CN110387439B - 用于腺病毒检测与分型的引物和探针、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子学生物检测领域，更具体的，涉及腺病毒检测领域。本发明提供了一种引物和探针，其可特异性地检测腺病毒并对腺病毒3型和7型进行分型，与此同时，本发明还提供了所述引物和探针用于检测腺病毒的用途，包含所述引物和探针的试剂盒以及用于检测腺病毒的方法。

Description

用于腺病毒检测与分型的引物和探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子学生物检测领域，更具体的，属于人腺病毒检测领域。

背景技术

腺病毒最早是1952年-1953年，在美国密苏里州，由Rowe等在人扁桃腺组织分离得到。人腺病毒（Human Adenovirus，HAdV）属于腺病毒科（Adenoviridae）的哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus），为DNA病毒，无包膜，病毒衣壳呈二十面体对称结构，直径约70~90nm，其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列，每个病毒颗粒包含一个双链DNA，由252个直径8~10nm的壳粒组成，壳粒排列在三角形的面上，每边6个，其中240个为六邻体（Hexon），另12个为五邻体。腺病毒六邻体中99%以上的变异主要集中在于7个高变区HVRs中，所以腺病毒型特异性和种特异性定位于这些区域，测定人腺病毒六邻体蛋白高变区序列则有助于确定分离到的毒株型别。

根据HAdV基因组的核苷酸序列特点、Hexon蛋白和Fiber蛋白特点及免疫原性，将HAdV分为７组（HAdV A-G），到目前为止已经鉴定的有67个不同的型别。有三分之一的腺病毒与人类疾病相关，主要感染人类呼吸道和消化道，其中1、2、3、4、6、7、8、11、14、21、37、40和41型腺病毒等容易引起急性呼吸道疾病、流行性眼角膜结膜炎（红眼病）、急性咽结膜炎、婴幼儿致死性肺炎、胃肠炎等。在所有儿童的呼吸道疾病中大概有5%-15%的感染是由腺病毒引起的引起。

在不同国家、不同地区流行的腺病毒都会有所不同，有些型别可能在各个国家或各个大陆之间交替占据主导地位。

存在对更适合我国流行的腺病毒检测的产品的需求。

荧光定量PCR技术目前已用于腺病毒的检测中。例如，中国专利公开CN102140549A公开了一种腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其通过一对引物和探针能够检测出腺病毒，但其并未对灵敏度和特异性进行研究。中国专利公开CN103160619 A公开了一种腺病毒多重荧光定量PCR试剂盒，其可以检测出腺病毒，并且还可以对B和E亚群进行分类，但其并未对特异性进行探讨，并且也不适合我国流行的腺病毒的检测。

因此，现有技术需要能够适合我国流行的腺病毒的检测，并且灵敏度高、特异性好的基于实时荧光定量PCR的产品。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了基于实时荧光定量PCR技术的腺病毒检测产品。

第一方面，本发明提供了一种用于检测腺病毒并对腺病毒3型和7型进行分型的引物和探针，所述引物和探针包括：

如SEQ ID NO:4所示的腺病毒3、7型共用上游扩增引物和如SEQ ID NO:5所示的腺病毒3、7型共用下游扩增引物；

如SEQ ID NO:6所示的腺病毒3型的探针和如SEQ ID NO:7所示的腺病毒7型的探针。

如前所述，不同国家、不同地区流行的腺病毒都会有所不同。本发明人通过研读相关报道后发现腺病毒血清型1-7占婴儿和儿童腺病毒感染的80%以上。美国从人群中（儿童和成年人）分离到的腺病毒HAdV-3占34.6%、HAdV-2占24.3%、HAdV-1占17.7%、HAdV-5占5.3%、HAdV-4占4.8%、HAdV-7占3%；加拿大流行的血清型为HAdV-3占46%、HAdV-2占26%、HAdV-1占18%；英国最常见的血清型依次为HAdV-2（占18.6%）、HAdV-3（占14.9%）、HAdV-1（占12.1%）。

而在亚洲地区，发明人发现腺病毒3型和腺病毒7型在感染中占主要地位。例如韩国一项调查显示，1991-2007年，在韩国流行的腺病毒以HAdV-3和HAdV-7居多（分别为37%、23.3%）。从上述流行病学资料中可以看出，HAdV-3和HAdV-7在不同时期全世界各国家都占有重要地位。我国也有一些类似数据，据此，使用本发明的引物和探针，能够检测腺病毒并同时对腺病毒3型和7型进行分型，从而更好地适合我国流行的腺病毒的检测，帮助医生识别重症，有利于医生及时采取相对应的治疗措施，如适当氧疗和呼吸支持、血液净化，抑制过度炎症反应、保护脏器功能、及时治疗嗜血细胞综合症等，而对于轻症病例，多呈自限性，避免过治疗，如使用广谱抗生素、糖皮质激素、进行支气管镜检查等。

此外，在本发明提供的引物和探针中，对3、7型腺病毒共用一对引物进行扩增；而不是传统意义上3型使用一对引物，对7型使用另一对引物进行扩增。使用一对共用引物进行扩增要求找到仅对3、7型腺病毒保守但对其它类型腺病毒不保守的序列作为扩增片段，从而不可避免地为引物设计带来了难度。共用引物的设计不但减少了检测成本、简便了操作，并且由于减少引物数量的加入使得引物之间的相互干扰也减少，使得结果更加准确、最低检测限更加低。

另一方面，针对上述共用引物，本发明提供了针对3型腺病毒的一个探针，以及针对7型腺病毒的另一个探针。如前所述，共用引物设计时需要寻找对于3型和7型均相对保守的区域，而这段区域不可避免地对后续3型和7型腺病毒的探针设计带来限制，使得寻找能够区分3型和7型腺病毒的探针序列的不保守区域变得更为困难。但如此一来，本发明实现了对3型和7型腺病毒的区分，从而实现重症感染与一般感染的区分，有利于病情评估和进一步的治疗方案确定。

进一步地，本发明的引物和探针还包括了如下的其余引物和探针：

如SEQ ID NO:1所示的腺病毒通用型上游扩增引物、如SEQ ID NO:2所示的腺病毒通用型下游扩增引物，以及如SEQ ID NO:3所示的腺病毒通用型的探针。

同时使用腺病毒通用型引物和探针，可以在检测腺病毒3型和7型的基础上，同时检测出其余类型的腺病毒，并且通用型引物和探针也会进一步保证腺病毒3型和7型的检测的准确度。因此，使用本发明的引物和探针，能够检测所有类型的腺病毒并同时对腺病毒3型和7型进行分型。而随着检测类型的增多，引物设计的整体难度会进一步增加。原因在于，我们不但要保证这些检测类型各自的特异性和灵敏度，还要保证避免这些引物和探针直接的互相影响（诸如形成二聚体等）。

本发明所述的引物和探针，使用了实时荧光定量PCR和多重PCR技术，一管PCR反应体系中能同时检测腺病毒通用型以及腺病毒3型和7型，一个样品只需进行一次核酸提取和一次PCR检测，就能得出腺病毒定性和分型两个检测结果。其方法简单，结果准确，且易于推广，同时本发明所述的引物和探针的灵敏度高，对于通用型、3型以及7型检测的检测下限均低至2.00E+02拷贝/mL，并且不会受到其他常见呼吸道病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、博卡病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒以及甲型流感病毒）的干扰，特异性好。

进一步地，本发明的引物和探针还包括：用作内标检测的引物和探针。具体地，用作内标检测的引物和探针可包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

在一个实施方式中，内标上游引物具有SEQ ID NO:8所示的序列，内标下游引物具有SEQ ID NO:9所示的序列，内标探针具有SEQ ID NO:10所示的序列。

也就是说，本发明的引物和探针可进一步包括检测人管家基因GAPDH的内标引物以及内标探针。其可与本发明的引物和探针中的其它引物和探针联用且互不影响。内标引物和探针的使用能够判断本次检测是否有效，进一步确保所述引物和探针的检测准确性。

本发明的引物和探针中的探针可携带有用于实时荧光PCR检测的荧光报告基团和荧光猝灭基团。

在一些实施方式中，本发明的引物和探针中探针上的荧光报告基团可互不干涉地选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE。

在一些实施方式中，本发明的引物和探针中探针上的荧光猝灭基团可互不干涉地选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB-λ、Dabcyl-λ、Eclipse-λ、TAMRA。

在优选的实施方式中，本发明腺病毒3型、腺病毒7型、腺病毒通用型以及内标探针上的荧光报告基团互不相同。

在一个具体的实施方式中，腺病毒3型探针的荧光报告基团为CY5，腺病毒7型探针的荧光报告基团为HEX或VIC，腺病毒通用型探针的荧光报告基团为FAM，以及内标探针的荧光报告基团为ROX。

在一个具体的实施方式中，腺病毒3型探针的荧光猝灭基团为BHQ2，腺病毒7型探针的荧光猝灭基团为BHQ1，腺病毒通用型探针的荧光猝灭基团为BHQ1，以及内标探针的荧光猝灭基团为BHQ2。

在第二方面，本发明还提供了上述引物和探针在制备检测腺病毒并对腺病毒3型和7型进行分型的试剂盒中的用途。

在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物和探针。

进一步地，所述试剂盒还包括提取DNA所需试剂、Mg²⁺、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。

在一个具体的实施方式中，各成分具体终浓度为扩增腺病毒的上下游引物0.1µM-0.5µM、检测腺病毒的探针0.1µM-0.5µM、内标上下游引物0.05µM-0.3µM、内标探针0.05µM-0.3µM。

在第四方面还提供了本发明的试剂盒用于腺病毒检测的用途。

在第五方面，本发明提供了用于检测腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

1）提取待测样品的DNA；

2）使用上述本发明的引物和探针或试剂盒对步骤1）获得的DNA进行荧光定量PCR检测；

3）获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样品可以是来自人消化道或者呼吸道分泌物，但不限于此。

进一步地，所述步骤2）中还包括以下组分和浓度：

组份                体积

Mg²⁺ （1M）            0.1-0.2µL（优选0.15µL）

dNTPs（100mM）        0.5-1µL（优选0.8µL）

PCR缓冲液           补至45µL

聚合酶（5U）          1-3µL（优选2µL）。

在具体的实施方式中，步骤2）中的荧光定量PCR反应如下所示：

在第六方面、本发明提供上述检测方法用于腺病毒检测的用途。

本发明基于TaqMan荧光探针法和多重PCR技术，采用3种荧光基团分别标记3个腺病毒探针，以指示不同腺病毒靶标的扩增情况，当检测样品中含有达到最低检测限的腺病毒核酸时，相应的荧光信号增长应出现增长。通过出现荧光信号增长的通道可区分样品为人腺病毒3型，还是7型，还是除3、7型外的其他型别。同时，采用第4种荧光基团标记内标探针，用于指示对人管家基因GAPDH的扩增情况，作为内标对采样和核酸提取过程进行质控，防止假阴性的产生。

质控品分为阳性对照和阴性对照，用来监控整个过程可能出现的异常结果。阴性对照由人工合成的GAPDH管家基因目的片段克隆质粒稀释而成，模拟正常人的咽拭子样品，监控操作过程有无污染等，用于监控假阳性结果的产生。阳性对照由人工合成的含腺病毒Hexon基因保守区域、腺病毒3型、腺病毒7型高变区靶序列的克隆质粒混合后稀释而成，用于监控扩增体系有无异常，进一步防止假阴性结果的产生。

上述克隆质粒含有的病原体目标保守DNA序列如下：

SEQ ID NO:11（人腺病毒Hexon基因保守区序列）：

5'-GCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGGCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGACACGTACTTCAGCCTGGGCAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCTCCCACCCACGATGTGACCACGGACCGGTCCCAGCGTCTGACGCTGCGCTTCGTGCCC-3'；

SEQ ID NO:12（人腺病毒3型Hexon基因高变区保守序列）：

5'-CAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAATTTAGAAACCCCACAGTGGCGCCCACCCACGATGTGACCACCGACCGTAGCCAGCGCCTGATGCTGCGCTTCGTGCCCGTTGACCGGGAAGACAATACCTACTCTTACAAAGTTCGCTACACGCTGGCTGTAGGCGACAACAGAGTGCTTGACATGGCCAGCACATTCTTTGACATTCGGGGGGTGCTTGATAGAGGTCCTAGCTTCA-3'；

SEQ ID NO:13（人腺病毒7型Hexon基因高变区保守序列）：

5'-CAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAGTTTAGAAACCCCACAGTGGCGCCCACCCACGATGTGACCACCGACCGTAGCCAGCGACTGATGCTGCGCTTCGTGCCCGTTGACCGGGAGGACAATACATACTCTTACAAAGTGCGGTACACCCTCGCCGTGGGCGACAACAGAGTGCTTGACATGGCCAGCACATTCTTTGACATTAGGGGGGTGCTTGATAGAGGTCCTAGCTTCA-3'；

SEQ ID NO:14（GAPDH人管家基因内标序列）：

5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCATCAATGACCCCTTCATTGACCTCAACTACATGGTTTACATGTTCCAATATGATTCCACCCATGGCAAATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATCTTCCAGGAG-3'。

附图说明

图1为腺病毒通用型阳性样品检测的结果图；

图2为腺病毒3型阳性样品检测的结果图；

图3为腺病毒7型阳性样品检测的结果图；

图4为腺病毒通用型灵敏度为2.00E+02拷贝/mL的检测结果图；

图5为腺病毒3型灵敏度为2.00E+02拷贝/mL的检测结果图；

图6为腺病毒7型灵敏度为2.00E+02拷贝/mL的检测结果图；

图7为本发明引物和探针特异性检测的结果图；

图8为干扰物质对人腺病毒通用型检测的影响的结果图（含对照曲线）；

图9为干扰物质对人腺病毒3型检测的影响的结果图（含对照曲线）；

图10为干扰物质对人腺病毒7型检测的影响的结果图（含对照曲线）。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

针对人腺病毒Hexon保守区域和人腺病毒3型、人腺病毒7型高变区设计引物和荧光探针，引物和探针的具体序列如下表1所示。

表1

其中，SEQ ID NO:3的5'端具有FAM荧光基团，3'端具有BHQ1；SEQ ID NO:6的5'端具有CY5荧光基团，3'端具有BHQ2；SEQ ID NO:10的5'端具有ROX荧光基团，3'端具有BHQ2。

本实施例一共检测了样品89例。检测过程如下：

1、核酸释放：将5μl样品/质控品与等体积核酸释放剂混匀，静置5min

2、扩增：如表2所述配置PCR反应液，配置完之后进入荧光定量PCR仪扩增，选择FAM、VIC（HEX）、ROX、CY5通道，扩增程序如下：

表2

注：所述PCR反应缓冲液（PCR缓冲液）包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、20mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2%（体积/体积）曲拉通溶液和10%（体积/体积）甲酰胺溶液；所述dNTPs为dATP、dCTP、dTTP、dGTP四种脱氧核糖核苷三磷酸的混合物，作为PCR反应的原料。

3、结果分析：反应结束后，由仪器自动调整（或手动调整）阈值线以及基线开始值、结束值，计算出Ct值，判读检测结果：

A：对于FAM通道测定Ct值≤40的样品，报告为腺病毒DNA阳性。

B：对于HEX（或VIC）通道测定Ct值≤40的样品，报告为腺病毒7型DNA阳性。

C：对于CY5通道测定Ct值≤40的样品，报告为腺病毒3型DNA阳性。

D：对于FAM通道测定Ct值>40的样品，同时，内标检测为阳性（Ct值≤40），报告注明腺病毒DNA低于试剂盒检测下限；若内标Ct值>40或无显示，则该样品的检测结果无效，应查找并排除原因。

对89例样品的检测结果如图1-图3所示，其中，人腺病毒3型检出10例，人腺病毒7型检出55例，除3、7型外的其他型别检出17例，阴性样品检出7例，无混合感染样品检出，整体结果与相同的89例样品送去疾病预防控制中心鉴定的结果一致。

将一例已知浓度的腺病毒临床样品（未分型）、一例已知浓度的腺病毒3型临床样品和一例已知浓度的腺病毒7型临床样品，使用生理盐水稀释至2.00E+02拷贝/mL进行并按照实施例2中所述的相同方法进行检测，每次检测重复20次。实验结果依次如图4-图6所示，3例样品，在该浓度下，检测20次，每次均为阳性，由此可以得出，本引物和探针的灵敏度低至2.00E+02拷贝/mL。

使用表1中所示的引物和探针按照实施例2所述的方法对常见呼吸道病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、博卡病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒以及甲型流感病毒）进行检测，实验结果如图7所示，实验说明本发明的引物和探针对常见的呼吸道病原体无交叉反应。

样品中分别加入一定比例的治疗药物，如常见抗感冒药物、糖皮质激素、抗生素等对本发明的引物和探针的检测无影响。具体地说，分别含有盐酸金刚烷胺（100μg/mL）、地塞米松（50μg/mL）、薄荷醇（50μg/mL）、扎那米韦（100μg/mL）、阿奇霉素（100μg/mL）的样品，使用表1中所示的引物和探针按照实施例2所述的方法进行检测，共检测腺病毒未分型、3型、7型样品各3例，将待检测的每例样品分为6组，第1组为对照组，不添加任何干扰物质，第2-6组为实验组，分别加入上述浓度的干扰物质；实验结果依次如图8-10所示，上述药物在一定浓度下对腺病毒的检测无干扰，实验结果证明药物对检测结果无影响。

实际上，为了同时实现检测腺病毒以及对腺病毒3型和7型进行分型，在本发明的研发过程中设计了大量的引物和探针，表3示例性的列出了其中的一部分，用表3中的引物和探针替换表1中的相应引物和探针，并进行检测，检测结果如表4所示。

表3

表4

根据表4可知，引物探针10509-3和引物探针10509-7存在一定程度的漏检，准确性不高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 湖南圣湘生物科技有限公司

<120> 用于腺病毒检测与分型的引物和探针、试剂盒及方法

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcagtgggcg tacatgcaca t 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggcacgaag cgcagcgt 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgggtctgg tgcagtttgc ccg 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacacctact tcagtatggg gaacaa 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagctaggac ctctatcaag caccc 25

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caaagttcgc tacacgctgg ctgtaggcg 29

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagtgcggta caccctcgcc gtggg 25

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caacggattt ggtcgtatt 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaagatggtg atgggatttc 20

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccagggctgc ttttaactct ggtaaagt 28

<210> 11

<211> 187

<212> DNA

<213> 人腺病毒Hexon基因保守区序列

<400> 11

gcagtgggcg tacatgcaca tcgccgggca ggacgcctcg gagtacctga gcccgggtct 60

ggtgcagttt gcccgcgcca ccgacacgta cttcagcctg ggcaacaagt ttaggaaccc 120

cacggtggct cccacccacg atgtgaccac ggaccggtcc cagcgtctga cgctgcgctt 180

cgtgccc 187

<210> 12

<211> 237

<212> DNA

<213> 人腺病毒3型Hexon基因高变区保守序列

<400> 12

cagacaccta cttcagtatg gggaacaaat ttagaaaccc cacagtggcg cccacccacg 60

atgtgaccac cgaccgtagc cagcgcctga tgctgcgctt cgtgcccgtt gaccgggaag 120

acaataccta ctcttacaaa gttcgctaca cgctggctgt aggcgacaac agagtgcttg 180

acatggccag cacattcttt gacattcggg gggtgcttga tagaggtcct agcttca 237

<210> 13

<211> 237

<212> DNA

<213> 人腺病毒7型Hexon基因高变区保守序列

<400> 13

cagacaccta cttcagtatg gggaacaagt ttagaaaccc cacagtggcg cccacccacg 60

atgtgaccac cgaccgtagc cagcgactga tgctgcgctt cgtgcccgtt gaccgggagg 120

acaatacata ctcttacaaa gtgcggtaca ccctcgccgt gggcgacaac agagtgcttg 180

acatggccag cacattcttt gacattaggg gggtgcttga tagaggtcct agcttca 237

<210> 14

<211> 220

<212> DNA

<213> 人管家基因GAPDH

<400> 14

cggagtcaac ggatttggtc gtattgggcg cctggtcacc agggctgctt ttaactctgg 60

taaagtggat attgttgcca tcaatgaccc cttcattgac ctcaactaca tggtttacat 120

gttccaatat gattccaccc atggcaaatt ccatggcacc gtcaaggctg agaacgggaa 180

gcttgtcatc aatggaaatc ccatcaccat cttccaggag 220

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gttacaacaa atggggacaa tgc 23

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggcttttctt ctccttcagt agtgg 25

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cacaaacaca tttggcattg cttccatg 28

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttacagcagg agaagaaaga gcag 24

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggcttgttgt ctgcagtaat gtctt 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttggcattgc ttccatgaag ggaga 25

Claims (9)

1.一种用于检测腺病毒的引物和探针，其能对腺病毒3型和7型进行分型，所述引物和探针包括：

如SEQ ID NO:4所示的腺病毒3、7型共用上游扩增引物，和如SEQ ID NO:5所示的腺病毒3、7型共用下游扩增引物；

如SEQ ID NO:6所示的腺病毒3型的探针，和如SEQ ID NO:7所示的腺病毒7型的探针；

如SEQ ID NO:1所示的腺病毒通用型上游扩增引物、如SEQ ID NO:2所示的腺病毒通用型下游扩增引物，以及如SEQ ID NO:3所示的腺病毒通用型的探针。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其中，所述引物和探针还包括：

由SEQ ID NO:8所示的内标上游引物，SEQ ID NO:9所示的内标下游引物和SEQ ID NO:10所示的内标探针。

3.根据权利要求2所述的引物和探针，其中，所述腺病毒3型的探针带有第一荧光报告基团，所述腺病毒7型的探针带有第二荧光报告基团，所述腺病毒通用型的探针带有第三荧光报告基团，以及所述内标探针带有第四荧光报告基团；

其中，第一、第二、第三和第四荧光报告基团彼此不同。

4.根据权利要求3所述的引物和探针，其中，所述第一荧光报告基团为CY5，第二荧光报告基团为HEX或VIC，所述第三荧光报告基团为FAM且所述第四荧光基团为ROX。

5.权利要求1-4中任一项所述的引物和探针在制备检测腺病毒的试剂盒中的用途。

6.权利要求1-4中任一项所述的引物和探针在制备腺病毒3、7分型的试剂盒中的用途。

7.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的引物和探针。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括提取DNA所需试剂、Mg²⁺、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，各成分具体终浓度为扩增腺病毒的上下游引物0.1μM-0.5μM、检测腺病毒的探针0.1μM-0.5μM、内标上下游引物0.05μM-0.3μM、内标探针0.05μM-0.3μM。

Images