CN111748653B

CN111748653B - 一种用于新型冠状病毒检测试剂盒的质控品及其制备方法

Info

Publication number: CN111748653B
Application number: CN202010771800.9A
Authority: CN
Inventors: 何海蓉; 刁小龙; 陈启稳; 王飞; 张家铭; 王秋娟; 贾正
Original assignee: Zhongchong Xinnuo Biological Technology Taizhou Co ltd
Current assignee: Zhongchong Xinnuo Biological Technology Taizhou Co ltd
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2040-08-04
Also published as: CN111748653A

Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒检测试剂盒质控标准品的制备方法。本发明应用新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)同科的鸡传染性支气管炎病毒作为新型冠状病毒核酸检测试剂盒质控标准品。目前新冠检测试剂盒质量层次不齐，且阳性质控均为质粒样品(DNA)，无法对病毒反转录过程进行监督与评估。同时由于临床样品的多样性与复杂性，也造成检测结果的不稳定性。本发明涉及质控品可以在新型冠状病毒检测试剂盒研制、出厂检验及保存期监测过程中提供灵敏度、特异性评价支持，有效监控生产过程中各种因素对于试剂盒质量的影响，同时用于评价样品保存液对病毒的灭活效果，既保证样品中病毒彻底灭活，也保证病毒核酸的有效保存，延长核酸的保存时间，确保检测灵敏度。

Description

一种用于新型冠状病毒检测试剂盒的质控品及其制备方法

技术领域

本发明涉及病毒检测试剂盒质控技术领域，特别涉及新型冠状病毒(2019-nCoV)荧光定量检测试剂盒质控品的制备方法。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)被发现，2020年2月11日，国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)正式将新型冠状病毒(2019-nCoV)命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2， SARS-CoV-2)。人感染了新冠状病毒后常伴有呼吸困难、发热、咳嗽和气促等症状。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

针对于当前流行的2019新型冠状病毒研发出快速、准确的检测方法是重要的，荧光定量 RT-qPCR方法通常在1小时内即可完成核酸样本的检测。然而，在试剂盒研发过程中常常会出现假阴性结果。假阴性不但会造成对个体的错误判断，延误病情，更有可能造成传染源的遗漏，造成严重影响。因此，如何最大程度避免检测结果的假阴性出现，选择何种标准品对试剂盒进行质量控制成为迫切需要解决的问题。

研究表明，鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)与2019新型冠状病毒同属于冠状病毒科成员，其基因组均为线性的单股正链RNA病毒，5’末端具有甲基化的帽子结构，3’末端具有poly A尾。冠状病毒基因组全长在27～32kb之间，病毒基因组包含6～12 个开放阅读框，在所有冠状病毒基因组中，编码复制酶多聚蛋白以及4种结构蛋白的基因排列次序均相同，即5′-ORF1ab-S-E-M-N-3′，编码辅助蛋白的基因散落在结构蛋白基因之间。鸡传染性支气管炎病毒与2019新型冠状病毒的理化特性几乎相同，研究表明两者均对温度、pH值敏感。同时，对70％乙醇、甲醛、乙醚、氯仿等有机溶剂和消毒剂也均敏感(表1)。表明鸡传染性支气管炎病毒为2019新型冠状病毒荧光定量试剂盒研发过程中理想的标准物质。可有效控制检测试剂盒的特异性、灵敏性、精密性和稳定性等。

表1鸡传染性支气管炎病毒与2019新型冠状病毒的生物学特性比较

发明内容

本发明的目的在于提供一种2019新型冠状病毒(2019-nCoV)检测试剂盒质控标准品的制备方法。

本发明技术方案：

1.本发明所述一种用于新型冠状病毒检测试剂盒的质控品，其特征在于，该试剂盒选用鸡传染性支气管病毒(QXL87株)作为新型冠状病毒检测试剂盒质控标准品：

所述的鸡传染性支气管病毒(Infection bronchitis virus，IBV)为为QX型的IBVQXL87 株，该毒株已于2018年09月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCC No：16381。

2.本发明所述一种用于新型冠状病毒检测试剂盒的质控品，其特征在于该试剂盒质控标准品的制备方法为：

(1)选择鸡传染性支气管炎病毒QXL87株，进行电子显微镜观察，病毒S1基因测定分析；

(2)对鸡传染性支气管炎病毒QXL87株进行传代培养至病毒感染滴度稳定，按照《中华人民共和国兽药典》(2015版)方法，进行病毒含量测定，作为浓缩纯化以及试剂盒质控标准品质量评价的赋值基点依据；

(3)取病毒感染滴度在10^6.0EID₅₀～10^7.0EID₅₀以上的病毒液进行3～5倍浓缩，并进行纯化处理；

(4)按照《中华人民共和国兽药典》(2015版)方法，对毒株进行无菌、支原体、外源病毒的纯净性检验，确定纯净；

(5)用含脱脂奶粉，蔗糖等冻干保护液，将浓缩纯化后的目标病毒悬液按1:1～1:1.5比例进行稀释混匀分装，得到新型冠状病毒检测试剂盒质控标准品半成品；

(6)将得到的质控标准品半成品进行冷冻干燥处理，其中预冻阶段：温度为-12～-40℃，时间为1～2h；升华阶段：温度为-5℃～5℃，真空度为0.04～0.12bar，时间18～20h；解析阶段：26～28℃，真空度为0.02～0.04bar最后得到质控标准品的成品。

3.本发明所述一种用于新型冠状病毒检测试剂盒的质控品，其特征在于该试剂盒质控标准品的应用是：

(1)针对鸡传染性支气管炎病毒QXL87株，设计特异性的引物及探针，优化检测条件，对样品进行荧光定量检测；

(2)将IBV作为阳性内标参照，加入到采集的新型冠状病毒患者的咽拭子、鼻拭子、肺泡灌洗液、痰液、血液、血清等临床样品进行检测，评价临床样品中是否存在导致检测假阴性抑制物，用于验证新冠病毒核酸检测试剂盒的检测效果。

本发明的积极意义

本发明公开了一种新型冠状病毒检测试剂盒质控标准品的制备方法。应用新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)同属的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为新型冠状病毒核酸检测试剂盒质控标准品。本发明涉及IBV病毒质控品的制备方法，通过鸡胚接种对IBV病毒进行传代培养至病毒感染滴度稳定，收获病毒尿囊液，进行浓缩、纯化，测定病毒含量(EID₅₀)，经纯净性检验合格，加入保护剂，经冻干得到试剂盒质控标准品。

本发明涉及质控品可以在新型冠状病毒检测试剂盒研制、出厂检验及保存期监测过程中提供灵敏度、特异性评价支持，有效监控由于原材料、人员操作、仪器状态及试剂盒有效性等因素对于试剂盒质量的影响，同时用于评价样品保存液对病毒的灭活效果，既保证样品中病毒彻底灭活，也保证病毒核酸的有效保存，延长核酸的保存时间，确保检测灵敏度。

本发明涉及的生物材料资源信息

鸡传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus，IBV))QX型QXL87株来自扬州大学，由中崇信诺生物科技泰州有限公司保存，并于2018年09月13日送交北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)保存；保藏编号：CGMCC No：16381。

附图说明

图1 S1基因电泳图图中显示样品1600bp目的基因片段。

图2不同新冠灭活样品对IBV质控测试溶解曲线图中：2-1为咽拭子溶液，,2-2为鼻拭子溶液，2-3为肺泡灌洗液，2-4为痰液，2-5为血液，2-6为血清。

图3 IBV质控品与新冠阳性质粒相关性图中1为阳性质粒CT，2为IBV质控CT值。

具体实施方式

1.鸡传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus，IBV)为QX型的IBVQXL87株，该毒株已于2018年09月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCCNo： 16381。

2.取鸡传染性支气管炎病毒QXL87株鸡胚尿囊液，4℃8000r/min离心30min，取上清用2％磷钨酸染色2min，于电子显微镜下观察病毒形态，试验结果表明，样品中可见120nm左右大小的特征性冠状病毒粒子。

3.根据GenBank中收录的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的序列，设计了一对引物(序列1和序列2)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下所示：

序列1 上游引物S1–F：5′–atgtt gggga agtca ctgtt–3′20

序列2 下游引物S1–R：5′–tgcga cgatg tgagc tattg–3′20

并采用RT-PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒QXL87株S1基因，对扩增产物进行了克隆、测序，获得了S1基因片段，其大小均为1600bp左右。将其与常见疫苗株、部分参考毒株及近期国内QX分离株的S1基因序列进行序列比对和分析，结果确定其为QX型的IBV毒种。

4.按《中华人民共和国兽药典》二○一五版三部(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)要求，对QXL87 株毒种病毒含量及纯净性进行检测，确定毒种的效价及纯净性。

5.根据步骤3中测定的QXL87株S1基因序列，利用软件设计特异性引物和探针，使用康为世纪RNA提取试剂盒提取RNA，并使用一步法Real-Time RTqPCR进行QXL87株毒种进行检测，并优化检测条件，分析引物熔解曲线，验证荧光探针和引物的特异性及灵敏度，保证引物和荧光探针的特异性。

6.将IBV作为内标参照，加入到新冠病毒核酸检测试剂盒中，对采集的新型冠状病毒患者的咽拭子、鼻拭子、肺泡灌洗液、痰液、血液、血清等临床样品进行检测，评价临床样品中是否存在导致检测假阴性抑制物。

实施例

以下实施例为进一步说明本发明，不构成对本发明的限制。

实施例1

——质控品IBV QXL87株病毒含量及纯净性检测

按《中华人民共和国兽药典》二○一五版三部，对QXL87株毒种纯净性进行检测，确定毒种的纯净性。

按照以下方法对毒种进行病毒含量测定，将QXL87株鸡胚尿囊液用无菌生理盐水作10 倍系列稀释，取10^-5、10^–6、10^–7、10^–8 4个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育。24h以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～144h内死亡的鸡胚随时取出，至144h，取出所有活胚。接种后鸡胚在24～144h死亡鸡胚及存活鸡胚胎儿出现失水、蜷缩、发育小(接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病痕者判为感染，计算EID50。结果QXL87株病毒含量为10^6.50EID₅₀/0.1ml。(检验检测结果见表2)

表2 IBV QXL87株病毒检测结果

*注：判定中Y-符合规定，N-不符合规定

实施例2

——质控品IBV QXL87株S1基因鉴定毒株

根据GenBank中收录的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的序列，比对后针对保守区设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

序列1 上游引物S1–F：5′–atgttgggga agtcactgtt–3′20

序列2 下游引物S1–R：5′–tgcgacgatg tgagctattg–3′20

将IBV QXL87株毒种接种10日龄SPF鸡胚，收集42h鸡胚尿囊液。采用RT-PCR扩增QXL87株S1基因，对扩增产物进行了克隆、测序，及基因序列比较分析。按照江苏康为世纪生物科技有限公司RNA提取试剂盒产品说明书从尿囊液中提取病毒RNA。经反转录(RT)、 RT-PCR扩增、电泳等试验，获得了IBV QXL87株S1基因片段，其大小约为1600bp。

使用PCR产物凝胶回收试剂盒进行PCR产物回收。将回收的PCR产物4μl与克隆载体pEasy-Blunt1μl(购自北京全式金生物技术有限公司)进行连接，再将连接产物转化Trans1-T1 感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，选择鉴定为S1基因重组阳性的菌液送公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行序列测定。序列用Lasergene 7.0软件包中的SeqMan 程序进行序列拼接，获得了IBV QXL87株S1基因核苷酸序列。研究表明，其为QX型的QXL87 毒种。

实施例3

——质控品IBV QXL87株荧光定量

根据QXL87株S1基因序列，利用软件设计特异性引物和探针，使用江苏康为世纪生物科技有限公司RNA提取试剂盒提取RNA，并使用一步法qPCR(TaqMan)进行QXL87株毒种进行检测，并优化检测条件，分析引物熔解曲线，验证荧光探针和引物的特异性及灵敏度，保证引物和荧光探针的特异性。反应体系为25μL体系，其中反应液19μL(包含特异性引物、探针，反应缓冲液)，酶液1μL(包括逆转录酶，热启动DNA酶等)，待测样品5μL。

序列1 上游引物S1–F：5′–ctgttcgatt agtcactgtt–3′20

序列2 下游引物S1–R：5′–tcctt cgatg tgagc caatt–3′20

序列3 探针Taq1：tgcgaatgcc tcgcgattta ttg 23

反应程序(见表3)

表3.反应程序

阳性质控标准：

FAM跟ROX通道用典型的S型扩增曲线或CT值＜35。

内标VIC通道有典型的S型扩增曲线。

阴性质控标准：

FAM跟ROX通道CT值＞35或无CT值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

实施例4

——临床样品IBV QXL87株荧光定量

对采集的新型冠状病毒患者的咽拭子、鼻拭子、肺泡灌洗液、痰液、血液、血清等临床灭活样品加入IBV质控品，测试不同样品是否存在导致检测假阴性的抑制物。同时按梯度稀释新冠阳性质粒与IBV质控品，测试不同稀释梯度的相关性。

表4.不同新冠灭活样品对IBV质控的CT值的影响

/>

结果显示：IBV质控品均检测为阳性，CT值均值21.2。标准差0.49。不同的组织稀释样品对IBV质控品无影响，IBV质控在不同的的组织稀释液中较稳定，不存在假阴性抑制物，IBV 阳性质控与新冠质粒相关性良好，相关系数大于0.99。目前IBV作为质控品评价的新冠检测试剂盒已广泛用于临床检测。

序列表

<110> 中崇信诺生物科技泰州有限公司

<120> 一种用于新型冠状病毒检测试剂盒的质控品及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(S1-F)

<400> 1

atgttgggga agtcactgtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(S!-R)

<400> 2

tgcgacgatg tgagctattg 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 探针(Taq1)

<400> 3

tgcgaatgcc tcgcgattta ttg 23

Claims

1.一种鸡传染性支气管病毒毒株在制备用于新型冠状病毒检测试剂盒的内标质控品的应用，其特征在于，该试剂盒选用鸡传染性支气管病毒QXL87株作为新型冠状病毒检测试剂盒质控标准品：

所述的鸡传染性支气管病毒（Infection bronchitis virus，IBV）为QX型的IBV QXL87株，该毒株已于2018年09月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；保藏编号： CGMCC No：16381；所述试剂盒质控标准品的制备方法为：

（1）选择鸡传染性支气管炎病毒QXL87株，进行电子显微镜观察，病毒S1基因测定分析；

（2）对鸡传染性支气管炎病毒QXL87株进行传代培养至病毒感染滴度稳定，按照2015版《中华人民共和国兽药典》方法，进行病毒含量测定，作为浓缩纯化以及试剂盒质控标准品质量评价的赋值基点依据；

（3）取病毒感染滴度在10^6.0EID₅₀-10^7.0EID₅₀的病毒液进行3~5倍浓缩，并进行纯化处理；

（4）按照2015版《中华人民共和国兽药典》方法，对毒株进行无菌、支原体、外源病毒的纯净性检验，确定纯净；

（5）用含脱脂奶粉、蔗糖冻干保护液，将浓缩纯化后的目标病毒悬液按 1:1～1:1.5比例进行稀释混匀分装，得到新型冠状病毒检测试剂盒质控标准品；

（6）将得到的质控标准品进行冷冻干燥处理，其中预冻阶段：温度为-12～-40℃，时间为1～2h；升华阶段：温度为 -5℃～5℃，真空度为0.04～0.12bar，时间 18～20h ；解析阶段：26～28℃，真空度为0.02～0.04bar最后得到质控标准品的成品。

2.如权利要求1所述的应用，其特征还在于：

（1）针对鸡传染性支气管炎病毒QXL87株，设计特异性的引物及探针，优化检测条件，用于对样品进行荧光定量检测；

（2）将所述质控标准品作为阳性内标质控品，加入到采集的新型冠状病毒患者的咽拭子、鼻拭子、肺泡灌洗液、痰液、血液、血清临床样品进行检测，评价临床样品中是否存在导致检测假阴性抑制物，用于验证新冠病毒核酸检测试剂盒的检测效果。