CN111440897A - 一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的探针及引物组合物 - Google Patents
一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的探针及引物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的探针及引物组合物，主要是根据OC43‑CoV、NL63‑CoV、229E‑CoV、HKU1‑CoV、SARS‑CoV、FluB、RSV的N基因；MERS‑CoV的ORF1a、ORF1b、N基因；2019‑nCoV的ORF1ab、N基因；FluA的M基因；HadV的HEXON基因的特异性设计一组特异性引物及Taqman或MGB探针，利用熔解曲线技术，根据熔解温度的变化快速鉴定CoV‑OC43、HCoV‑NL63、HCoV‑229E、HCoV‑HKU1、SARS‑CoV、MERS‑CoV、2019‑nCoV、FluA、FluB、HAdV、RSV。该设计能够实现一个荧光通道中同时检测多种病原体，并能够满足较高的灵敏度。
Description
技术领域：
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种检测冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、新型冠 状病毒(2019-nCoV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病 毒的试剂盒及检测方法领域。
背景技术：
冠状病毒(Coronavirus，CoV)属巢状病毒目，冠状病毒科，是一类有包 膜的正链RNA病毒，全长在26-32kb之间，分为α、β、γ三个属。α、β属仅 对哺乳动物致病，γ属主要引起鸟类感染，CoV主要通过直接接触分泌物或经气 溶胶、飞沫传播，也有证据表明可经粪口途径传播。冠状病毒在自然界的感染 谱非常广泛，常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛及家禽类等都易感。近 年来，又从白鲸、骆驼、蝙蝠体内分离到多种类型的冠状病毒。到目前为止， 引起人类呼吸道疾病的人冠状病毒(HCoV)已达7种：HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和新型冠状病毒(2019-nCoV)， 是人呼吸道感染的重要病原体。其中，2019-nCoV于2019年被发现，临床表现为 发热、乏力等全身症状，伴有干咳，呼吸困难等，可迅速发展为重症肺炎、呼 吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征，脓毒性休克，多器官功能衰竭，严重酸碱代谢 紊乱等，甚至危及生命。
流感是由流感病毒引起急性呼吸道传染病，主要传播方式是空气飞沫传播。 流感病毒分为甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒(Influenza A virus，FluA) 根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型， 甲型流感病毒最容易发生变异，容易引起爆发流行；乙型流感病毒(Influenza B virus，FluB)变异较少，丙型流感病毒较稳定，多引起散发病例。流感是一 种季节性疾病，在温带地区，流感会在整个冬季流行，在热带地区，流感病毒 一年四季均存在，雨季流行多见。一般来说，仅约50％左右的感染病人会发展成 典型流感临床症状。流感典型症状以突然发热、头晕头痛、肌痛为特点，同时可伴有喉咙痛和咳嗽、鼻塞、流涕、胸痛、眼痛、畏光等症状。发热体温可达 39～40℃，一般持续2～3天后渐退。甲型和乙型流感的临床症状相似，乙型流 感通常有肌炎及胃肠道症状。
人腺病毒(Human adenoviruses,HAdV)属于哺乳动物腺病毒属，是一群分 布广泛的、无包膜的双链DNA病毒，1953年由Rowe等首次发现。目前已发现至 少90个基因型，分为A-G共7个亚属，不同型别HAdV的组织嗜性、致病力、流行 地区等特性不同。HAdV感染可引起多种疾病，包括肺炎、支气管炎、膀胱炎、 眼结膜炎、胃肠道疾病及脑炎等。与呼吸道感染相关的HAdV主要有B亚属 (HAdV-3、7、11、14、16、21、50、55型)，C亚属(HAdV-1、2、5、6、57 型)和E亚属(HAdV-4型)。腺病毒肺炎约占社区获得性肺炎的4％-10％，重症 肺炎以3型及7型多见，HAdV-7B型是2019年我国南方发病地区主要流行株。
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是临床常见的、重 要的呼吸道病毒，形态为球形，基因组为线性、不分节段的单链RNA，病毒体有 包膜，膜上有刺突，由糖蛋白组成，无血凝素和神经氨酸酶。根据病毒表面蛋 白抗原的变异，可将RSV分为两种类型：RSV A型和RSV B型。RSV是5岁以下婴幼 儿呼吸道感染的最主要病因，此外，RSV还能感染其他各个年龄组的人群，并导 致严重的呼吸道疾病，其病情在老年人中尤为严重。
HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、 2019-nCoV、FluA、FluB、HAdV、RSV都是呼吸道病原体，实验室常用的检测方 法包括病毒培养、血清学检测和分子生物学检测。其中，病毒培养和血清学检 测由于耗时长、灵敏度低，已不能满足临床需求。而分子生物学检测包括常规 PCR、巢式PCR、RT-PCR、Real-time PCR、MultiplexRT-PCR、恒温扩增等。目 前使用最多、发展最快的是Real-time PCR，如专利CN102732638A公布的一管多 重荧光PCR检测人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1、SARS；CN110724764A公布的荧光定量PCR检测人冠状病毒OC43、HKU1和呼吸道合胞病毒B型；CN104059997A 公布的一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人 冠状病毒的试剂盒，一管内实现6种病原体的检测；CN110144422A公布的同时检 测MERS、NL63、OC43、HKU1四种人冠状病毒的试剂盒等。这些公布的检测方法， 虽然具有较高的灵敏度，但受到荧光通道的限制，无法实现多种病原体在单管 内的同时检测。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员 所公知的现有技术。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种基于熔解曲线快速检测HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV、FluA、FluB、HAdV、 RSV的试剂盒，能够实现一个荧光通道中同时检测多种病原体，并能够满足较高 的灵敏度，从而克服上述现有技术中的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病 原体的探针及引物组合物，其特征在于,包括以下组分：
包含1种特异性探针及包含2种引物的第一引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第二引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第三引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.5-6所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第四引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.7-8所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第五引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.9-10所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第六引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.11-12所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第七引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.13-14所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第八引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.15-16所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第九引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.17-18所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十引物组，其中所述一种特异性探 针具有如SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.19-20所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十一引物组，其中所述一种特异性 探针具有如SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.21-22所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十二引物组，其中所述一种特异性 探针具有如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.23-24所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十三引物组，其中所述一种特异性 探针具有如SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.25-26所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十四引物组，其中所述一种特 异性探针具有如SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有 如SEQ ID NO.27-28所示的核苷酸序列。
用于快速鉴定CoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、 MERS-CoV、2019-nCoV、FluA、FluB、HAdV、RSV及RNaseP的特异性引物， 包括：
SEQ ID No.1：GAGTTTGCAGAAGGACAAGGTG；
SEQ ID No.2：GTCTGTACCAGTACCCCTTAGCTT；
SEQ ID No.3：TGATGGTGTTGTTTGGGTTG；
SEQ ID No.4：AGAGCTCTGGAGGCAAAGC；
SEQ ID No.5：TAAGCTTATAGGCTATTGGAATGTTC；
SEQ ID No.6：TTTATGAGGTCCTGTGCCAAG；
SEQ ID No.7：TGTCTTATACTCCCGGTCATYATG；
SEQ ID No.8：CCCAAGAAGTTTTCTTGAGGATT；
SEQ ID No.9：TGGACCCACAGATTCAACTGA；
SEQ ID No.10：CGCAGTATTATTGGGTAAACCTTG；
SEQ ID No.11：AACCTTGCAAAAGTTTGCACTTA；
SEQ ID No.12：CCAAAATAGCAAGTACACATGAAAC；
SEQ ID No.13：GAGTTTATGTTATGGTGTAAGGATGG；
SEQ ID No.14：TTAAAGAGGGATGGCATTGC；
SEQ ID No.15：GCCCGGTACTAAGCTTCCTAAA；
SEQ ID No.16：GCTAGAGGCTCTTGAAGATGATTG；
SEQ ID No.17：CCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCT；
SEQ ID No.18：TATACTGCGTGAGTGCACTAAGC；
SEQ ID No.19：GATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTAC；
SEQ ID No.20：CCATATGATGCCGTCTTTGTTA；
SEQ ID No.21：CCAATCYTGTCACCTYTGACTAARGG；
SEQ ID No.22：AGCGTAGACGYTTTGTCCARAA；
SEQ ID No.23：CAAAGCCAATTCGAGCAGC；
SEQ ID No.24：CTAATTGTCTCCCTCTTCTGGTGATA；
SEQ ID No.25：GCYACCCCWTCGMTGCC；
SEQ ID No.26：CGGRCTCAGGTACTCCGA；
SEQ ID No.27：GTGGTATCAYTAACYGGTAAAGAAAGA；
SEQ ID No.28：CCATATCTTGTCARACTYTCAGGG；
SEQ ID No.29：cacttcgaggtggttgacagt；
SEQ ID No.30：acgaatgtcttgaaaggtacgg。
用于快速鉴定CoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、 MERS-CoV、2019-nCoV、FluA、FluB、HAdV、RSV及RNaseP的特异性探针， 包括：
SEQ ID No.31：CCTATTGCACCAGGAGTCCCAGCTACT；
SEQ ID No.32：CCAGTCTTGGTAATCGCAAACGTAATC；
SEQ ID No.33：CGTTTCAGAACTAGAAAGGGCAAACGG；
SEQ ID No.34：CTGGAAGTAGAAGCTCCTCTGGAAATCG；
SEQ ID No.35：CCAGAATGGAGGACGCAATGGG；
SEQ ID No.36：CTCACCACAGCTTACACTTGTGTTTCCG；
SEQ ID No.37：CCTTCTACCCTCGACTCCAGGCTTCTG；
SEQ ID No.38：CTTCCACATTGAGGGGACTGGAGGC；
SEQ ID No.39：CTGTGTGGCTGTCACTCGGCTG；
SEQ ID No.40：CCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTT；
SEQ ID No.41：CTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACT；
SEQ ID No.42：CTGCGGTGGGAGTCTTATCCCAATTTG；
SEQ ID No.43：TACATGCACATCGCCGGACAGGA；
SEQ ID No.44：AGTGTGGGTAGAATGTTTGCTATGCAACCAG；
SEQ ID No.45：tcctctctgtgattcccacaacgat。。
优选地，上述技术方案中，还包括第十五引物组，包含1种特异性探针及 包含2种引物，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序 列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.29-30所示的核苷酸序列。
优选地，上述技术方案中，特异性探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基 团，其中荧光基团选自FAM、VIC、ROX、CY3或CY5；淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、 BHQ3、DABCYL和Tamra中的任意一种或几种。
优选地，上述技术方案中，第一引物组用于检测冠状病毒OC43，第二引物 组用于检测冠状病毒NL63，第三引物组用于检测冠状病毒229E，第四引物组用 于检测冠状病毒HKU1，第五引物组用于检测SARS冠状病毒，第六、七、八引物 组用于检测MERS冠状病毒，第九、十引物组用于检测新型冠状病毒2019-nCoV， 第十一引物组用于检测甲型流感病毒，第十二引物组用于检测乙型流感病毒， 第十三引物组用于检测腺病毒，第十四引物组用于检测呼吸道合胞病毒，第十 五引物组用于检测内标。
一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的检测试剂盒，包括 RT-PCR反应液、酶混合液和引物探针混合液，引物探针混合液包含第一引物组 至第十四引物组所示的引物，以及第一引物组至第十四引物组所示的特异性探 针。
优选地，上述技术方案中，引物探针混合液包含第十五引物组所示的引物 和特异性探针。
优选地，上述技术方案中，引物探针混合液含有SEQ ID No.1-30所述的特 异性引物和SEQ ID No.31-45所述的特异性探针，其中，SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、 SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、 SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.30的浓度为0.4μM； SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28的浓度为0.04μM； SEQID No.31-45的浓度均为0.2μM。
优选地，上述技术方案中，RT-PCR反应液包括PCR缓冲液、2.5-6mM MgCl2、 10-30mM dNTPs及去RNA酶水；所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、 逆转录酶。
一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的检测方法，包括样品核 酸制备和RT-PCR扩增步骤，RT-PCR扩增步骤中采用了第一引物组至第十四引物 组所示所示的引物，以及第一引物组至第十四引物组所示的特异性探针。
优选地，上述技术方案中，RT-PCR扩增步骤程序为：42-50℃10-30min； 93-95℃5-10min；93-95℃10-15s，55-60℃40-60s，共进行45个循环。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体检测试剂盒采用非对 称多重荧光定量PCR和熔解曲线相结合的技术，根据不同的靶基因分别设计特异 性Taqman及MGB探针，尤其是对MERS-CoV、2019-nCoV进行多靶标同时检测，确 保检测特异性的同时，避免了假阳性的出现。同时，本发明设置了内标，可有 效避免检测结果的假阴性，对检测样本的采集、运输和提取过程进行监控。此 外，根据不同基因扩增片段与荧光探针的结合，在不同荧光通道产生不同位置 的熔解曲线峰，能够快速有效的实现多病原体的单管同时检测，大大提高了检 测通量。
附图说明：
图1为HKU1-CoV、OC43-CoV、229E-CoV、NL63-CoV、FluA型别的熔解曲线示 意图。
图2为SARS-CoV、MERS-CoV、FluB型别的熔解曲线示意图。
图3为2019-nCoV、HadV、RSV型别的熔解曲线示意图。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范 围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括” 或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部 分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本发明的目的是提供一种基于熔解曲线快速检测HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV、FluA、FluB、HAdV、 RSV的组合物及试剂盒，能够在一个反应体系中同时检测出HCoV-OC43、 HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV、FluA、 FluB、HAdV、RSV。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明根据OC43-CoV、NL63-CoV、229E-CoV、HKU1-CoV、SARS-CoV、FluB、 RSV的N基因；MERS-CoV的ORF1a、ORF1b、N基因；2019-nCoV的ORF1ab、N基因； FluA的M基因；HadV的HEXON基因的特异性设计一组特异性引物及Taqman或MGB探 针，利用熔解曲线技术，根据熔解温度的变化快速鉴定CoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV、FluA、FluB、HAdV、RSV。同时，本发明设置了内标，内标为人核糖核酸酶P(RNaseP)，可有效避 免检测结果的假阴性，对检测样本的采集、运输和提取过程进行监控。
用于快速鉴定CoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、 MERS-CoV、2019-nCoV、FluA、FluB、HAdV、RSV及RNaseP的特异性引物，包括：
SEQ ID No.1：GAGTTTGCAGAAGGACAAGGTG；
SEQ ID No.2：GTCTGTACCAGTACCCCTTAGCTT；
SEQ ID No.3：TGATGGTGTTGTTTGGGTTG；
SEQ ID No.4：AGAGCTCTGGAGGCAAAGC；
SEQ ID No.5：TAAGCTTATAGGCTATTGGAATGTTC；
SEQ ID No.6：TTTATGAGGTCCTGTGCCAAG；
SEQ ID No.7：TGTCTTATACTCCCGGTCATYATG；
SEQ ID No.8：CCCAAGAAGTTTTCTTGAGGATT；
SEQ ID No.9：TGGACCCACAGATTCAACTGA；
SEQ ID No.10：CGCAGTATTATTGGGTAAACCTTG；
SEQ ID No.11：AACCTTGCAAAAGTTTGCACTTA；
SEQ ID No.12：CCAAAATAGCAAGTACACATGAAAC；
SEQ ID No.13：GAGTTTATGTTATGGTGTAAGGATGG；
SEQ ID No.14：TTAAAGAGGGATGGCATTGC；
SEQ ID No.15：GCCCGGTACTAAGCTTCCTAAA；
SEQ ID No.16：GCTAGAGGCTCTTGAAGATGATTG；
SEQ ID No.17：CCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCT；
SEQ ID No.18：TATACTGCGTGAGTGCACTAAGC；
SEQ ID No.19：GATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTAC；
SEQ ID No.20：CCATATGATGCCGTCTTTGTTA；
SEQ ID No.21：CCAATCYTGTCACCTYTGACTAARGG；
SEQ ID No.22：AGCGTAGACGYTTTGTCCARAA；
SEQ ID No.23：CAAAGCCAATTCGAGCAGC；
SEQ ID No.24：CTAATTGTCTCCCTCTTCTGGTGATA；
SEQ ID No.25：GCYACCCCWTCGMTGCC；
SEQ ID No.26：CGGRCTCAGGTACTCCGA；
SEQ ID No.27：GTGGTATCAYTAACYGGTAAAGAAAGA；
SEQ ID No.28：CCATATCTTGTCARACTYTCAGGG；
SEQ ID No.29：cacttcgaggtggttgacagt；
SEQ ID No.30：acgaatgtcttgaaaggtacgg。
用于快速鉴定CoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、 MERS-CoV、2019-nCoV、FluA、FluB、HAdV、RSV及RNaseP的特异性探针，包括：
SEQ ID No.31：CCTATTGCACCAGGAGTCCCAGCTACT；
SEQ ID No.32：CCAGTCTTGGTAATCGCAAACGTAATC；
SEQ ID No.33：CGTTTCAGAACTAGAAAGGGCAAACGG；
SEQ ID No.34：CTGGAAGTAGAAGCTCCTCTGGAAATCG；
SEQ ID No.35：CCAGAATGGAGGACGCAATGGG；
SEQ ID No.36：CTCACCACAGCTTACACTTGTGTTTCCG；
SEQ ID No.37：CCTTCTACCCTCGACTCCAGGCTTCTG；
SEQ ID No.38：CTTCCACATTGAGGGGACTGGAGGC；
SEQ ID No.39：CTGTGTGGCTGTCACTCGGCTG；
SEQ ID No.40：CCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTT；
SEQ ID No.41：CTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACT；
SEQ ID No.42：CTGCGGTGGGAGTCTTATCCCAATTTG；
SEQ ID No.43：TACATGCACATCGCCGGACAGGA；
SEQ ID No.44：AGTGTGGGTAGAATGTTTGCTATGCAACCAG；
SEQ ID No.45：tcctctctgtgattcccacaacgat。
所述特异性探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自 FAM、VIC、ROX、CY3或CY5；淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和Tamra 中的任意一种或几种。
一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的方法，具体包括如下步 骤：
(1)模板DNA的提取：样本核酸提取采用Qiagen公司的
Viral RNA MiniKit试剂盒，制备样本核酸RNA体积60μL。
(2)配制试剂反应体系为25μL，反应体系组成如表1所示：
表1试剂盒的试剂反应体系
| 反应体系 | 加量(μL)/人份 |
| RT-PCR反应液 | 7.5 |
| 酶混合液 | 5 |
| 引物探针反应液 | 7.5 |
| 样本核酸 | 5 |
| 总体积 | 25 |
(3)设置荧光PCR扩增和熔解曲线程序
按照以下程序进行RT-PCR扩增：42-50℃10-30min；93-95℃5-10min； 93-95℃10-15s，55-60℃40-60s，共进行45个循环；
按照以下程序进行熔解曲线分析：93-95℃10-15s；40-45℃30-60s；从 40-85℃开始运行熔解曲线分析程序。
所述RT-PCR反应液包括PCR缓冲液、2.5-6mM MgCl2、10-30mM dNTPs(dATP： dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:1)及去RNA酶水。
所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶。
所述引物探针混合液含有上述的30条特异性引物(SEQ ID No.1-30)，其 中，SEQID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、 SEQ ID No.11、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、 SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、 SEQ ID No.30的浓度为0.4μM；SEQ ID No.2、SEQID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.28的浓度为0.04μM；上述的15条特异性探针(SEQ ID No.31-45)浓度均为0.2μM。
进一步地，还包括阳性对照和空白对照，所述阳性对照为人工合成的基因， 空白对照为灭菌的去RNA酶水。
(4)结果判读：
阴阳性判定：
扩增曲线呈S形且Ct值≤37，判定为阳性；Ct值>40，判定为阴性；Ct值 37<Ct≤40，判定为可疑，需重复检测。
当阴性对照检测阴性且阳性对照检测阳性时，若待测样本检测阳性，则结 果判定为病毒核酸阳性；当阴性对照检测阴性且阳性对照检测阳性时，若待测 样本检测阴性，则结果判定为病毒核酸阴性；除此之外的其他所有情况判定为 可疑或检测失败，需重复检测。
病毒型别判定：
针对病毒核酸检测阳性样本，当熔解曲线峰值在54.3±1.0℃时，判定为 HKU1-CoV阳性；当熔解曲线峰值在60.5±1.0℃时，判定为OC43-CoV阳性；当熔 解曲线峰值在66.1±1.0℃时，判定为229E-CoV阳性；当熔解曲线峰值在 72.1±1.0℃时，判定为NL63-CoV阳性；当熔解曲线峰值在80.2±1.0℃时，判 定为FluA阳性；当熔解曲线峰值在54.2±1.0℃时，判定为SARS-CoV阳性；当熔 解曲线峰值在60.4±1.0℃、66.3±1.0℃、73.4±1.0℃时，判定为MERS-CoV阳 性；当熔解曲线峰值在80±1.0℃时，判定为FluB阳性；当熔解曲线峰值在 55.1±1.0℃、61.3±1.0℃时，判定为2019-nCoV阳性；当熔解曲线峰值在 69.8±1.0℃时，判定为HAdV阳性；当熔解曲线峰值在76±1.0℃时，判定为RSV 阳性；当熔解曲线峰值在上述所有范围之外时为检测失败，需重复检测。
实施例1特异性引物和探针的设计
通过NCBI搜索下载OC43-CoV、NL63-CoV、229E-CoV、HKU1-CoV、SARS-CoV、 FluB、RSV的N基因，MERS-CoV的ORF1a、ORF1b、N基因，2019-nCoV的ORF1ab、 N基因，FluA的M基因，HadV的HEXON基因以及RNaseP基因，利用Primer 3软件， 分别设计上述病原体的特异性扩增引物和Taqman或MGB探针，由上海硕颖生物科 技有限公司合成。用于检测的引物及探针如表2所示：
表2引物及探针序列信息
实施例2样本核酸提取
(1)临床样本采集、保存及运输：适用于咽拭子、痰液样本采集。咽拭子 样本采集按照《临床护理实践指南》(2011版)中关于咽拭子采集法进行采集。 采集病人发病3日内的咽拭子样本，用专用采样棉签，棉签材质为脱脂棉和木棒。 用压舌板轻压舌部，迅速用棉签擦拭患者口腔两侧腭弓及咽、扁桃体的分泌物， 避免咽拭子触和其他部位；迅速将棉签放入装有3-5mL生理盐水的采集管中，在 靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖密封，以防干燥。痰液样本采集按照《肺结 核诊断标准》WS288-2008，以清晨第一口痰为宜，先用清水漱口，嘱患者用力 咳出深部的痰于无菌样本保存管中，密封即可送检，痰液以3-5mL为宜。样本采集后应及时检测，2℃-8℃保存3天内完成检测，-20±5℃保存期4个月，-70℃ 可以保存12个月。样本避免反复冻融，冻融次数不能超过5次，采用冰袋低温运 输不能超过3天。
(2)核酸提取：样本核酸提取采用Qiagen公司的
Viral RNA Mini Kit试剂盒，按照说明书进行核酸提取。
实施例3对提取的样本核酸进行检测
按照表3进行扩增反应体系的配制：
表3扩增反应体系配制表
按照以下程序进行RT-PCR扩增：42-50℃10-30min；93-95℃5-10min； 93-95℃10-15s，55-60℃40-60s，共进行45个循环；
按照以下程序进行熔解曲线分析：93-95℃10-15s；40-45℃30-60s；从 40-85℃开始运行熔解曲线分析程序。
实施例4结果分析
根据熔解曲线峰图和内标扩增情况，确定样本中是否存在待检的七种冠状 病毒和四种其他呼吸道病毒，根据荧光通道的类型和熔解温度，来判断感染的 病毒类型，各型别病毒对应的熔解温度如表4所示：
表4结果判读
实施例5特异性分析
采用本发明方法对肺炎衣原体、结核分枝杆菌减病毒、嗜肺军团菌、肠道 病毒、人副流感病毒、人博卡病毒、巨细胞病毒、人偏肺病毒、EB病毒、鼻病 毒、1.0×106CFU/mL百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、 化脓链球菌、唾液链球菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、嗜麦芽窄食单胞 菌等呼吸道样本进行多重荧光定量PCR扩增和熔解曲线分析。
实施例6灵敏度分析
将含有各病毒目的片段的人工合成质粒按照10倍倍比梯度稀释，多重荧光 定量PCR扩增和熔解曲线分析其检测的最低检测限，检测下限为103copies/mL。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这 些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导， 可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本 发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本 发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围 意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 江苏硕世生物科技股份有限公司
<120> 一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的探针及引物组合物
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagtttgcag aaggacaagg tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgatggtgtt gtttgggttg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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agcgtagacg ytttgtccar aa 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tcctctctgt gattcccaca acgat 25
Claims (10)
1.一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的探针及引物组合物，其特征在于,包括以下组分：
包含1种特异性探针及包含2种引物的第一引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第二引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第三引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.5-6所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第四引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.7-8所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第五引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.9-10所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第六引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.11-12所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第七引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.13-14所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第八引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.15-16所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第九引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.17-18所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.19-20所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十一引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.21-22所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十二引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.23-24所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十三引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.25-26所示的核苷酸序列；
包含1种特异性探针及包含2种引物的第十四引物组，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.27-28所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的探针及引物组合物，其特征在于，还包括第十五引物组，包含1种特异性探针及包含2种引物，其中所述一种特异性探针具有如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ IDNO.29-30所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的探针及引物组合物，其特征在于，所述特异性探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自FAM、VIC、ROX、CY3或CY5；淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和Tamra中的任意一种或几种。
4.根据权利要求1或2所述的快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的探针及引物组合物，其特征在于，第一引物组用于检测冠状病毒OC43，第二引物组用于检测冠状病毒NL63，第三引物组用于检测冠状病毒229E，第四引物组用于检测冠状病毒HKU1，第五引物组用于检测SARS冠状病毒，第六、七、八引物组用于检测MERS冠状病毒，第九、十引物组用于检测新型冠状病毒2019-nCoV，第十一引物组用于检测甲型流感病毒，第十二引物组用于检测乙型流感病毒，第十三引物组用于检测腺病毒，第十四引物组用于检测呼吸道合胞病毒，第十五引物组用于检测内标。
5.一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的检测试剂盒，包括RT-PCR反应液、酶混合液和引物探针混合液，其特征在于：引物探针混合液包含第一引物组至第十四引物组所示的引物，以及第一引物组至第十四引物组所示的特异性探针。
6.根据权利要求5所述的快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的检测试剂盒，其特征在于，引物探针混合液包含第十五引物组所示的引物和特异性探针。
7.根据权利要求5或6所述的快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的检测试剂盒，其特征在于，所述引物探针混合液含有SEQ ID No.1-30所述的特异性引物和SEQ IDNo.31-45所述的特异性探针，其中，SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30的浓度为0.4μM；SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28的浓度为0.04μM；SEQ ID No.31-45的浓度均为0.2μM。
8.根据权利要求5所述的快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液包括PCR缓冲液、2.5-6mM MgCl2、10-30mM dNTPs及去RNA酶水；所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶。
9.一种快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的检测方法，包括样品核酸制备和RT-PCR扩增步骤，其特征在于，RT-PCR扩增步骤中采用了第一引物组至第十四引物组所示所示的引物，以及第一引物组至第十四引物组所示的特异性探针。
10.根据权利要求8所述的快速检测七种冠状病毒和其他呼吸道病原体的检测方法，其特征在于，RT-PCR扩增步骤程序为：42-50℃ 10-30min；93-95℃ 5-10min；93-95 ℃ 10-15s，55-60 ℃ 40-60s，共进行45个循环。
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