CN113308574B - 一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法 - Google Patents

一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法，本发明通过针对新型冠状病毒2019‑nCoV‑B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株上的S基因上的五个突变位点设计对应的引物探针组合以及阻遏序列的设计；从而能够特异性的扩增含上述突变位点的目标序列，而对不含上述突变位点的序列，其扩增效率较低或无扩增，根据扩增结果Ct值的差值，从而特异性地检测被测样本中的B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株序列。因此，以本方案中的正向引物、反向引物、探针和阻遏序列扩增样本时，能够特异性地扩增出样本中的目标基因，从而准确指示B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株的有无，减少核酸检测时假阴性和假阳性的情况发生，进而减少漏检和误判情况。

Description

一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒 及分型检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤指一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法。
背景技术
新型冠状病毒2019-nCOV属于Beta冠状病毒属(Beta coronavirμs)，Beta冠状病毒属是蛋白包裹的单链正链RNA病毒，寄生和感染高等动物(包括人)，其来源于一种HKμ9-1类似的病毒，在进化分支上，与SARS(导致2002年“非典”)病毒和类SARS(SARS-like)病毒的类群相邻，但并不属于SARS和类SARS病毒类群。该病毒基因组长约30kb,两端为非编码区,中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区，非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(open reading frame,ORF)1a和ORF1b基因,编码16个非结构蛋白(non-strμctμralproteins,NSP),即NSP1～16。结构蛋白编码区主要编码刺突(spike,S)蛋白、包膜(envelope,E)蛋白、膜(membrane,M)蛋白和核衣壳(nμcleocapsid,N)蛋白。其中，N基因、ORF1a基因、ORF1b基因、E基因等因其保守型较高，常作为新型冠状病毒核酸检测的靶点；而S基因变异为病毒进化的主要变异来源，常作为特定突变株核酸检测的靶点。
新型冠状病毒肺炎疑似病例的应从流行病学史和临床表现2方面进行确定，其中，临床表现如下：发热和(或)呼吸道症状等新冠肺炎相关临床表现；具有上述新冠肺炎影像学特征；发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数正常或减少。有流行病学史且符合临床表现任意2条；或无流行病学史且新型冠状病毒特异性IgM抗体阳性且符合临床表现任意2条；或无流行病学史且符合临床表现全部3条者，可诊断为疑似病例。新型冠状病毒肺炎疑似病例如满足如下病原学或血清学证据之一，即：实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性；新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期IgG抗体滴度较急性期呈4倍及以上升高，即可诊断为新型冠状病毒肺炎确诊病例。核酸检测是新型冠状病毒肺炎确诊标准之一，也是目前性新冠状病毒检测最常用、最有效的检测方法。
自疫情爆发以来，新型冠状病毒便持续变异，世界卫生组织(WHO)曾通报了自新冠病毒疫情暴发以来主要4种病毒变异情况，分别为D614G突变株、“Clμster 5”突变株、B.1.1.7突变株和B.1.351突变株。
B.1.1.7共有23个突变位点，其中，最重要的突变位点是位于S基因上的N501Y突变位点、69-70del突变位点和P681H突变位点。N501是S蛋白受体结合结构域(Receptor-Binding Domain，RBD)上的6个关键氨基酸之一，有研究表明，该位点突变可使得RBD与受体ACE2的亲和力增加，且已在小鼠模型中证明；69-70del突变位点有助于提高病毒的免疫逃逸能力，表现为降低部分血清的中和敏感性；P681H突变位点则有助于S蛋白的切割，从而提高其与受体ACE2的亲和力。
B.1.351共有21个突变位点，其中，最重要的突变位点是位于S基因上的N501Y突变位点、E484K突变位点和K417N突变位点。E484也是RBD上的6个关键氨基酸之一，有研究表明，该位点突变可使得RBD与受体ACE2的亲和力增加，并且可以增强病毒抵抗抗体的能力，目前已发现E484K对C121、C144、2B04、2H04、1B07、REGN-10989/34等单克隆抗体都具有明显的抵抗作用；K417也是中和抗体的重要靶点，有研究表明，该突变可降低病毒与的亲和力，从而有助于免疫逃避。
P.1共有17个突变位点，其中，最重要的突变位点是位于S基因上的N501Y突变位点、E484K突变位点和K417T突变位点。
为了满足对新型冠状病毒2019-nCoV的B.1.1.7、B.1.351和P.1检测和分型需求，亟需发明一种能够区分野生型和上述突变株的，并且准确和特异地检测出上述突变株，并对其进行分型的核酸检测试剂盒。
发明内容
本发明提供一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法，将针对新型冠状病毒2019-nCOV--B.1.1.7、B.1.351和P.1突变株分型检测的技术问题，以区分野生型和上述突变株，且能够准确的检测出上述突变株。
本发明提供的技术方案如下：
一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合，分别针对突变株上的S基因上的5个突变位点设计的引物探针，引物探针如下：
S基因上的N501Y突变位点的引物探针组:SEQ ID NO.1-3；
S基因上的69-70del突变位点引物探针组：SEQ ID NO.4-6；
S基因上的E484K突变位点引物探针组：SEQ ID NO.7-9；
S基因上的K417T突变位点引物探针组：SEQ ID NO.10-12；
S基因上的K417N突变位点引物探针组：SEQ ID NO.13-15。
优选地，所述突变株为B.1.1.7型、B.1.351型和P.1型。
优选地，所述引物探针组合还包括参比基因，所述参比基因为N基因，所述N基因的引物如SEQ ID NO.16-18所示。
优选地，针对突变株上的S基因的N501、69-70HV、E484、K417T和K417N的非突变位点设计阻遏序列，所述阻遏序列3’端进行双脱氧处理，所述阻遏序列如：
针对N501的非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.19所示；
针对69-70的非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.20所示；
针对E484的非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.21所示；
针对K417T的非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.22所示；
针对K417N的非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.23所示。
上述任一所述的一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合在试剂或试剂盒中的应用。
一种用于新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒，包括如权利要求1-4任一所述的用于检测新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、ARMS-荧光PCR酶系、ARMS-荧光PCR反应体系、阳性质控品和阴性质控。
优选地，所述试剂盒各引物探针组的浓度分别为：
0.1-0.5μM的N501Y-F、0.1-0.5μM的N501Y-R、0.05-0.25μM的N501Y-P和0.02-0.1μM的N501-B；
0.1-0.5μM的69-70del-F、0.1-0.5μM的69-70del-R、0.05-0.25μM的69-70del-P和0.02-0.1μM的69-70HV-B；
0.1-0.5μM的E484K-F、0.1-0.5μM的E484K-R、0.05-0.25μM的E484K-P和0.02-0.1μM的E484-B；
0.1-0.5μM的K417T-F、0.1-0.5μM的K417T-R、0.05-0.25μM的K417T-P和0.02-0.1μM的K417T-B；
0.1-0.5μM的K417N-F、0.1-0.5μM的K417N-R、0.05-0.25μM的K417N-P和0.02-0.1μM的K417N-B；
0.1-0.5μM的N-F、0.1-0.5μM的N-R、0.05-0.25μM的N-P。
优选地，所述ARMS-荧光PCR酶系包括热启动Taq酶、μDG酶和逆转录酶M-MMLV。
优选地，所述ARMS-荧光PCR反应体系包括Tris-HCl、KCl、Mg2+、(NH4)2SO4、dNTP、RNA酶抑制剂和添加剂组合。
优选地，所述添加剂组合包括1-10％的聚乙二醇，和/或0.001-0.1μ/反应的焦磷酸酶，和/或0-5ng/μL的T4噬菌体基因32编码蛋白，和/或1-10％的DMSO，和/或0-2M的甜菜碱。该添加剂组合能够极大地提高检测靶点的扩增效率，从而有助于准确和特异性地对新型冠状病毒2019-nCOV-B.1.1.7、B.1.351和P.1突变株进行检测和分型。
一种非诊断目的的用于新型冠状病毒突变株的分型检测方法，包括如下步骤：
S10、获取样本并提取病毒核酸；
S20、选择N基因及其他新型冠状病毒2019-nCOV的基因作为参比基因，并使用权利要求6-10任一所述的试剂盒对步骤S10中的核酸进行ARMS-荧光PCR扩增；
S30、利用步骤S20中的突变位点检测结果与N基因检测结果Ct值的差值对S基因上的突变位点N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N突变位点进行判定。
优选地，N501Y检测结果的判定：N501YCt值≤40且N501Y与N基因Ct值差值≤6则判定结果为N501Y突变阳性；N501Y无Ct值或N501YCt值＞40或(N501YCt值≤40且N501YCt值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为N501Y突变阴性；
69-70del检测结果的判定：69-70del Ct值≤40且69-70del与N基因Ct值差值≤6则判定结果为69-70del突变阳性；69-70del无Ct值或69-70del Ct值＞40或(69-70del Ct值≤40且69-70del Ct值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为69-70del突变阴性；
E484K检测结果的判定：E484K Ct值≤40且E484K与N基因Ct值差值≤6则判定结果为E484K突变阳性；E484K无Ct值或E484K Ct值＞40或(E484K Ct值≤40且E484K Ct值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为E484K突变阴性；
K417T检测结果的判定：K417T Ct值≤40且K417T与N基因Ct值差值≤6则判定结果为K417T突变阳性；K417T无Ct值或K417TCt值＞40或(K417T Ct值≤40且K417T Ct值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为K417T突变阴性；
K417N检测结果的判定：K417N Ct值≤40且K417N与N基因Ct值差值≤6则判定结果为K417N突变阳性；K417N无Ct值或K417N Ct值＞40或(K417N Ct值≤40且K417N Ct值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为K417N突变阴性。
优选地，S基因上的N501Y和69-70del突变位点检测结果为阳性，则B.1.1.7突变株的检测结果为阳性；
S基因上的N501Y、E484K和K417N突变位点检测结果为阳性，则B.1351突变株的检测结果为阳性；
S基因上的N501Y、E484K和K417T突变位点检测结果为阳性，则P.1突变株的检测结果为阳性；
S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N突变位点检测结果为阴性，则B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株检测结果为阴性。
与现有技术相比，本发明提供的一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法具有以下有益效果：
本发明通过针对新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株上的S基因上的五个突变位点设计对应的引物探针组合以及阻遏序列的设计；从而能够特异性的扩增含上述突变位点的目标序列，而对不含上述突变位点的序列，其扩增效率较低或无扩增，根据上述突变位点的扩增结果的Ct值与参比基因(N基因)扩增结果Ct值的差值，从而特异性地检测被测样本中的B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株序列。因此，以本方案中的正向引物、反向引物、探针和阻遏序列扩增样本时，能够特异性地扩增出样本中的目标基因，从而准确指示B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株的有无，减少核酸检测时假阴性和假阳性的情况发生，进而减少相关检测中的漏检和误判情况。
2、本发明中阻遏序列，并针对阻遏序列的3’端进行双脱氧处理，可提高突变位点扩增的特异性，可降低野生型扩增的概率，防止出现假阳性，通过结果判定方法的设计(计算突变位点检测结果Ct值与参比基因N基因的Ct值的差值)，显著提高了突变株鉴定的准确性。
3、本发明通过添加添加剂组合，添加剂组合及其适当浓度配比可显著提高ARMS-荧光PCR反应的分析灵敏度和特异性，该添加剂组合能够极大地提高检测靶点的扩增效率，从而有助于准确和特异性地对新型冠状病毒2019-nCOV-B.1.1.7、B.1.351和P.1突变株进行检测和分型。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1-1：准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV野生型病毒检测结果；
图1-2：准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.1.7突变株假病毒检测结果；
图1-3：准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.351突变株假病毒检测结果；
图1-4：准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV-P.1突变株假病毒检测结果；
图2-1：阻遏序列对准确度和特异性的影响——不含阻遏序列的引物探针组合检测新型冠状病毒2019-nCoV野生型病毒的结果；
图2-2：阻遏序列对准确度和特异性的影响——含阻遏序列的引物探针组合检测新型冠状病毒2019-nCoV野生型病毒的结果；
图3-1：ORF1ab作为参比基因的准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV野生型病毒检测结果；
图3-2：ORF1ab作为参比基因的准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.1.7突变株假病毒检测结果；
图3-3：ORF1ab作为参比基因的准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.351突变株假病毒检测结果；
图3-4：ORF1ab作为参比基因的准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV-P.1突变株假病毒检测结果；
图4-1：E基因作为参比基因的准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV野生型病毒检测结果；
图4-2：E基因作为参比基因的准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.1.7突变株假病毒检测结果；
图4-3：E基因作为参比基因的准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.351突变株假病毒检测结果；
图4-4：E基因作为参比基因的准确度验证结果——新型冠状病毒2019-nCoV-P.1突变株假病毒检测结果；
具体实施方式
本发明提供一种种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合，分别针对突变株上的S基因上的5个突变位点设计的引物探针，引物探针如下：
S基因上的N501Y突变位点的引物探针组:SEQ ID NO.1-3；
S基因上的69-70del突变位点引物探针组：SEQ ID NO.4-6；
S基因上的E484K突变位点引物探针组：SEQ ID NO.7-9；
S基因上的K417T突变位点引物探针组：SEQ ID NO.10-12；
S基因上的K417N突变位点引物探针组：SEQ ID NO.13-15。
本发明针对新型冠状病毒2019-nCoV的S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N，5个突变位点分别设计了引物探针，各探针的5’端包含有荧光报告基团，和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。本发明各基因的探针标记不限于列出的同一波长的单个标记，包括不同标记的不同组合形式的多重检测试剂，如荧光报告基团FAM、VIC和Cy5等；荧光淬灭基团BHQ1和BHQ3等。其具体的序列如下表1：
Figure GDA0003148014520000091
Figure GDA0003148014520000101
Figure GDA0003148014520000111
表1
其中，参比基因N基因的引物探针是采用美国CDC的N基因引物探针，其序列如上述表1所示。
阻遏序列是本发明设计的一条与非突变位点完全匹配，与突变位点不完全匹配的寡核苷酸序列，该序列3’端采用双脱氧修饰，不可延伸。该序列可竞争性地与非突变位点结合，从而在一定程度上抑制引物探针与非突变位点结合，提高扩增的特异性。本发明针对新型冠状病毒2019-nCoV的S基因上的N501Y、69-70del、E484K和K417T，5个突变位点分别设计了5条阻遏序列如上表1所示。
本发明通过设计上述引物探针，针对新型冠状病毒2019-nCOV-B.1.1.7、B.1.351和P.1突变株进行分型检测，能够同时检测新型冠状病毒2019-nCoV的S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N5个突变位点，并以N基因作为参比基因，可通过不同位点检测结果的组合，检测B.1.1.7、B.1.351和P.1，3种突变株，其中：
S基因上的N501Y突变位点，可用于特异性检测B.1.1.7、B.1.351和P.1突变株,利用N501Y突变检测结果阳性判定检测结果为B.1.1.7、B.1.351或P.1突变株。
S基因上的69-70del突变位点，可用于特异性检测B.1.1.7突变株，利用N501Y和69-70del突变检测结果阳性判定检测结果为B.1.1.7突变株。
S基因上的E484K突变位点，可用于特异性检测B.1.351和P.1突变株，利用N501Y和E484K突变检测结果阳性判定检测结果为B.1.1.7或B.1.351突变株。
S基因上的K417T突变位点，可用于特异性检测P.1突变株，利用N501Y、E484K和K417T突变检测结果阳性判定检测结果为P.1突变株并对其分型。
S基因上的K417N突变位点，可用于特异性检测B.1.351突变株，利用N501Y、E484K和K417N突变检测结果阳性判定检测结果为B.1.351突变株。
通过设计阻遏序列，可降低野生型扩增的概率，防止出现假阳性，通过结果判定方法的设计(计算突变位点检测结果Ct值与参比基因N基因的Ct值的差值)，显著提高了突变株鉴定的准确性。本发明中新型冠状病毒2019-nCoV各突变株的基因序列源自GISAID。
本发明还提供一种用于新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、ARMS-荧光PCR酶系、ARMS-荧光PCR反应体系、阳性质控品和阴性质控品。
具体实施时，试剂盒中的第一容器包含N基因/N501Y突变位点/K417T突变位点的引物探针及其阻遏序列组合，其终浓度均为0.02-0.5μM；试剂盒的第二容器包含N417N突变位点/69-70del突变位点/E484K突变位点的引物探针及其阻遏序列组合，其终浓度均为0.02-0.5μM；试剂盒的第三容器包含0.1-1μ/反应的热启动Taq酶、10-50μ/反应的反转录酶、1-10μ/反应的μDG酶、与热启动Taq酶比例为1:0.5-1:5的抗热启动Taq酶抗体。第四容器内包含ARMS-荧光PCR反应体系，ARMS-荧光PCR反应体系包括10-100mMTris-HCl、10-100mMKCl、0.5-10mMMg2+、10-100mM(NH4)2SO4、0.1-1mMdNTP、10-50μ/反应的RNA酶抑制剂和添加剂组合，添加剂组合及其适当浓度配比，包括，1-10％的聚乙二醇，和/或0.001-0.1μ/反应的焦磷酸酶，和/或0-5ng/μL的T4噬菌体基因32编码蛋白，和/或1-10％的DMSO，和/或0-2M的甜菜碱。
本试剂盒中的添加剂可增强PCR特别是多重PCR的扩增效率，不同添加剂通过诸如稳定单链结构，如单链结合蛋白(SSB)、T4噬菌体基因32编码蛋白等；消除模板和引物二级结构，如DMSO等；稳定或提高TaqDNA聚合酶的结构和活性，如牛血清白蛋白(BSA)、甜菜碱和聚乙二醇等；消除PCR抑制物，如焦磷酸酶等增强PCR反应的灵敏度和特异性。本发明针对ARMS-荧光PCR和多重荧光PCR，经过大量筛选和试错，并对其进行组合、优化、验证，最终设计了一组添加剂组合，即1-10％的聚乙二醇，和/或0.001-0.1μ/反应的焦磷酸酶，和/或0-5ng/μL的T4噬菌体基因32编码蛋白，和/或1-10％的DMSO，和/或0-2M的甜菜碱，能够有效提高ARMS-荧光PCR和多重荧光PCR的扩增效率。
第五-七容器内包含阳性质控品，阳性质控品分别为新型冠状病毒2019-nCOV-B.1.1.7、B.1.351和P.1突变株的假病毒颗粒；和/或试剂盒还包括第八容器，第八容器内包含阴性质控品，阴性质控品为灭菌生理盐水。
本发明还提供一种非诊断目的的用于新型冠状病毒突变株的分型检测方法，包括如下步骤：
S10、获取样本并提取病毒核酸；
S20、选择N基因及其他新型冠状病毒2019-nCOV的基因作为参比基因，并使用上述所述的试剂盒对步骤S10中的核酸进行ARMS-荧光PCR扩增；
S30、利用步骤S20中的突变位点检测结果与N基因检测结果Ct值的差值对S基因上的突变位点N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N突变位点进行判定对步骤S20中的结果进行判读提取待测样本(提取试剂采用上海伯杰医疗科技有限公司生产的核酸提取及纯化试剂(沪奉械备20180202号))，得到核酸样本；取5μL加入到上述引物探针及阻遏序列混合液(4μL)、PCR反应液(12μL)和酶系混合物(4μL)中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，
其中，步骤S20中的PCR扩增程序如下：
50℃，10min，95℃，5min；1个循环
95℃，10sec，55℃，40sec(采集荧光)；45个循环。
扩增检测结束后通过不同荧光通道(突变位点及参比基因)曲线及Ct值及其Ct值差值可判断对应突变位点的阴阳性，具体判读规则如下：
当N501YCt值≤40且N501Y与N基因Ct值差值≤6则判定结果为N501Y突变阳性；N501Y无Ct值或N501YCt值＞40或(N501YCt值≤40且N501YCt值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为N501Y突变阴性。
当69-70del Ct值≤40且69-70del与N基因Ct值差值≤6则判定结果为69-70del突变阳性；69-70del无Ct值或69-70del Ct值＞40或(69-70del Ct值≤40且69-70del Ct值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为69-70del突变阴性。
当E484K Ct值≤40且E484K与N基因Ct值差值≤6则判定结果为E484K突变阳性；E484K无Ct值或E484K Ct值＞40或(E484K Ct值≤40且E484K Ct值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为E484K突变阴性。
当K417T Ct值≤40且K417T与N基因Ct值差值≤6则判定结果为K417T突变阳性；K417T无Ct值或K417T Ct值＞40或(K417T Ct值≤40且K417T Ct值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为K417T突变阴性。
当K417N Ct值≤40且K417N与N基因Ct值差值≤6则判定结果为K417N突变阳性；K417N无Ct值或K417N Ct值＞40或(K417N Ct值≤40且K417N Ct值与N基因Ct值差值＞6)则判定结果为K417N突变阴性。
根据上述突变位点的阴阳性，可对新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株进行检测和分型，其中：
S基因上的N501Y和69-70del突变位点检测结果为阳性，则B.1.1.7突变株的检测结果为阳性。
S基因上的N501Y、E484K和K417N突变位点检测结果为阳性，则B.1351突变株的检测结果为阳性。
S基因上的N501Y、E484K和K417T突变位点检测结果为阳性，则P.1突变株的检测结果为阳性。
S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N突变位点检测结果为阴性，则B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株检测结果为阴性。
检测结果可用于新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株检测和分型，在具体使用时可为病毒鉴定和防控提供可靠的依据。
在具体实施时，可以使用与本发明的实施或测试中所涉及到的相似或等价的任何方法和材料都在本申请的保护范围内。
通过采用上述技术方案，本方案中将新型冠状病毒2019-nCoV野生型病毒的全基因组序列与B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株的全基因组序列进行比对分析，结合文献报道，最终选定并确定S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N，5个突变位点，并针对上述突变位点设计正向引物、反向引物、探针和阻遏序列，从而能够特异性地扩增含上述突变位点的目标序列，而对不含上述突变位点的序列，其扩增效率较低或无扩增，根据上述突变位点的扩增结果的Ct值与参比基因(N基因)扩增结果Ct值的差值，从而特异性地检测被测样本中的B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株序列。因此，以本方案中的正向引物、反向引物、探针和阻遏序列扩增样本时，能够特异性地扩增出样本中的目标基因，从而准确指示B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株的有无，减少核酸检测时假阴性和假阳性的情况发生，进而减少相关检测中的漏检和误判情况。通过探针上荧光报告基团和荧光淬灭基团的引入，无PCR扩增时，荧光淬灭基团能够淬灭荧光报告基团，无荧光信号；在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性能够对探针进行酶切，使得荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，荧光报告基团得以报告荧光信号，从而指示出样本中存在目标基因的扩增。随着PCR产物的增加，荧光信号也等比例增加，从而可以通过荧光信号的出现与否判读样本中是否出现了目标基因的扩增，以快速指示样本中有无B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒检测限测试
将以已定值的含N基因和S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N，5个突变位点的假病毒做为初始样本分别稀释至浓度为1000copies/ml、500copies/ml、250copies/ml，验证试剂盒的检测限，每个梯度重复测试4次。PCR反应体系包含本发明SEQID NO.1-SEQ ID NO.23所示的引物探针和阻遏序列组合，即本试剂盒的第一容器和第二容器以及酶和其他重要组分，即本试剂盒的第三、第四容器。
结果表明，对不同浓度的假病毒进行检测，N基因和S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N，5个突变位点的可检测出的最低浓度均可达到500copies/ml，检出率均为100％(如表2所示)。
Figure GDA0003148014520000171
表2
实施例2新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒精密度验证
将以已定值的含N基因和S基因上的N N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N，5个突变位点的假病毒做为初始样本稀释至浓度为5000copies/ml，验证试剂盒的精密度，重复测试10次。PCR反应体系包含本发明SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.23所示的引物探针和阻遏序列组合，即本试剂盒的第一容器和第二容器以及酶和其他重要组分，即本试剂盒的第三、第四容器。
结果表明，对浓度为5000copies/ml的假病毒进行检测，N基因和S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N，5个突变位点的Ct值的CV均小于5％(表3)。
Figure GDA0003148014520000181
表3
实施例3新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒准确度验证
将以已定值的新型冠状病毒2019-nCoV野生型样本、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株的假病毒做为初始样本稀释至浓度为500copies/ml，验证试剂盒的准确性。PCR反应体系包含本发明SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.23所示的引物探针和阻遏序列组合，即本试剂盒的第一容器和第二容器内包含的东西，以及酶和其他重要组分，即本试剂盒的第三、第四容器内包含的东西。
结果表明，对浓度为500copies/ml的样本或假病毒进行检测，根据判定标准，新型冠状病毒2019-nCoV野生型样本、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株假病毒的阳性符合率均为100％，如图1所示，其中图1中的A、B分别代表第一容器和第二容器进行检测结果。
进一步，为了确定阻遏序列对新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒准确度的影响，以分别以含阻遏序列(SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.23)的引物探针组合(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.18)和不含阻遏序列的引物探针组合对已定值的新型冠状病毒2019-nCoV野生型样本的进行检测。
结果表明，按照判定标准，含有阻遏序列的引物探针组合对新型冠状病毒2019-nCoV野生型样本的检测结果判定为B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株阴性，其各突变位点检测结果均无Ct值；不含阻遏序列的引物探针组合对新型冠状病毒2019-nCoV野生型样本的检测结果判定为为B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株阴性，其各突变位点检测结果的Ct值与参比基因的Ct值差值在6-8之间，如图2所示，其中图2中的A、B分别代表第一容器和第二容器进行检测结果，说明阻遏序列能够在一定程度上提高新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒对突变位点检测结果的区分度，从而提高判定结果准确度和特异性。
实施例4新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒特异性(交叉反应)验证
以与2019新型冠状病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体(如季节性甲型H1N1流感病毒，新型甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型流感H3N2，H5N1，H7N9，乙型流感Yamagata，乙型流感Victoria，呼吸道合胞病毒A型，呼吸道合胞病毒B型，副流感病毒，腺病毒，肠道病毒，人间质肺病毒(人偏肺病毒)，EB病毒，麻疹病毒，人巨细胞病毒，轮状病毒，诺如病毒，腮腺炎病毒，水痘—带状疱疹病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体，军团菌，百日咳杆菌，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，肺炎克雷伯杆菌，结核分枝杆菌，烟曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隐球菌，冠状病毒(HKμ1，OC43，NL63，229E)以及人基因组DNA为特异性参考品，测试新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒的特异性。PCR反应体系包含本发明SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.23所示的引物探针和阻遏序列组合，即本试剂盒的第一容器和第二容器内包含的东西，以及酶和其他重要组分，即本试剂盒的第三、第四容器内包含的东西。结果表明，对上述临床样本进行检测，阴性符合均为100％。
实施例5新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒特异性(抗干扰能力)验证
分别向500copies/ml的含N基因和S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N，5个突变位点的假病毒中加入呼吸道病原体治疗药物，如苯福林、羟甲唑啉、氯化钠、倍氯美松、地塞米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、盐酸组胺、干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、洛匹那韦、莫匹罗星、左氟沙星、阿奇霉素、妥布霉素、利托那韦、美罗培南、头孢曲松、利托那韦、妥布霉素、美罗培南和阿比多尔作为干扰物质测试样本，以不含干扰物质的假病毒作为对照，测试干扰物质对引物探针扩增的影响。PCR反应体系包含本发明SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.23所示的引物探针和阻遏序列组合，即本试剂盒的第一容器和第二容器内包含的东西，以及酶和其他重要组分，即本试剂盒的第三、第四容器内包含的东西。结果表明，上述干扰物质对检测结果无明显干扰，阳性检出率均为100％。
实施例6本发明添加剂对新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒性能的影响
为了确定添加剂对本试剂盒性能的影响，本实施例将以已定值的含N基因和S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N，5个突变位点的假病毒做为初始样本分别稀释至浓度为1000copies/ml、500copies/ml、250copies/ml，验证不含添加剂的试剂盒的检测限，每个梯度重复测试4次。PCR反应体系包含本发明SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.23所示的引物探针和阻遏序列组合，即本试剂盒的第一容器和第二容器内包含的东西，以及酶和其他重要组分，即本试剂盒的第三、第四容器内包含的东西。其中，第三容器中不含本试剂盒组分中的任何添加剂，即1-10％的聚乙二醇，和/或0.001-0.1μ/反应的焦磷酸酶，和/或0-5ng/μL的T4噬菌体基因32编码蛋白，和/或1-10％的DMSO，和/或0-2M的甜菜碱。。
结果表明，对不同浓度的假病毒进行检测，N基因和S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N，5个突变位点，添加剂在一定程度上提高了检出率，特别是低浓度(250copies/ml)的检出率(表5)。
进一步，对0.001-0.1μ/反应的焦磷酸酶，和/或0-5ng/μL的T4噬菌体基因32编码蛋白的研究表明，单独添加0.001-0.1μ/反应的焦磷酸酶或0-5ng/μL的T4噬菌体基因32编码蛋白，其对低浓度检出率无明显提高；同时添加0.001-0.1μ/反应的焦磷酸酶，和/或0-5ng/μL的T4噬菌体基因32编码蛋白，其对检出率有一定的提高(表5)。
Figure GDA0003148014520000211
Figure GDA0003148014520000221
表5
实施例7不同参比基因对新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒性能的影响
为了确定不同参比基因对本试剂盒性能的影响，本实施例将参比基因N基因替换为ORF1ab基因和E基因，并对试剂盒的检测限和准确度进行评估(检测限和准确度的评估方法详见实施例1和实施例3)。PCR反应体系包含本发明SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.23所示的引物探针和阻遏序列组合，即本试剂盒的第一容器和第二容器内包含的东西，以及酶和其他重要组分，即本试剂盒的第三、第四容器内包含的东西。
结果表明，对不同参比基因，试剂盒的检测限(表6)和准确度如图3-图4所示，其中图3-图4中的A、B分别代表第一容器和第二容器进行检测的结果，等关键指标均无明显差异，说明将参比基因替换为ORF1ab基因和E基因，试剂盒性能不受影响。
Figure GDA0003148014520000231
表6
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海伯杰医疗科技有限公司
<120> 一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatggtttcc aacccactt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtgcatgt agaagttca 19
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagtactact actctgtatg gttggt 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tacttggttc catgctatc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcattaaatg gtaggacagg 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaatggtac taagaggttt gataa 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccttttgaga gagatatttc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaagtaacaa ttaaaaccgt t 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tatcaggccg gtagcacacc ttgt 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gattcatttg taattagagg t 21
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atttataatt ataatcagca agcg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtcagacaaa tcgctccagg gcaa 24
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gattcatttg taattagagg t 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aatttataat tataatcagc agta 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtcagacaaa tcgctccagg gcaa 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaccccaaaa tcagcgaaat 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctggttact gccagttgaa tctg 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
accccgcatt acgtttggtg gacc 24
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tttccaaccc acta 14
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tggttccatg ctata 15
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aacaattaaa accttc 16
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
attataatca gcaatct 17
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
attataatca gcaatc 16

Claims (13)

1.一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针和阻遏序列的组合物，其特征在于：所述引物探针分别针对突变株上的S基因上的5个突变位点设计，所述阻遏序列分别针对突变株上的S基因的N501、69-70HV、E484、K417T和K417N的非突变位点设计，所述引物探针如下：
S基因上的N501Y突变位点的引物探针组:SEQ ID NO.1-3；
S基因上的69-70del突变位点引物探针组：SEQ ID NO.4-6；
S基因上的E484K突变位点引物探针组：SEQ ID NO.7-9；
S基因上的K417T突变位点引物探针组：SEQ ID NO.10-12；
S基因上的K417N突变位点引物探针组：SEQ ID NO.13-15；
所述阻遏序列3’端进行双脱氧处理，所述阻遏序列如：
针对 N501非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.19所示；
针对69-70非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.20所示；
针对E484非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.21所示；
针对K417T非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.22所示；
针对K417N非突变位点设计的阻遏序列如SEQ ID NO.23所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针和阻遏序列的组合物，其特征在于：所述突变株为B.1.1.7型、B.1.351型和P.1型。
3.根据权利要求1所述的一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针和阻遏序列的组合物，其特征在于：所述引物探针和阻遏序列的组合物还包括针对参比基因的引物探针，所述参比基因为N基因，所述N基因的引物探针组如SEQ ID NO.16-18所示。
4.包含权利要求1-3任一所述一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针和阻遏序列的组合物的试剂盒在非诊断目的的新型冠状病毒突变株检测中的应用。
5.一种用于新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-3任一所述的用于检测新型冠状病毒突变株检测的引物探针和阻遏序列的组合物、ARMS-荧光PCR酶系、ARMS-荧光PCR反应体系、阳性质控品和阴性质控品。
6.根据权利要求5所述的一种用于新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各引物探针组和阻遏序列的浓度分别为：
0.1-0.5μM的针对N501Y突变位点的上游引物、0.1-0.5μM的针对N501Y突变位点的下游引物、0.05-0.25μM的针对N501Y突变位点的探针和0.02-0.1μM的针对N501Y非突变位点设计的阻遏序列；
0.1-0.5μM的针对69-70del突变位点的上游引物、0.1-0.5μM的针对69-70del突变位点的下游引物、0.05-0.25μM的针对69-70del突变位点的引物探针和0.02-0.1μM的针对69-70del非突变位点设计的阻遏序列；
0.1-0.5μM的针对E484K突变位点的上游引物、0.1-0.5μM的针对E484K突变位点的下游引物、0.05-0.25μM的针对E484K突变位点的探针和0.02-0.1μM的针对E484K非突变位点设计的阻遏序列；
0.1-0.5μM的针对K417T突变位点的上游引物、0.1-0.5μM的针对K417T突变位点的下游引物、0.05-0.25μM的针对K417T突变位点的探针和0.02-0.1μM的针对K417T非突变位点设计的阻遏序列；
0.1-0.5μM的针对K417N突变位点的上游引物、0.1-0.5μM的针对K417N突变位点的下游引物、0.05-0.25μM的针对K417N突变位点的探针和0.02-0.1μM的针对K417N非突变位点设计的阻遏序列；
0.1-0.5μM的参比基因为N基因的上游引物、0.1-0.5μM的参比基因为N基因的下游引物、0.05-0.25μM的参比基因为N基因的探针。
7.根据权利要求5所述的一种用于新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒，其特征在于：所述ARMS-荧光PCR酶系包括热启动Taq酶、UDG酶和逆转录酶M-MMLV。
8.根据权利要求5所述的一种用于新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒，其特征在于：所述ARMS-荧光PCR反应体系包括Tris-HCl、KCl、Mg2+、(NH4)2SO4、dNTP和RNA酶抑制剂。
9.根据权利要求8所述的一种用于新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒，其特征在于：所述ARMS-荧光PCR反应体系还包括添加剂组合，所述添加剂组合由0.001-0.1μ/反应的焦磷酸酶和0-5ng/μL的T4噬菌体基因32编码蛋白组成。
10.根据权利要求9所述的一种用于新型冠状病毒突变株分型检测试剂盒，其特征在于：所述添加剂组合还包括1-10%的聚乙二醇、1-10%的DMSO和0-2M的甜菜碱中的至少一种。
11.一种非诊断目的的用于新型冠状病毒突变株的分型检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S10、获取样本并提取病毒核酸；
S20、选择N基因及其他新型冠状病毒2019-nCOV的基因作为参比基因，并使用权利要求5-9任一所述的试剂盒对步骤S10中的核酸进行ARMS-荧光PCR扩增；
S30、利用步骤S20中的突变位点检测结果与N基因检测结果Ct值的差值对S基因上的突变位点N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N突变位点进行判定。
12.根据权利要求11所述的一种非诊断目的的用于新型冠状病毒突变株的分型检测方法，其特征在于：判读规则如下：
N501Y检测结果的判定：N501YCt值≤40且N501Y与N基因Ct值差值≤6则判定结果为N501Y突变阳性；N501Y无Ct值或N501YCt值＞40，或N501YCt值≤40且N501YCt值与N基因Ct值差值＞6，则判定结果为N501Y突变阴性；
69-70del检测结果的判定：69-70del Ct值≤40且69-70del与N基因Ct值差值≤6则判定结果为69-70del突变阳性；69-70del无Ct值或69-70del Ct值＞40，或69-70del Ct值≤40且69-70del Ct值与N基因Ct值差值＞6，则判定结果为69-70del突变阴性；
E484K检测结果的判定：E484K Ct值≤40且E484K与N基因Ct值差值≤6则判定结果为E484K突变阳性；E484K无Ct值或E484K Ct值＞40，或E484K Ct值≤40且E484K Ct值与N基因Ct值差值＞6，则判定结果为E484K突变阴性；
K417T检测结果的判定：K417T Ct值≤40且K417T与N基因Ct值差值≤6则判定结果为K417T突变阳性；K417T无Ct值或K417TCt值＞40，或K417T Ct值≤40且K417T Ct值与N基因Ct值差值＞6，则判定结果为K417T突变阴性；
K417N检测结果的判定：K417N Ct值≤40且K417N与N基因Ct值差值≤6则判定结果为K417N突变阳性；K417N无Ct值或K417N Ct值＞40，或K417N Ct值≤40且K417N Ct值与N基因Ct值差值＞6，则判定结果为K417N突变阴性。
13.根据权利要求12所述的一种非诊断目的的用于新型冠状病毒突变株的分型检测方法，其特征在于：
S基因上的N501Y和69-70del突变位点检测结果为阳性，则B.1.1.7突变株的检测结果为阳性；
S基因上的N501Y、E484K和K417N突变位点检测结果为阳性，则B.1351突变株的检测结果为阳性；
S基因上的N501Y、E484K和K417T突变位点检测结果为阳性，则P.1突变株的检测结果为阳性；
S基因上的N501Y、69-70del、E484K、K417T和K417N突变位点检测结果为阴性，则B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株检测结果为阴性。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114561490B (zh) * 2021-12-09 2022-12-09 圣湘生物科技股份有限公司 检测SARS-CoV-2突变位点的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN113817872A (zh) * 2021-09-18 2021-12-21 北京艾瑞克阳医疗科技有限公司 2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法
CN113897460B (zh) * 2021-11-02 2022-08-16 深圳市梓健生物科技有限公司 一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法
CN113881812B (zh) * 2021-12-03 2022-02-15 深圳联合医学科技有限公司 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN113943838A (zh) * 2021-12-09 2022-01-18 常州国药医学检验实验室有限公司 基于多重荧光定量arms-pcr技术的新冠病毒奥密克戎突变序列检测技术及其应用
CN114134143A (zh) * 2021-12-23 2022-03-04 郑州安图生物工程股份有限公司 检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒
CN114164303A (zh) * 2021-12-28 2022-03-11 山西大学 一种鉴定新型冠状病毒Gamma变异株的qRT-PCR方法
CN114410840A (zh) * 2022-01-10 2022-04-29 广州达安基因股份有限公司 检测新型冠状病毒及其n501y突变位点的试剂盒及检测方法
CN114262758B (zh) * 2022-01-10 2024-04-05 广州达安基因股份有限公司 检测新型冠状病毒突变株的试剂盒及检测方法
CN114085928B (zh) * 2022-01-19 2022-04-26 广东和信健康科技有限公司 一种用于新型冠状病毒Omicron突变株分型的快速检测体系
CN114317831B (zh) * 2022-01-26 2024-01-09 杭州医学院 一种用于检测新型冠状病毒Omicron突变株的试剂盒
CN114107574B (zh) * 2022-01-27 2023-05-12 深圳联合医学科技有限公司 检测新型冠状病毒及其Omicron突变株的试剂盒和方法
CN114657285A (zh) * 2022-02-28 2022-06-24 山西大学 一种鉴定新型冠状病毒Omicron变异株BA-2分枝的qRT-PCR方法
CN116287446B (zh) * 2023-01-09 2024-02-02 江苏默乐生物科技股份有限公司 基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株的引物探针组合、试剂盒及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107419018A (zh) * 2012-02-16 2017-12-01 江苏宏微特斯医药科技有限公司 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
CN111020031A (zh) * 2019-12-10 2020-04-17 银丰基因科技有限公司 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法
US10815539B1 (en) * 2020-03-31 2020-10-27 Diasorin S.P.A. Assays for the detection of SARS-CoV-2
CN112813203A (zh) * 2021-03-02 2021-05-18 常州国药医学检验实验室有限公司 基于荧光定量pcr技术的新冠病毒核酸及突变基因检测试剂盒及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304372B (zh) * 2020-04-29 2020-08-14 圣湘生物科技股份有限公司 检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107419018A (zh) * 2012-02-16 2017-12-01 江苏宏微特斯医药科技有限公司 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
CN111020031A (zh) * 2019-12-10 2020-04-17 银丰基因科技有限公司 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法
US10815539B1 (en) * 2020-03-31 2020-10-27 Diasorin S.P.A. Assays for the detection of SARS-CoV-2
CN112813203A (zh) * 2021-03-02 2021-05-18 常州国药医学检验实验室有限公司 基于荧光定量pcr技术的新冠病毒核酸及突变基因检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
40 minutes RT-qPCR Assay for Screening Spike N501Y and V69-70del Mutations;Gulay Korukluoglu1等;《bioRxiv》;20210126;摘要，表1、图2 *
Multiplex SARS-CoV-2 Genotyping PCR for Population-Level 1 Variant Screening and Epidemiologic Surveillance;Hannah Wang等;《medRxiv》;20210501;摘要，第94-113、307-312行，表1-2 *

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