试验动物为SPF雏鸡。

具体实施方式

1.病毒毒株：鸡传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus，IBV)为QX型的IBV QXL87株，该毒株已于2018年09月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCC No：16381。QX型的鸡传染性支气管炎病毒QXL87株由中崇信诺生物科技泰州有限公司提供；按《中华人民共和国兽药典》二○一五版三部(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)要求，对QXL87株毒种病毒含量及纯净性进行检测，确定毒种的效价及纯净性。

2.根据GenBank中收录的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的序列，设计了一对引物(序列1和序列2)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下所示：

序列1 上游引物S1–F：5′–atgttgggga agtcactgtt tttag–3′ 25

序列2 下游引物S1–R：5′–tgcgacgatg tgagctattg g–3′ 21

并采用RT-PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒QXL87株S1基因，对扩增产物进行了克隆、测序，获得了S1基因片段，其大小均为1600bp左右(序列3)。将其与常见疫苗株、部分参考毒株及近期国内QX分离株的S1基因序列进行序列比对和分析，结果确定其为QX型的IBV毒种。

(序列3：IBV QXL87株S1基因)

3.IBV QXL87株灭活疫苗制备

(1)水相制备：将灭菌的吐温-80(4份)加入到灭活的抗原液中(96份)，混合均匀。

(2)油相制备：将白油(94份)加热至80℃后，再加入司本-80(6份)，混合均匀，加热至121℃时维持30min。

(3)疫苗乳化：量取油相体积1/3的水相，加至油相中，1500r/min混匀2min。调整转速至8000r/min，乳化6min。

乳化完成后，将乳化好的疫苗分装至疫苗瓶中，轧盖4℃保存，同时取样进行疫苗合格检验。

4.雏鸡免疫及血清处理、鉴定

使用IBV QXL87株毒种滴鼻点眼免疫35日龄的SPF鸡。首免后14天，使用QXL87株毒种滴鼻点眼接种及其灭活疫苗颈部皮下、胸部肌肉注射加强免疫。二免后14天，使用QXL87株毒种及灭活疫苗加强免疫。三免后21天，使用灭活疫苗加强免疫。四免后7天，使用灭活疫苗加强免疫。阳性血清制备的过程中共进行五次疫苗免疫。五免后14天，无菌采血，分离血清。将采集后的血液放入37℃恒温水浴锅中孵育30min，然后3000r/min离心10min，分离血清，再用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的血清无菌分装2ml/瓶，-20℃保存。

对分装保存的血清进行无菌、支原体、外源病毒、血清中和效价测定和特异性检验，确定血清的纯净性、中和效力及特异性。

附图说明

图1 IBV QXL87株S1基因与GenBank中收录的其他疫苗株核苷酸序列比较。

图2 IBV QXL87株S1基因与GenBank中收录的其他毒株的核苷酸序列分子进化树。

本发明涉及的生物材料资源信息

鸡传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus，IBV))QX型QXL87株来自扬州大学，由中崇信诺生物科技泰州有限公司保存，该毒株是由QX型的IBV国内流行毒株QXL株的传代致弱而获得，并于2018年09月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保存；保藏编号：CGMCC No：16381。

本发明的积极意义

本发明涉及一种QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的制备方法。

本发明方法通过鸡传染性支气管炎抗原和毒种免疫SPF鸡制备阳性血清是鸡传染性支气管炎准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行准确评价的基本保障，提高鸡传染性支气管炎病的防控水平，并为鸡传染性支气管炎病的监测和相关兽用生物制品的质量评价提供有力的技术支撑，具有很好的应用前景。

(1)本发明选用了QX型的IBV国内流行毒株QXL株的传代致弱株QXL87株作为阳性血清制备的免疫原。目前本研究旨在解决QX型毒株无标准阳性血清的现状。为IBV的鉴别分型、疫苗的效力及纯净性检验提供保障。

(2)本发明针对制备阳性血清的试验动物进行了严格筛选，选择了35日龄的SPF健康雏鸡为试验动物，其制备的阳性血清纯净性好，并且具有较好的中和效力，满足了研究及检验用血清的要求。SPF雏鸡质量可控、来源稳定，同时能够满足批量进行阳性血清制备的需求。

实施例

以下实施例为进一步说明本发明，不构成对本发明的限制。

实施例1

——免疫用毒种的病毒含量及纯净性检测

按《中国兽药典》，对QXL87株毒种纯净性进行检测，确定毒种的纯净性。

按照以下方法对毒种进行病毒含量测定，将QXL87鸡胚尿囊液用无菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^–6、10^–7、10^–84个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育。24h以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～144h内死亡的鸡胚随时取出，至144h，取出所有活胚。接种后鸡胚在24～144h死亡鸡胚及存活鸡胚胎儿出现失水、蜷缩、发育小(接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病痕者判为感染，计算EID₅₀。结果QXL87株病毒含量为10^6.50EID₅₀/0.1ml。(检验检测结果见表1)

表1 IBV QXL87株检测结果

*注：判定中Y-符合规定，N-不符合规定，1-无结果，NT-未检验

实施例2

——鸡传染性支气管炎病毒IBV QXL87株基因分型

根据GenBank中收录的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的序列，比对后针对保守区设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

上游引物S1-F：5′-atgttgggga agtcactgtt tttag-3′ 25(序列1)

下游引物S1-R：5′–tgcgacgatg tgagctattg g–3′ 21(序列2)

将IBV QXL87株毒种接种10日龄SPF鸡胚，收集36～42h鸡胚尿囊液。采用RT-PCR扩增QXL87株S1基因，对扩增产物进行了克隆、测序，及基因序列比较分析。按照天根生化科技(北京)有限公司RNA提取试剂盒产品说明书从尿囊液中提取病毒RNA。反转录(RT)体系：DEPC水9.5μl，dNTP 4μl，5×M-MLV Buffer 4μl，M-MLV反转录酶(购自大连宝生物工程有限公司)(200U/μl)1μl，6nt随机引物1μl，RNase抑制剂0.5μl。反转录程序：25℃10min；42℃60min；70℃10min。RT-PCR扩增体系：去离子H₂O 13.75μl，dNTP 2μl，5×Buffer 5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，超保真DNA聚合酶(购自美国New England Biolabs公司)0.25μl，cDNA 2μl。RT-PCR扩增程序：98℃30s；25cycles：98℃7s，60℃25s，72℃100s；72℃7min；4℃。电泳:1％琼脂糖凝胶电泳，120V，45min。获得了IBV QXL87株S1基因片段，其大小均为1600bp左右(序列3)。

(序列3：IBV QXL87株S1基因序列)

使用PCR产物凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)进行PCR产物回收。将回收的PCR产物4μl与克隆载体pEasy-Blunt1μl(购自北京全式金生物技术有限公司)进行连接，25℃连接15min，再将连接产物转化Trans1-T1感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，在含有X-Gal、IPTG和Amp的LB琼脂平板培养基上37℃培养12～16h，挑取白斑菌落接种于LB培养基，37℃振荡培养12～16h后，取菌液进行PCR鉴定。选择菌液PCR鉴定为S1基因重组阳性的菌液送公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行序列测定。序列用Lasergene 7.0软件包中的SeqMan程序进行序列拼接，获得了IBV QXL87株S1基因核苷酸序列。用ClustalX 1.81软件将QXL87株S1基因序列与常见疫苗株、部分基因型参考毒株及近期国内QX分离株序列(参考毒株名称及GenBank登录号，见表7)进行比对和分析，最后应用Mega 5软件构建遗传进化树。结果确定其为QX型的IBV毒种(见图1和图2)。

实施例3

——鸡传染性支气管炎病毒IBV QXL87株灭活疫苗制备

将QXL87株毒种接种10日龄SPF鸡胚，收集36～42h鸡胚尿囊液。将收获的鸡胚病毒液8000rpm离心10min，收获上清液。将离心后的病毒液透析浓缩至原体积的1/5，使用终浓度为0.15％的甲醛，37℃灭活20h。油相制备：将白油(94份)加热至80℃后，再加入司本-80(6份)，混合均匀，加热至121℃时维持30min，冷却备用。水相制备：将灭菌的吐温-80(4份)加入到灭活的抗原液中(96份)，混合均匀。乳化：量取油相体积1/3的水相，加至油相中，1500r/min混匀2min。调整转速至8000r/min，乳化6min。

乳化完成后，将乳化好的疫苗分装至疫苗瓶中，轧盖4℃保存，同时取样进行疫苗合格检验。(检验结果见表2)。

表2 IBV QXL87株灭活疫苗检测结果

实施例4

——QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的制备(雏鸡免疫及血清处理、鉴定)

(1)首免：使用QXL87株毒种，滴鼻点眼免疫35日龄SPF雏鸡，10只，10^5.0EID₅₀/只。

(2)首免后14天进行二免，使用QXL87株毒种，滴鼻点眼加强免疫，10^5.0EID₅₀/只；同时使用QXL87株灭活疫苗，进行颈部皮下、胸部肌肉注射加强免疫2.0ml/只。

(3)二免后14天进行第三次免疫，方法同第二次免疫；

(4)三免后21天进行第四次免疫，使用QXL87株灭活疫苗，进行颈部皮下、胸部肌肉注射加强免疫2.0ml/只。

(5)四免后7天进行第五次免疫，方法同第四次免疫；

(6)五免后14天，无菌采集SPF雏鸡血，37℃恒温水浴锅孵育30min，然后3000r/min离心10min，分离血清，再用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的血清无菌分装2ml/瓶，-20℃保存。(免疫程序见表3)

表3 QX型IBV阳性血清制备雏鸡免疫程序

(6)对分装保存的血清进行无菌、支原体、外源病毒、血清中和效价测定和特异性检验，确定血清的纯净性、中和效力及特异性。

无菌、支原体、外源病毒检验按《中华人民共和国兽药典》二○一五版三部进行。(检测结果见表4)

表4 QX型IBV阳性血清的纯净性检验结果

中和效力测定：将抗IBV特异性血清用灭菌生理盐水进行200、400、800、1600倍稀释，分别与等体积的IBV QXL87株病毒液(200EID₅₀/0.1mL)混合，室温(18～25℃)作用1h；经尿囊腔接种SPF鸡胚(10日龄)，每个稀释度接种鸡胚5枚(0.2mL/胚)；对照鸡胚5枚，病毒液接种0.2mL/胚；置36～37℃孵育。24h以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～144h内死亡的鸡胚随时取出，至144h，取出所有活胚。接种后鸡胚在24～144h死亡鸡胚及存活鸡胚胎儿出现失水、蜷缩、发育小(接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病痕者判为感染，按Reed-Muench法计算中和效价。(检测结果见表5)

表5 QX型IBV阳性血清的中和效价测定结果

特异交叉中和试验：将NDV LaSota株、IBV QXL87株毒种做10倍系列稀释，分装于2列试管中。一组取适宜稀释度加入等量的抗IBV QX型特异性血清；另一组加入等量的阴性血清，室温作用1h后，经尿囊腔(绒毛尿囊膜)接种SPF鸡胚(10日龄)，置37℃孵育，计算中和指数。(试验结果见表6)

表6特异性血清交叉中和试验结果

表7 IBV毒株名称及GenBank登录号

序列表

<110> 中崇信诺生物科技泰州有限公司

<120> 一种QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 上游引物S1–F()

<400> 1

atgttgggga agtcactgtt tttag 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 下游引物S1–R()

<400> 3

tgcgacgatg tgagctattg g 21

<210> 3

<211> 1620

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus)

<400> 3

atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaattta 60

ttcgatcctg ctaatactta tgtgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120

tggcacctac aagggggtgc ttatgcagta gtcaattcca ctaattatac taataatgcc 180

ggttctgcag aacattgcac tgttggtgtt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240

tccatagcta tgacagcacc tcttcagggt atggcttggt ctaagtcaca attttgtagt 300

gcacactgta acttttctga aattacagtt tttgtcacac attgttatag tagtggtagc 360

gggtcttgtc ctataacagg catgattgca cgtgatcata ttcgtatttc tgcaatgaaa 420

aatggtactt tattttataa tttaacagtt agcgtatcta aataccctaa ttttaaatct 480

tttcaatgcg ttaataatct cacatctgtt tatctaaatg gtgatcttgt ttttacttcc 540

aacaaaacta ctgatgttac gtcagcaggt gtgtatttta aagcaggtgg acctgtaaat 600

tatagtatta tgaaagaatt taaggttctt gcttactttg ttaatggtac agcacaagat 660

gtaattttgt gcgacaattc ccccaagggt ttgctagctt gtcaatataa cactggcaat 720

ttttcagatg gcttttatcc ttttactaat agtactttag ttagggaaaa gttcatcgta 780

tatcgcgaaa gtagtgttaa tactactctg gcgttaacta atttcacttt tactaatgta 840

agtaatgcac agcctaatag tggtggtgtt aatacttttc atctatatca aacacaaaca 900

gctcagagtg gttattataa ttttaatttg tcatttctga gtcagtttgt gtataaggca 960

agtgatttta tgtatgggtc ctaccaccct agttgttctt ttagaccaga caccattaat 1020

agtggtttgt ggtttaattc tttgtcagtt tctctagctt acggaccact tcaaggtggg 1080

tgtaagcagt cagtttttag tggtagggca acgtgttgct atgcctactc ttacaatggc 1140

ccgatagcct gtaaaggtgt ttattcaggc gaattacgga ctaattttga atgtggattg 1200

ctgatttatg ttactaagag tgatggctct cgtatacaga ctagaacaga gcccttagta 1260

ttaacgcaac acaattataa taatattact ttagataagt gtgttgacta taatatatat 1320

ggcagagtag gccaaggttt tattactaat gtgactgatt ctgctgctaa ttttagttat 1380

ttagcagatg gtgggttagc tattttagat acttcgggtg ccatagatgt ctttgttgta 1440

cagggcagct atggtcttaa ttattacaag gtcaatcctt gtgaagatgt taacaaacag 1500

tttgtagtgt ctggtggcaa tatagttggc attcttactt ctagaaatga aacaggttct 1560

gaacaggttg agaaccagtt ttatgttaag ttaaccaata gctcacatcg tcgcaggcgt 1620

Claims (4)

1.一种用QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清，其特征在于该阳性血清是选用QX型的IBV国内流行毒株作为免疫原免疫SPF鸡制备的阳性血清。

2.如权利要求所述一种用QX型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的制备方法，其特征在于该血清的制备方法的步骤为：

(1)选择QX型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QXL87株，对其病毒含量、纯净性及基因型进行检测鉴定，确定其为纯净的QX型IBV毒种；

(2)用IBV QXL87株毒种接种SPF鸡胚，进行毒种扩繁；将扩繁好的鸡胚尿囊液进行浓缩、灭活和乳化，制备出免疫用的QX型IBV灭活疫苗；

(3)使用IBV QXL87株毒种滴鼻点眼免疫35日龄的SPF鸡，首免后14天用QXL87株毒种滴鼻点眼接种及其灭活疫苗颈部皮下、胸部肌肉注射加强免疫，二免后14天用QXL87株毒种及灭活疫苗加强免疫，三免后21天用灭活疫苗加强免疫，四免后7天用灭活疫苗加强免疫，阳性血清制备过程共进行五次疫苗免疫；

(4)五免后14天，无菌采血，分离血清；

(5)将采集的SPF鸡血放入37℃恒温水浴锅中孵育30min，然后3000r/min离心10min，分离血清，再用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的血清无菌分装2ml/瓶，-20℃保存；

(6)对分装保存的血清进行无菌、支原体、外源病毒、血清中和效价测定和特异性检验，确定血清的纯净性、中和效力及特异性。

3.如权利要求1所述的QX型IBV阳性血清的制备方法，其特征在于所述的鸡传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus，IBV)为QX型的IBVQXL87株，该毒株已于2018年09月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCC No：16381。

4.如权利要求1所述的QX型IBV阳性血清的制备方法，其特征在于所使用的试验动物为SPF雏鸡。