CN113897460B - 一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及核酸检测领域，具体公开了一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法。新型冠状病毒包括野生型及Alpha突变株、Beta突变株、Gamma突变株、Eta突变株、Delta突变株、lota突变株、Kappa突变株和Lambda突变株，引物探针组合物设计位点包括N基因、RNase P基因和S基因N501Y、E484K、K417T、L452R、E484Q、F490S、T76I、L452Q、246~253del突变型。本申请的核酸组合物、试剂盒及方法可用于同时快速检测新型冠状病毒及其主要流行突变株，具有灵敏度高，特异性好的优点。
Description
技术领域
本申请涉及核酸检测的领域，更具体地说，它涉及一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法。
背景技术
国际病毒分类委员会将新冠病毒病命名为SARS-CoV-2，是目前已知的第7种可以感染人类的冠状病毒，是继SARS-CoV和MERS-CoV之后被发现的第3 种可以引起人类严重急性呼吸道疾病的冠状病毒。SARS-CoV-2为单股正链RNA病毒，容易在复制过程中出错，大量复制可引起多种变异。一旦出现一种适应性好的变异株，则可能引起广泛传播，这对病毒监测带来了一定的风险。NCBI目前公布的突变株有以下类型： Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda。
发明人发现，现有的病毒检测手段仅能检测单一突变株，无法对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda突变株同时进行快速检测，给病毒监测和疾病治疗带来了许多不便。
发明内容
为了同时快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Alpha、Beta、Gamma、Eta、 Delta、lota、Kappa、Lambda突变株，便于病毒监测和疾病治疗，本申请提供一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法。
第一方面，本申请提供一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物，采用如下的技术方案：
一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物，多种突变株为Alpha、Beta、 Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa和Lambda中的一种或几种；
所述核酸组合物包括以下引物和探针：
针对SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，针对SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，针对SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的探针序列如SEQ IDNO.3所示；
针对SARS-CoV-2 S基因E484K位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因E484K位点的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，针对SARS-CoV-2 S基因E484K位点的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示，针对SARS-CoV-2 S基因E484K位点的探针序列如 SEQ IDNO.6所示；
针对SARS-CoV-2 S基因K417T位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因K417T位点的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，针对SARS-CoV-2 S基因K417T位点的反向引物序列如SEQ ID NO.8所示，针对SARS-CoV-2 S基因K417T位点的探针序列如 SEQ IDNO.9所示；
针对SARS-CoV-2 S基因L452R位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因L452R位点的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，针对SARS-CoV-2 S基因L452R位点的反向引物序列如SEQ ID NO.11所示，针对SARS-CoV-2 S基因L452R位点的探针序列如 SEQ IDNO.12所示；
针对SARS-CoV-2 S基因E484Q位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因E484Q位点的正向引物序列如SEQ ID NO.13所示，针对SARS-CoV-2 S基因E484Q位点的反向引物序列如SEQ ID NO.14所示，针对SARS-CoV-2 S基因E484Q位点的探针序列如 SEQ IDNO.15所示；
针对SARS-CoV-2 S基因F490S位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因F490S位点的正向引物序列如SEQ ID NO.16所示，针对SARS-CoV-2 S基因F490S位点的反向引物序列如SEQ ID NO.17所示，针对SARS-CoV-2 S基因F490S位点的探针序列如 SEQ IDNO.18所示；
针对SARS-CoV-2 S基因L452Q位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因L452Q的正向引物序列如SEQ ID NO.19所示，针对SARS-CoV-2 S基因L452Q的反向引物序列如SEQ ID NO.20所示，针对SARS-CoV-2 S基因L452Q的探针序列如SEQ ID NO.21 所示；
针对SARS-CoV-2 S基因246～253del位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2S基因 246～253del位点的正向引物序列如SEQ ID NO.22所示，针对SARS-CoV-2 S基因246～253del位点的反向引物序列如SEQ ID NO.23所示，针对SARS-CoV-2 S基因 246～253del位点的探针序列如SEQ ID NO.24所示；
针对SARS-CoV-2 S基因G75V、T76I位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因G75V、T76I位点的正向引物序列如SEQ ID NO.25所示，针对SARS-CoV-2 S基因 G75V、T76I位点的反向引物序列如SEQ ID NO.26所示，针对SARS-CoV-2 S基因G75V、 T76I位点的探针序列如SEQ ID NO.27所示；
针对SARS-CoV-2 N基因的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 N基因的正向引物序列如SEQ ID NO.28所示，针对SARS-CoV-2 N基因的反向引物序列如SEQ ID NO.29所示，针对SARS-CoV-2 N基因的探针序列如SEQ ID NO.30所示；
针对人内源基因的正、反向引物和探针，针对人内源基因的正向引物序列如SEQID NO.31 所示，针对人内源基因的反向引物序列如SEQ ID NO.32所示，针对人内源基因的探针序列如SEQ ID NO.33所示。
通过采用上述技术方案，本申请根据NCBI公布的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda突变株的核酸序列，应用Oligo 7.0引物设计软件分别设计了十一组特异性引物和探针，这十一组引物探针能够分别特异性扩增其目的基因，从而特异性的指示待测样本中新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Alpha、 Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda突变株的存在。另外，本申请采用的十一组引物探针的序列，有效减少了在同一反应体系中引物与引物之间、引物和探针之间发生相互配对、自身配对的情况，增大了引物和探针的有效性，降低了假阴性出现的概率。
因此，采用本申请设计的核酸组合物可以在一次反应中同时对样本中新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda突变株中的一种或几种进行特异性检测，与仅能检测单一突变株的引物和探针相比，缩短了检测时间，节约了检测试剂，降低了检测成本，便于病毒监测和疾病治疗。
可选的，各探针序列的5’端均采用荧光报告基团修饰，各探针序列的3’端均采用荧光淬灭基团修饰。
通过采用上述技术方案，在针对十一个突变位点设计的探针序列的两端分别引入荧光报告基团和荧光淬灭基团，当检测到不同的突变株时，不同探针序列的荧光报告基团和荧光淬灭基团反应是不同的。当荧光报告基团与荧光淬灭基团分离时，荧光报告基团可以报告荧光信号并被监测和收集；当荧光报告基团与荧光淬灭基团结合时，探针序列一端的荧光淬灭基团则可以淬灭探针序列另一端的荧光报告基团，以减少荧光信号强度。随着不同探针序列上荧光信号的不断积累，便能够得到不同的荧光信号强度，最终可通过收集的荧光信号强度来判断样本中是否存在突变株，从而判断检测样本的阴阳性，并且进行不同突变株的特异性判断。
可选的，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、TEXAS RED和 CY5，所述荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB；
SARS-CoV-2 S基因N501Y位点、K417T位点、F490S位点、L452Q位点探针序列的5’端采用FAM基团修饰，3’端采用BHQ1基团修饰；SARS-CoV-2 S基因E484K位点、L452R 位点、G75V、T76I位点、246～253del位点探针序列的5’端采用JOE基团修饰，3’端采用 BHQ1基团修饰；SARS-CoV-2 S基因E484Q位点、SARS-CoV-2 N基因探针序列的5’端采用CY5基团修饰，3’端采用BHQ3基团修饰；人内源基因探针序列的5’端采用ROX 基团修饰，3’端采用BHQ2基团修饰。
通过采用上述技术方案，在针对十一个突变位点设计的探针序列的5’端采用不同波长的荧光报告基团进行修饰，针对十一个突变位点设计的探针序列的3’端采用不同波长的荧光猝灭基团进行修饰，可以有效地对八种突变株进行区分，从而能够特异性的指示待测样本中具体存在哪一种突变株的新型冠状病毒，保证了检测结果的准确性、可靠性。
第二方面，本申请提供一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的试剂盒，采用如下的技术方案：
一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的试剂盒，包括权利要求1-3任一项所述的核酸组合物。
通过采用上述技术方案，该试剂盒可通过上述核酸组合物同时检测新型冠状病毒的多种突变株，即Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda突变株中的一种或多种，便于病毒监测和疾病治疗。
可选的，所述试剂盒还包括酶混合物和PCR反应试剂，所述酶混合物包括DNA聚合酶和逆转录酶。
通过采用上述技术方案，其中核酸组合物中的引物用于引发PCR反应，探针用于实现PCR反应的定量分析，酶混合物用于催化逆转录反应以及PCR反应的进行，其中逆转录酶可以将从待测样本中提取获得的RNA反转录成cDNA，cDNA在DNA聚合酶的作用下进行PCR反应，PCR反应试剂用于提供反应原料以及最适的反应环境。从而实现目的基因的扩增。
可选的，所述酶混合物还包括Rnasin，RNasin与逆转录酶的比例为1：1。
通过采用上述技术方案，RNasin能够与逆转录酶按照1:1比例非共价结合，从而有效抑制逆转录酶的活力，进而降低其对作为反应模板的RNA的降解，有效维持PCR反应模板在反应体系中的浓度和含量，保证PCR反应的正常进行，降低假阴性出现的概率，提高了检测结果的准确性和可靠性。
可选的，所述逆转录酶选用c-MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
通过采用上述技术方案，c-MMLV逆转录酶和AMV逆转录酶具有较高的灵敏度，对较低浓度的RNA模板依然能够进行高效扩增，且具有较高的热稳定性，提高了检测结果的准确性。
可选的，所述PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTPs和阳离子。
通过采用上述技术方案，PCR缓冲液可以维持反应体系的酸碱平衡，为酶混合物提供了最适宜的催化环境，确保了PCR反应的正常进行。dNTPs为PCR反应的原料，其在DNA聚合酶的催化下，以及在引物的引发下，可以快速合成目的基因片段。在PCR反应体系中还加入阳离子，阳离子一方面可以提高DNA聚合酶的活性，提高产物的生成量，增强反应体系的灵敏度，另一方面还可以加快聚合反应速度，使聚合反应更容易发生。
第三方面，本申请提供一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的方法，采用如下的技术方案：
一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的方法，包括以下步骤：
S1.采集并提取检测样本的RNA；
S2.将提取的RNA采用权利要求4-9任一所述的试剂盒进行实时荧光PCR反应；
S3.根据荧光信号强度判断检测样本的阴阳性及突变株类型。
通过采用上述技术方案，首先采集并提取检测样本的RNA，然后将提取的RNA采用上述试剂盒进行实时荧光PCR反应，最后根据荧光信号强度判断待测样本的阴阳性。整个检测过程方法非常简单，一次实验便可针对八种不同新型冠状病毒突变株进行检测，检测时间较短，且结果容易判读，充分满足了临床快速检测筛查的需要。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请构建了针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda突变株的四重实时荧光PCR反应体系，一次反应便可同时特异性检测待测样本中是否存在上述八种新型冠状病毒突变株中的一种或多种，减少了样本的检测次数，同时节约了检测成本。
2、本申请中通过引物探针的设计以及反应体系的不断优化，获得了具有高特异性和灵敏度的检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、 Kappa、Lambda突变株的试剂盒，并且本申请试剂盒检测结果的重复性非常好，实验结果稳定可靠，为八种新型冠状病毒突变株的筛查、检测工作提供了很高的参考价值。
3、本申请中实时荧光定量PCR反应体系灵敏度高，重复性好，检测结果稳定可靠。
4、本申请的方法，通过同时检测八种新型冠状病毒突变株，操作简便，检测速度快，结果容易判读。
附图说明
图1是本申请阳性对照品Ⅰ的扩增结果图；
图2是本申请阳性对照品Ⅱ的扩增结果图；
图3是本申请阳性对照品Ⅲ的扩增结果图；
图4是本申请阳性对照品Ⅳ的扩增结果图；
图5是本申请阴性对照品的扩增结果图；
图6是本申请对比例1阴性对照品的扩增结果图；
图7是本申请对比例2阳性对照品Ⅱ的扩增结果图；
图8是本申请新型冠状病毒Alpha突变株的扩增结果图；
图9是本申请新型冠状病毒Beta突变株的扩增结果图；
图10是本申请新型冠状病毒Gamma突变株的扩增结果图；
图11是本申请新型冠状病毒Eta突变株的扩增结果图；
图12是本申请新型冠状病毒Delta、lota突变株的扩增结果图；
图13是本申请新型冠状病毒Kappa突变株的扩增结果图；
图14是本申请新型冠状病毒Lambda突变株的扩增结果图。
具体实施方式
以下结合附图1-14和实施例对本申请作进一步详细说明。予以特殊说明的是：以下实施例中未注明具体条件者按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
以下实施例和对比例中，各引物和探针、阳性对照品均由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
本申请用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda突变株的四重荧光定量PCR仪包括但不限于：ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon 2)、Stratagene MX系列、Roche Lightcycler、Ccpheidsmartcycler、 Corbett Rortor-Gene、杭州博日系列。以下实施例采用ABI 7500荧光定量PCR仪。
实施例
实施例1
一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物
针对八种突变株的核酸序列设计合成引物和探针：
根据NCBI公布的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、 Kappa、Lambda突变株的核酸序列，应用Oligo7.0引物设计软件设计十一组特异性引物和探针。引物和探针序列如表1所示。
表1十一组引物探针序列
各探针序列的5’端均采用荧光报告基团修饰，各探针序列的3’端均采用荧光淬灭基团修饰。其中，荧光报告基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、TEXAS RED和CY5中的一种，荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB中的一种。
本实施例中，SARS-CoV-2 S基因N501Y位点、K417T位点、F490S位点、L452Q 位点探针序列的5’端采用FAM基团修饰，3’端采用BHQ1基团修饰；SARS-CoV-2 S基因E484K位点、L452R位点、G75V、T76I位点、246～253del位点探针序列的5’端采用JOE基团修饰，3’端采用BHQ1基团修饰；SARS-CoV-2 S基因E484Q位点、SARS-CoV-2 N基因探针序列的5’端采用CY5基团修饰，3’端采用BHQ3基团修饰；人内源基因探针序列的5’端采用ROX基团修饰，3’端采用BHQ2基团修饰。
以上十一组引物扩增的目标序列信息参见表2。
表2新型冠状病毒八种突变株目标序列
实施例2
一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的试剂盒
可同时检测NCBI公布的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda突变株中的一种或几种。
试剂盒包括以下试剂：实施例1得到的核酸组合物中的一种或几种位点的引物和探针；酶混合物；PCR反应试剂。
酶混合物包括DNA聚合酶、逆转录酶、Rnasin，DNA聚合酶为热启动Taq酶，逆转录酶包括c-MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶，本实施例中采用c-MMLV逆转录酶。
PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTPs和阳离子，PCR缓冲液即10×PCR Buffer，阳离子源自MgCl2。
配制试剂：取反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ：N×19μL；酶混合物：N×1μL至四个离心管(反应管数N＝待测样本数+阳性质控品数+阴性质控品数)，涡旋振荡器上震荡混匀5 秒后瞬时低速离心，每种反应液按20μL/管分装至对应的反应液PCR管中。
反应液包括PCR反应试剂、实施例1得到的核酸组合物中的一种或几种位点的引物和探针。其中反应液Ⅰ中添加N501Y、E484K、N基因、人内源基因的引物和探针；反应液Ⅱ中添加K417T、L452R、E484Q、人内源基因的引物和探针；反应液Ⅲ中添加F490S、 G75V、T76I、N基因、人内源基因的引物和探针；反应液Ⅳ中添加L452Q、246～253del、人内源基因的引物和探针。
试剂盒中各试剂在最终的反应扩增体系中的终浓度参见表3：
表3反应扩增体系中各组分的终浓度
| 各组分名称 | 终浓度 |
| 10×PCR Buffer | 1×PCR Buffer |
| 各引物 | 4μM/L |
| 各探针 | 2μM/L |
| 热启动Taq酶 | 0.5U |
| c-MMLV逆转录酶 | 0.5U |
| RNasin | 5U/μL |
| dNTPs | 100μM |
| MgCl<sub>2</sub> | 25mM |
具体的，以25μL反应体系为例(包括5μL核酸模板，即待测样本、阳性质控品或阴性质控品)，上述试剂盒中各反应液的具体加入量参见表4-表7：
表4反应液ⅠPCR管中各组分加入量
表5反应液ⅡPCR管中各组分加入量
表6反应液ⅢPCR管中各组分加入量
表7反应液ⅣPCR管中各组分加入量
实施例3
一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的方法，包括以下步骤：
S1.采集并提取检测样本的RNA：
其中样本采集参考《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中关于咽拭子或痰液采集法进行采集。
咽拭子样本：将拭子越过舌根，在被采集者两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭，然后再在咽后壁上下擦拭，将拭子头浸入含病毒保存液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
痰液样本：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含病毒保存液的管中，旋紧管盖。
本实施例中采用咽拭子采集法。
采用核酸提取试剂盒提取咽拭子样本的RNA，本实施例中采用深圳市梓健生物科技有限公司生产的核酸提取试剂盒。
S2.将提取的检测样本的RNA采用实施例2的试剂盒进行实时荧光PCR反应。
1、加样：
每种反应液PCR管取3只，分别定义为阴性PCR管、阳性PCR管和待检PCR管。
①取5μL阴性对照品加入相应阴性PCR管中；
②取5μL阳性对照品加入对应的阳性PCR管中；
③各取5μL检测样本的RNA加入相应四种待检PCR管中；
每管终体积为25μL；
本申请的阳性对照品Ⅰ为同时含有SARS-CoV-2 S基因N501Y位点、SARS-CoV-2 S基因 E484K位点、SARS-CoV-2 N基因和人内源基因组的混合阳性标准品溶液，该混合阳性标准品为各单一标准品以106copies/mL浓度等体积混合而成。阳性对照品Ⅰ是反应液Ⅰ的阳性质控品。
本申请的阳性对照品Ⅱ为同时含有SARS-CoV-2 S基因K417T位点、SARS-CoV-2 S基因L452R位点、SARS-CoV-2 S基因E484Q位点和人内源基因组的混合阳性标准品溶液，该混合阳性标准品为各单一标准品以106copies/mL浓度等体积混合而成。阳性对照品Ⅱ为反应液Ⅱ的阳性质控品。
本申请的阳性对照品Ⅲ为同时含有SARS-CoV-2 S基因F490S位点、SARS-CoV-2 S基因G75V和T76I位点、SARS-CoV-2 N基因和人内源基因组的混合阳性标准品溶液，该混合阳性标准品为各单一标准品以106copies/mL浓度等体积混合而成。阳性对照品Ⅲ为反应液Ⅲ的阳性质控品。
本申请的阳性对照品Ⅳ为同时含有SARS-CoV-2 S基因L452Q位点、SARS-CoV-2 S基因246～253del位点和人内源基因组的混合阳性标准品溶液，该混合阳性标准品为各单一标准品以106copies/mL浓度等体积混合而成。阳性对照品Ⅳ为反应液Ⅳ的阳性质控品。
本申请的阴性对照品为不含有SARS-CoV-2 S基因N501Y位点、SARS-CoV-2 S基因E484K位点、SARS-CoV-2 S基因K417T位点、SARS-CoV-2 S基因L452R位点、SARS- CoV-2 S基因E484Q位点、SARS-CoV-2 S基因F490S位点、SARS-CoV-2 S基因G75V和 T76I位点、SARS-CoV-2 S基因L452Q位点、SARS-CoV-2 S基因246～253del位点、SARS- CoV-2 N基因和人内源基因组的生理盐水溶液。阴性对照品为阴性质控品。
2、PCR扩增并检测：
PCR反应条件如下：
40℃～50℃逆转录10min～30min；93℃～95℃预变性2min～15min；93℃～95℃变性10s～ 30s，55℃～60℃退火、延伸、信号采集30s～60s，循环40次～45次。
本实施例中PCR扩增反应程序为：50℃逆转录15min；95℃预变性15min；95℃变性10s；55℃退火、延伸、信号采集40s；循环40次。
S3.根据荧光信号强度判断检测样本的阴阳性及突变株类型。
检测标准与结果判读：
质量控制：以下表8的要求需在同一实验中同时得到满足，本次实验结果有效，否则本次实验结果无效。
表8检测标准表
参照图1-图5，为正常情况下各阳性对照品和阴性对照品的扩增结果图，在所有阳性对照和阴性对照均正常的情况下，依据表9，进行结果分析：
表9结果分析表
注：“+”表示该通道阳性，“－”表示该通道阴性。
1、阳性：待测样本检测结果Ct≤35且曲线有明显扩增期，结果测定有效，可直接判断样本为阳性；
2、阴性：待测样本检测结果Ct＞38，可直接判断样本为阴性；
3、可疑：待测样本检测结果35＜Ct≤38，需重复一次，若此时Ct值仍≤38，且曲线有明显的扩增期，可判断样本为阳性，否则为阴性。
对比例
对比例1
本对比例与实施例2的区别在于，将针对SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的探针序列SEQ ID NO.3替换为SEQ ID NO.41。
SEQ ID NO.41：CCAACACCATAAGTGGG。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于，将针对SARS-CoV-2 S基因L452R位点的探针序列SEQ ID NO.12替换为SEQ ID NO.42。
SEQ ID NO.42:CAATCTATACCGGTAATTATAA。
性能检测试验
检测方法
采用对比例1制备获得的试剂盒对阴性对照品进行荧光定量PCR反应，扩增实验结果见图 6；采用对比例2制备获得的试剂盒对阳性对照品Ⅱ进行荧光定量PCR反应，扩增实验结果参见图7。
从图6可以看出，对比例1中SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的探针采用SEQ IDNO.41所示序列检测阴性对照品时，会导致FAM通道(N501Y位点)出现非特异扩增，存在明显的N501Y位点的假阳性扩增，导致检测结果的阴性阳性混淆，降低检测准确率。
从图7可以看出，对比例2中SARS-CoV-2 S基因L452R位点的反向引物采用SEQ IDNO.42所示序列时，会导致JOE通道(L452R位点)出现明显扩增延后，同时导致灵敏度降低。
采用实施例2制备的试剂盒，通过实施例3的方法对含有新型冠状病毒各突变株的样本进行检测，得到各扩增结果图如图8-14，结合表9，可以判断得出，图8是本申请新型冠状病毒Alpha突变株的扩增结果图；图9是本申请新型冠状病毒Beta突变株的扩增结果图；图10是本申请新型冠状病毒Gamma突变株的扩增结果图；图11是本申请新型冠状病毒Eta突变株的扩增结果图；图12是本申请新型冠状病毒Delta、lota突变株的扩增结果图；图13是本申请新型冠状病毒Kappa突变株的扩增结果图；图14是本申请新型冠状病毒Lambda突变株的扩增结果图。因此，采用本申请的试剂盒及方法，可以判断检测样本的阴阳性，并且进行不同突变株的特异性判断，同时快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2) Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa、Lambda突变株，便于病毒监测和疾病治疗。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 深圳市梓健生物科技有限公司
<120> 一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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aaatctatca ggccggtagc ac 22
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acgcagcctg taaaatcatc tg 22
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<211> 24
<212> DNA
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ttatcaaacc tcttaataac attg 24
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<400> 28
ggccgcaaat tgcacaat 18
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<211> 21
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agatttggac ctgcgagcg 19
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<400> 32
gagcggctgt ctccacaagt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
Claims (8)
1.一种同时检测新型冠状病毒突变株Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa和Lambda中的一种或几种的核酸组合物，其特征在于，
所述核酸组合物包括以下引物和探针：
针对SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，针对SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，针对SARS-CoV-2 S基因N501Y位点的探针序列如SEQ IDNO.3所示；
针对SARS-CoV-2 S基因E484K位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因E484K位点的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，针对SARS-CoV-2 S基因E484K位点的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示，针对SARS-CoV-2 S基因E484K位点的探针序列如SEQ IDNO.6所示；
针对SARS-CoV-2 S基因K417T位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因K417T位点的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，针对SARS-CoV-2 S基因K417T位点的反向引物序列如SEQ ID NO.8所示，针对SARS-CoV-2 S基因K417T位点的探针序列如SEQ IDNO.9所示；
针对SARS-CoV-2 S基因L452R位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因L452R位点的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，针对SARS-CoV-2 S基因L452R位点的反向引物序列如SEQ ID NO.11所示，针对SARS-CoV-2 S基因L452R位点的探针序列如SEQ IDNO.12所示；
针对SARS-CoV-2 S基因E484Q位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因E484Q位点的正向引物序列如SEQ ID NO.13所示，针对SARS-CoV-2 S基因E484Q位点的反向引物序列如SEQ ID NO.14所示，针对SARS-CoV-2 S基因E484Q位点的探针序列如SEQ IDNO.15所示；
针对SARS-CoV-2 S基因F490S位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因F490S位点的正向引物序列如SEQ ID NO.16所示，针对SARS-CoV-2 S基因F490S位点的反向引物序列如SEQ ID NO.17所示，针对SARS-CoV-2 S基因F490S位点的探针序列如SEQ IDNO.18所示；
针对SARS-CoV-2 S基因L452Q位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因L452Q的正向引物序列如SEQ ID NO.19所示，针对SARS-CoV-2 S基因L452Q的反向引物序列如SEQ ID NO.20所示，针对SARS-CoV-2 S基因L452Q的探针序列如SEQ ID NO.21所示；
针对SARS-CoV-2 S基因246~253del位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因246~253del位点的正向引物序列如SEQ ID NO.22所示，针对SARS-CoV-2 S基因246~253del位点的反向引物序列如SEQ ID NO.23所示，针对SARS-CoV-2 S基因246~253del位点的探针序列如SEQ ID NO.24所示；
针对SARS-CoV-2 S基因G75V、T76I位点的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 S基因G75V、T76I位点的正向引物序列如SEQ ID NO.25所示，针对SARS-CoV-2 S基因G75V、T76I位点的反向引物序列如SEQ ID NO.26所示，针对SARS-CoV-2 S基因G75V、T76I位点的探针序列如SEQ ID NO.27所示；
针对SARS-CoV-2 N基因的正、反向引物和探针，针对SARS-CoV-2 N基因的正向引物序列如SEQ ID NO.28所示，针对SARS-CoV-2 N基因的反向引物序列如SEQ ID NO.29所示，针对SARS-CoV-2 N基因的探针序列如SEQ ID NO.30所示；
针对人内源基因的正、反向引物和探针，针对人内源基因的正向引物序列如SEQ IDNO.31所示，针对人内源基因的反向引物序列如SEQ ID NO.32所示，针对人内源基因的探针序列如SEQ ID NO.33所示。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测新型冠状病毒突变株Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa和Lambda中的一种或几种的核酸组合物，其特征在于，各探针序列的5’端均采用荧光报告基团修饰，各探针序列的3’端均采用荧光淬灭基团修饰。
3.根据权利要求2所述的一种同时检测新型冠状病毒突变株Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa和Lambda中的一种或几种的核酸组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、TEXAS RED和CY5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB；
SARS-CoV-2 S基因N501Y位点、K417T位点、F490S位点、L452Q位点探针序列的5’端采用FAM基团修饰，3’端采用BHQ1基团修饰；SARS-CoV-2 S基因E484K位点、L452R位点、G75V、T76I位点、246~253del位点探针序列的5’端采用JOE基团修饰，3’端采用BHQ1基团修饰；SARS-CoV-2 S基因E484Q位点、SARS-CoV-2 N基因探针序列的5’端采用CY5基团修饰，3’端采用BHQ3基团修饰；人内源基因探针序列的5’端采用ROX基团修饰，3’端采用BHQ2基团修饰。
4.一种同时检测新型冠状病毒突变株Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa和Lambda中的一种或几种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的核酸组合物。
5.根据权利要求4所述的一种同时检测新型冠状病毒突变株Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa和Lambda中的一种或几种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合物和PCR反应试剂，所述酶混合物包括DNA聚合酶和逆转录酶。
6.根据权利要求5所述的一种同时检测新型冠状病毒突变株Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa和Lambda中的一种或几种的试剂盒，其特征在于，所述酶混合物还包括Rnasin，RNasin与逆转录酶的比例为1：1。
7.根据权利要求5所述的一种同时检测新型冠状病毒突变株Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa和Lambda中的一种或几种的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶选用c-MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
8.根据权利要求5所述的一种同时检测新型冠状病毒突变株Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta、lota、Kappa和Lambda中的一种或几种的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTPs和阳离子。
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