CN111534636A - 用于检测2019-nCoV的引物对、探针、试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测2019‑nCoV的引物对，其特征在于，所述引物对序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，或者为在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或与上述限定的核苷酸序列对具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列对。并公开了相应的探针、试剂盒、检测方法及其应用。本发明采用全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37‑39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间。

Description

用于检测2019-nCoV的引物对、探针、试剂盒、检测方法及其 应用

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及用于检测2019-nCoV的引物对、探针、试剂盒、 检测方法及其应用。

背景技术

冠状病毒(coronavirus，CoVs)是一种有包膜、非节段的单股正链RNA病毒，属于巢病 毒目冠状病毒科正冠状病毒亚科。该亚科由α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和 δ冠状病毒属共四个属组成。冠状病毒广泛存在于自然界中，其自然宿主包括人和许多哺乳 动物如鼠、猫、犬和蝙蝠等。目前，已经鉴定出六种人类冠状病毒，其中包括α属的HCo9EI-J 和HCoV-NL63,β属的HCov-OC43、HCov-HKU1、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)。最近分离出的新的冠状病毒，世界卫生组织(WHO)于2020年1月12日正式将其命名为“2019新型冠状病毒”(2019-nCoV)。

新型冠状病毒是属于β属的冠状病毒，有包膜，病毒颗粒呈圆形或者椭圆形，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。目前研究显示，与蝙蝠SARS 样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。2020年2月12日，国际病毒分类委员 会宣布该病毒的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。同日，世界 卫生组织宣布由该病毒引起的疾病正式名称为COVID-19。

建立该病毒的快速检验方法，对于早期确诊感染人员、早期治疗感染者、早期采取控制 手段以控制疫情是具有重要意义的。

传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。RT-RAA 法快速、灵敏、操作以及设备要求简便，对于当前疫情下快速检测新型冠状病毒具有重要作 用。反应过程中主要用到四种主要的酶：逆转录酶、单链结合蛋白、重组酶UvsX和DNA聚 合酶。在反应中，逆转录酶逆转录2019-nCoV RNA为cDNA，重组酶/引物复合体入侵解开 目标cDNA双链，单链结合蛋白与解开的单链结合，防止单链DNA复性，DNA聚合酶催化 链延伸。由于重组酶常温下解链双链的特性，因此整个反应得以在39℃下进行，又由于不存在传统PCR升降温过程，扩增时间得以缩短至20分钟以内。

发明内容

发明目的：本发明的一个目的是提供一种用于检测2019新型冠状病毒的引物对，所述引 物对包括下述1)-3)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列； 和在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)限定的核苷酸序列对具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列 对。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测2019-nCoV的探针，其特征在于，所述探针包 括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述探针的核苷酸序列为：

5’-CAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGT(荧光报告基团-dT)(四氢呋喃残 基F)(荧光淬灭基团-dT)TCAGACTATTGAAGTG-3’，本发明将所述探针核苷酸序列5’至 3’方向的第33位碱基修饰荧光报告基团、第34位碱基替换为四氢呋喃残基，并且第35位 碱基修饰荧光淬灭基团的物质；

2)在高严谨条件下可与1)所述的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)所述的探针的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸 序列。

优选的，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。

优选的，所述荧光报告基团为FAM。

优选的，所述荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

优选的，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

本发明对不同的荧光报告基因和淬灭基团的组合没有特殊的限定，上述荧光报告基团和 猝灭基团进行组合都可以达到相同的效果，本发明对荧光检测的仪器没有特殊的限定，采用 本领域技术人员所熟知的相应荧光检测用仪器即可。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒包括下述1)-2)所述中的至少一种：

1)上述的引物对；

2)上述的探针。

优选的，当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对中的两个 引物与所述的探针的摩尔比为4：4：1。

本发明的另一个目的是提供一种2019-nCoV的检测方法，其特征在于：所述检测方法不 包括疾病的诊断或治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：

1)上述的引物对；

2)上述的探针；

3)上述的引物对和上述的探针。

优选的，所述检测方法为：提取待检测样品的RNA进行RT-RAA反应，所述RT-RAA 反应的反应温度为39℃；反应时间在20分钟以上；

当所述检测方法同时使用了所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对中的两个引物 与所述的探针的摩尔比为4：4：1。

本发明还提供了上述引物对、探针、试剂盒、检测方法在检测2019-nCoV中的应用，所 述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。

本发明还提供了上述引物对、探针、试剂盒、检测方法在制备检测2019新型冠状病毒相 关产品中的应用。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

本发明目的是提供一种用于逆转录重组酶介导核酸扩增技术检测2019-nCoV的荧光 RT-RAA引物和荧光探针以及该荧光RT-RAA引物和荧光探针在检测2019-nCoV中的应用，该荧光RT-RAA引物和荧光探针可以快速、定性检测咽拭子样本中的2019新型冠状病毒。

本发明提供的荧光RT-RAA引物和荧光探针，应用该荧光RT-RAA引物和荧光探针检测 2019新型冠状病毒时，不依赖于昂贵的PCR仪器，且检测时间较PCR方法或荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至更高。

在RT-RAA反应过程中，2019新型冠状病毒RNA首先通过反转录酶合成cDNA，再利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以cDNA为模板合成目的产物。反应在39℃下进 行20分钟。此外，RAA技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套RAA多重荧 光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这 是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的。

本发明可以实现单管现场、快速检测2019新型冠状病毒，其它检测技术相比具有以下优 点：

1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；

2、不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37-39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结 果，大大缩短检测时间；

3、本发明提供的荧光RT-RAA引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情 快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

附图说明

图1为灵敏度实验结果图。

图2为特异性实验结果图。

图3为临床阳性样品检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三 版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于检测2019新型冠状病毒的荧光RT-RAA引物、探针的设计

针对于2019新型冠状病毒的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光RAA探 针，其序列分别是：

正向引物，如序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列：

5'-GCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTAC-3'

反向引物，如序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列：

5'-CTAGGTGTTTCCACAATGTAGGACCATGAGC-3'

寡核苷酸探针，如下所示核苷酸序列：

5’-CAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGT(FAM-dT)(THF)(BHQ-dT)TCAGACTATTGAAGTG-3’；其中：FAM-dT表示携带有荧光素基团FAM(6-Carboxyfluorescein)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；THF表示四氢呋喃(tetrahydrofuran)连接子；BHQ-dT表示携带有荧 光淬灭基团BHQ(black hole quencher)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

FAM和BHQ为常见的荧光素基团和荧光淬灭基团，采用其他荧光素基团(HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5)或荧光淬灭基团(TAMRA、Eclipse、BHQ2、BHQ3或DABCYL) 同样可达到本发明的效果。

实施例2、一种用于检测2019新型冠状病毒的荧光RT-RAA方法的建立

(一)荧光RT-RAA反应

1)样本RNA的提取：所述样本RNA可以采用德国凯杰生物工程有限公司的viralRNA核 酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

2)采用实施例1设计的正向引物、反向引物和探针，以及RAA反应试剂盒(本实施例具体 采用了江苏奇天基因生物科技有限公司的RT-RAA核酸扩增试剂盒(荧光法))，以本实施例 制备的待检测样本RNA为模板，进行扩增反应，其中反应体系如下：

25μl RT-RAA反应缓冲液(江苏奇天基因生物科技有限公司RT-RAA核酸扩增试剂盒(荧 光法)提供)；

实施例1设计的正向引物、反向引物(浓度10μM)各2μL；

0.5μL实施例1设计的探针(浓度10μM)；

5μL制备的待检测样本RNA模板；

加13μL双蒸水至47.5μL，混合均匀，然后加入到有干粉(江苏奇天基因生物科技有限 公司RT-RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)提供)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μL280mM 醋酸镁溶液并混匀。

(二)荧光检测

将上述反应管放置于RAAF-6100荧光基因检测仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)，在 39℃反应20min，进行荧光检测。

阴性对照：FAM通道无扩增曲线，且无Tt值；

阳性对照：FAM通道有扩增曲线，Tt值均≤8min；

上述对阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效， 需要重新进行实验。

4)样品检测结果判读：

当所检测的样品FAM通道均有扩增曲线，质量控制正常时，可判定2019新型冠状病毒 阳性；

当所检测的样品FAM通道无扩增曲线，且Tt值显示为Undet或No Tt，质量控制正常时， 可判定新型冠状病毒阴性。

(三)灵敏度实验

该实验验证该检测方法的最低检测限，采用浓度为1.0×106copies/反应、1.0×105copies/ 反应、1.0×104copies/反应、1.0×103copies/反应、1.0×102copies/反应、101copies/反应、 100copies/反应，等的阳性质粒作为检测限参比品，通过该实验表明该检测方法的检测限达到 10copies/反应，具体实验结果如图1所示。

图1中106、105、104、103、102、101、100分别表示浓度为1.0×106copies/反应、1.0×105copies/反应、1.0×104copies/反应、1.0×103copies/反应、1.0×102copies/反应、101copies/ 反应、100copies/反应的阳性质控品扩增曲线，阴为阴性质控品，横坐标表示反应时间，纵 坐标mv表示荧光值。图1所示结果表明，该检测方法的检测限达到10copies/反应。

(四)特异性实验

该实验选择与2019新型冠状病毒具有相同感染部位的常见病原体作为特异性参考品。特 异性参考品分别为腺病毒、寨卡病毒、乙型流感病毒、基孔肯雅病毒。利用Qigen公司的Viral 病毒RNA提取试剂盒提取以上样本中的RNA作为模板进行实验。特异性实验结果如图2所 示。

图2中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图2所示结果表明，这5种特异性 参考品均未有扩增曲线，说明该检测方法的特异性良好。

(五)临床阳性样品检测实验

选择宁波国际旅行卫生保健中心综合实验室保存的3例2019新型冠状病毒阳性样本 (SARS-COV-2-1、SARS-COV-2-2、SARS-COV-2-3)对该方法进行检测、验证。具体实验结果如图3所示。

图3中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图3所示结果表明，该检测方法扩 增效果优异，具有良好的性能。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而 理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案， 均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心

<120> 用于检测2019-nCoV的引物对、探针、试剂盒、检测方法及其应用

<141> 2020-04-09

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gcgaacaatt caacagacac tgtagacaca gtac 34

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ctaggtgttt ccacaatgta ggaccatgag c 31

Claims (12)

1.一种用于检测2019-nCoV的引物对，其特征在于，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)限定的核苷酸序列对具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列对。

2.一种用于检测2019-nCoV的探针，其特征在于，所述探针包括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述探针的核苷酸序列为：

5’-CAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGT(荧光报告基团-dT)(四氢呋喃残基F)(荧光淬灭基团-dT)TCAGACTATTGAAGTG-3’；

2)在高严谨条件下可与1)所述的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)所述的探针的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的用于检测2019-nCoV的探针，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。

4.根据权利要求3所述的用于检测2019-nCoV的探针，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM。

5.根据权利要求2所述的用于检测2019-nCoV的探针，其特征在于：所述荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

6.根据权利要求5所述的用于检测2019-nCoV的探针，其特征在于：所述荧光淬灭基团为BHQ1。

7.一种用于检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括下述1)-2)所述中的至少一种：

1)权利要求1所述的引物对；

2)权利要求2-6中任一项所述的探针。

8.根据权利要求7所述的用于检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于：当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对中的两个引物与所述的探针的摩尔比为4：4：1。

9.一种2019-nCoV的检测方法，其特征在于：所述检测方法不包括疾病的诊断或治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：

1)权利要求1所述的引物对；

2)权利要求2-6中任一项所述的探针；

3)权利要求1所述的引物对和权利要求2-6中任一项所述的探针。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法为：提取待检测样品的RNA进行RT-RAA反应，所述RT-RAA反应的反应温度为39℃；反应时间在20分钟以上；

当所述检测方法同时使用了所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对中的两个引物与所述的探针的摩尔比为4：4：1。

11.权利要求1所述引物对、权利要求2-6中任一项所述探针、权利要求7-8任一所述试剂盒、权利要求9-10任一所述检测方法在检测2019-nCoV中的应用，所述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。

12.权利要求1所述引物对、权利要求2-6中任一项所述探针、权利要求7-8任一所述试剂盒、权利要求9-10任一所述检测方法在制备检测2019-nCoV产品中的应用。

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