CN111304368A

CN111304368A - 用于检测新型冠状病毒的方法、寡核苷酸和试剂盒

Info

Publication number: CN111304368A
Application number: CN202010197669.XA
Authority: CN
Inventors: 张太松; 刘学锋; 章小雯; 朱丽敏
Original assignee: Leadway HK Ltd
Current assignee: Leadway HK Ltd
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明公布了用于检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的寡核苷酸、试剂盒和方法，其涉及用于针对新型冠状病毒基因组中Orf1ab、N和S基因区域设计特异性的引物及探针，在快速提取样本中的核酸后采用一步法荧光RT‑PCR技术检测新型冠状病毒核酸；本发明操作简单，同时检测新型冠状病毒三个靶标基因，可以避免漏检。

Description

用于检测新型冠状病毒的方法、寡核苷酸和试剂盒

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物、探针、方法和试剂盒，采用荧光RT-PCR技术，用于检测临床样本中的新型冠状病毒核酸。

背景技术

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的冠状病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。

冠状病毒主要引起呼吸道和胃肠道感染，并且在遗传学上被分为四个主要的病毒属：甲型冠状病毒(Alphacoronavirus)、乙型冠状病毒(Betacoronavirus)、丙型冠状病毒(Gammacoronavirus)和丁型冠状病毒(Deltacoronavirus)。前两个属主要感染哺乳动物，而后两个属主要感染鸟类。人们先前已鉴定六种人类冠状病毒，包括HCoV-NL63和HCoV-229E，它们属于甲型冠状病毒；HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)，属于乙型冠状病毒。直到2003年SARS大流行和2012年MERS疫情发生后，冠状病毒才引起全球关注。SARS-CoV和MERS-CoV被认为是高致病性的，而且SARS-CoV和MERS-CoV可能由蝙蝠传播给果子狸或单峰驼，最后传播给人类。

从2019年12月开始，一种称为SARS-CoV-2(之前称为2019-nCoV)的新型冠状病毒导致包括中国在内的全世界30多个国家和地区爆发病毒性肺炎。这种新型冠状病毒可导致2019年冠状病毒病(COVID-19)。通过对现有病例的观察和研究，新型冠状病毒SARS-CoV-2感染人体后的潜伏期中位数为3天，最长可达24天(Wei-jie Guan et al.ClinicalCharacteristics of Coronavirus Disease 2019 in China.NEJM,28 February 2020,doi:10.1056/NEJMoa2002032)；此外，有人估算SARS-CoV-2的基本再生数(R0)为3.6～4.0(95％置信区间)(Jonathan M Read et al.Novel coronavirus 2019-nCoV:earlyestimation of epidemiological parameters and epidemic predictions.medRxiv,28January 2020,doi:10.1101/2020.01.23.20018549)。

鉴于SARS-CoV-2具有较长的潜伏期和较高的R0数值，SARS-CoV-2病例的出现和迅速增加给全球公共卫生、研究界和医学界带来了复杂的挑战。COVID-19疫情提醒人们正在出现和重新出现传染性病原体的挑战。对SARS-CoV-2进行持续监测、及时诊断和开展强有力的研究以了解新型病原体的基本生物学特性有助人们制定有效的对策。

基于侧向流动的免疫层析法检测抗SARS-CoV-2IgM/IgG的方法灵敏度较低。鉴于SARS-CoV-2具有较强的传染性，以及现有证据表明无症状的SARS-CoV-2感染者也很可能会传播病毒，因此较低的灵敏度会导致漏检率偏高，这不利于疫情控制。相比于基于侧向流动的免疫层析法，采用分子检测手段确定病毒是否存在具有很大优势。然而，目前市面上检测SARS-CoV-2的核酸测定产品仍然比较少。

发明内容

本发明提供一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法、寡核苷酸和试剂盒，选择了新型冠状病毒基因组中三个不同的保守区域---开放阅读框1ab(open readingframe 1ab，Orf1ab)、核壳蛋白基因(nucleocapsid protein，N)、spike蛋白基因(spikeprotein，S)设计三组引物和探针，同时引入针对RNaseP(Human RNaseP protein)基因的扩增引物和探针，可以有效地避免检测临床样本时遇到的假阴性。这种针对新型冠状病毒的三靶标检测体系可以有效避免新型冠状病毒漏检的问题。

鉴于新型冠状病毒SARS-CoV-2的envelope(E)基因在序列对比过程中与SARS-CoV及蝙蝠SARS样冠状病毒基因序列同源性较高，为避免检测时出现假阳性，本发明特别选择了SARS-CoV-2的S基因作为检测靶标。

在本发明中，位于每条探针5’端的x1、x2、x3和x4为荧光报告基团，位于每条探针5’端的y1、y2、y3和y4为发出荧光或不发出荧光的淬灭基团。

本发明中的同一条探针的荧光报告基因和淬灭基团以诸如“FAM-TARMA/BHQ1”或“VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1”之类的形式给出，“-”左边的表示荧光报告基团，“-”右边的表示淬灭基团。FAM-TARMA/BHQ1表示一条探针的荧光报告基因为FAM，淬灭基团可选自TARMA或BHQ1。VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1表示，一条探针的荧光报告基因可选自VIC、HEX或JOE，淬灭基团可选自TAMRA或BHQ1。

本发明提供用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸至少包括(1)～(3)中的一种：(1)用于检测新型冠状病毒基因组中第一个保守性区域的第一引物对和第一探针；(2)用于检测新型冠状病毒基因组中第二个保守性区域的第二引物对和第二探针；(3)用于检测新型冠状病毒基因组中第三个保守性区域的第三引物对和第三探针。

进一步地，所述寡核苷酸包括(4)用于检测内参基因的第四引物对和第四探针。

进一步地，所述第一个保守性区域、所述第二个保守性区域和所述第三个保守性区域来自Orf1ab、N基因或S基因。

进一步地，所述第一引物对和第一探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:1～3。

进一步地，所述第二引物对和第二探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:4～6。

进一步地，所述第三引物对和第三探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:7～9。

进一步地，所述第四引物对和第四探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:10～12。

进一步地，每条探针的荧光报告基因和淬灭基团选自FAM-TARMA/BHQ1、VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1、ROX/Texas Red-BHQ2和Cy5/LC Red640-BHQ2/BHQ3中的任何一种。

本发明还提供一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，所述方法包括：(1)提取样品中的核酸；(2)采用荧光RT-PCR方法确定样本中是否存在新型冠状病毒，其特征在于：所述一组引物和探针的碱基序列为SEQ ID NO:1～12。

本发明还提供一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包括荧光RT-PCR反应液，所述荧光RT-PCR反应液包括寡核苷酸，所述寡核苷酸至少包括(1)～(3)中的一种：(1)用于检测新型冠状病毒基因组中第一个保守性区域的第一引物对和第一探针；(2)用于检测新型冠状病毒基因组中第二个保守性区域的第二引物对和第二探针；(3)用于检测新型冠状病毒基因组中第三个保守性区域的第三引物对和第三探针。

进一步地，所述寡核苷酸还包括(4)用于检测内参基因的第四引物对和第四探针。

进一步地，每条引物和探针的浓度范围为75～300nM。

进一步地，所述荧光RT-PCR反应液还包括10～50mM Tris(pH 8.0～9.2)、10～50mM KCl、10～20mM硫酸铵、0.01％～0.1％Tween 20、0.2～2mg/mL BSA、0.1～0.3mMdATP、0.1～0.3mM dTTP、0.1～0.3mM dCTP、0.1～0.3mM dGTP、0.1～0.3mM dUTP和3～6mM氯化镁。

所述试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液包括1.5～3U Taq DNA聚合酶，0.5～3U Taq抗体，0.1～2U TS-UNG酶，2～10U逆转录酶和2～10U RNA酶抑制剂。

进一步地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括核酸提取液1、核酸提取液2和核酸提取液3，其中，所述核酸提取液1包括10～1000mM Tris-EDTA，1～8M异硫氢酸胍、1％～10％TritonX-100,pH 4～7,40％～60％异丙醇,直径在80～800nm之间的具有超顺磁性核心和氧化硅外壳的顺磁性氧化硅纳米磁珠，所述核酸提取液2包括10～1000mM Tris-EDTA，40％～60％无水乙醇，核酸提取液3包括10mM Tris-EDTA pH 8～10。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性质控和阴性质控，所述阳性质控为新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒，所述阴性质控为0.9％NaCl溶液。

进一步地，所述试剂盒操作流程为：(1)三步法提取样本核酸：第一步取0.5mL样本和0.5mL核酸提取液1，静止10min，磁力架吸附磁珠后弃上清；第二步加400μL核酸提取液2，涡旋混匀后静止5min，磁力架吸附磁珠后吸弃上清；第三步加入100μL核酸提取液3，涡旋混匀后静止5min，磁力架吸附磁珠后，取上清核酸溶液备用；(2)荧光RT-PCR试剂配制：将荧光RT-PCR反应液和酶混合液混匀，分别加入(1)中提取的样本核酸和阴性质控、阳性质控；(3)荧光RT-PCR检测：进行荧光RT-PCR扩增，扩增结束后确定样本中是否存在新型冠状病毒。

有益效果：(1)本发明选择了新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组中三个保守区域(分别为Orf1ab、N、S基因)设计三组引物和探针，同时引入人类基因组管家基因RNaseP作为内参，从而可以有效地避免临床样本采样失误、核酸提取失误等一系列因素导致的结果异常，更重要地，三靶标检测体系还可以解决新型冠状病毒漏检的问题；(2)鉴于新型冠状病毒SARS-CoV-2的E基因在序列对比过程中与SARS-CoV和蝙蝠SARS样冠状病毒基因序列同源性较高，为避免检测过程中出现假阳性，特别选择SARS-CoV-2的S基因作为其中的一种检测靶标；(3)对于弱阳性样本，部分靶标基因检测会出现假阴性，当出现2个或者2个以上靶标阳性，可以判断为新型冠状病毒核酸阳性，如果仅出现新冠1个靶标基因阳性，则需要复测，该方案可以有效提高检出能力；(4)鉴于新型冠状病毒在不同的人体环境中遭受不同的进化压力，具有不同的突变率，同时检测三个靶标基因可以有效避免因单个靶标基因突变导致的假阴性；(5)本发明可以从复杂样本检测出新型冠状病毒，具有灵敏度高、特异性好、检测结果快速客观等优点，为诊断新型冠状病毒感染提供可靠的结果。

附图说明

图1：作为对照的仪器磁珠法提取的核酸的检测结果。

图2：本发明的手工磁珠法提取的核酸的检测结果。

图3：本发明对阳性参考品P1的检测结果。

图4：本发明对阳性参考品P2的检测结果。

图5：本发明对阳性参考品P3的检测结果。

图6：本发明对阳性参考品P4的检测结果。

图7：本发明对阴性参考品N1-N10的检测结果。

图8：本发明N基因检测灵敏度初步判断结果图。

图9：本发明S基因检测灵敏度初步判断结果图。

图10：本发明Orf1ab基因检测灵敏度初步判断结果图。

图11：1000copies/mL时，本发明针对N基因检测灵敏度验证结果图。

图12：1000copies/mL时，本发明针对S基因检测灵敏度验证结果图。

图13：1000copies/mL时，本发明针对Orf1ab基因检测灵敏度验证结果图。

图14：500copies/mL时，本发明针对N基因检测灵敏度验证结果图。

图15：500copies/mL时，本发明针对S基因检测灵敏度验证结果图。

图16：500copies/mL时，本发明针对Orf1ab基因检测灵敏度验证结果图。

图17：250copies/mL时，本发明针对N基因检测灵敏度验证结果图。

图18：250copies/mL时，本发明针对S基因检测灵敏度验证结果图。

图19：250copies/mL时，本发明针对Orf1ab基因检测灵敏度验证结果图。

具体实施方式

在检测新型冠状病毒的方法中，本发明选择采用新型冠状病毒SARS-CoV-2中的保守序列来设计引物和探针，同时检测人类基因组中的管家基因RNaseP，检测临床样本中是否存在新型冠状病毒。但是，新型冠状病毒在不同的人体环境中遭受不同的进化压力，具有不同的突变率。为了尽可能降低由于基因序列突变而导致的新型冠状病毒漏检，本发明选择了新型冠状病毒基因组中三段保守序列设计三组引物和探针，同时引入人基因组管家基因作为内参，从而可以有效地避免临床样本采样失误、核酸提取失误等一系列因素导致的结果异常，更重要地，这还可以解决新型冠状病毒漏检的问题。基于此，设计出的引物和探针如表1所示。

表1.引物和探针

表1共含有4条TaqMan探针，每条探针的5’端(x1、x2、x3和x4)为荧光报告基团，3’端(y1、y2、y3和y4)为发出荧光或不发出荧光的淬灭基团。这4条探针的荧光报告基团可选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640和LCRED705等；淬灭基团可选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse和NFQ等，淬灭基团的选择原则在于淬灭基团的荧光吸收光谱与荧光报告基团的发射光谱存在重叠。表1中的这四条探针的荧光报告基团和淬灭基团优选组合方式为FAM-TARMA/BHQ1、VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1、ROX/Texas Red-BHQ2和Cy5/LC Red640-BHQ2/BHQ3中的任何一种。优选地，每条探针的荧光报告基团各不相同，这样就可在单管中同时进行四通道检测。

优选的荧光报告基团为FAM、ROX和Cy5，这是因为这三种荧光报告基团在荧光RT-PCR检测中具有本底荧光低和荧光检测信号高的优点。

在进行荧光RT-PCR之前，需要提取临床样本中的核酸(RNA)，提取核酸的方法有很多种，比如碱裂解法、磁珠法和柱提法。为了便于说明，本发明采用磁珠法提取临床样本中的核酸，所使用的核酸提取试剂包括核酸提取液1、核酸提取液2和核酸提取液3，所述核酸提取液1包括10～1000mM Tris-EDTA，1～8M异硫氢酸胍和1％～10％TritonX-100,pH 4～7,40％～60％异丙醇,超顺磁性氧化硅纳米磁珠(磁珠直径在80～800nm之间，具有核壳结构，即超顺磁性核心和氧化硅外壳)，所述核酸提取液2包括10～1000mM Tris-EDTA，40％～60％无水乙醇，核酸提取液3包括10mM Tris-EDTA pH 8～10。

不过注意的是，虽然这里采用手工磁珠法提取临床样本中的核酸，但是本发明并不局限于这种核酸提取方法，仪器磁珠法和柱提法等方法均可用于本发明的临床样本核酸提取。

为了便于说明，在以下实施例中，以用于检测新型冠状病毒N基因的探针的荧光报告基团和淬灭基团为FAM-BHQ1、用于检测新型冠状病毒S基因的探针的荧光报告基团和淬灭基团为ROX-BHQ2、用于检测新型冠状病毒Orf1ab基因的探针的荧光报告基团和淬灭基团为CY5-BHQ3、用于人基因组管家基因RNaseP的探针的荧光报告基团和淬灭基团为VIC-BHQ1为例进行说明。在本发明的实施例中使用的阳性质控为新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒。

以下实施例进一步说明本发明。这些实施例不是用来限制本发明范围，而是提供对本发明的进一步理解。

实施例1：临床样本核酸的提取

为方便说明，本实施例中以正常人口咽拭子作为临床样本，通过对本发明中描述的手工磁珠法进行临床样本核酸提取，并采用仪器磁珠法的提取试剂盒作为对照进行对比说明。

取10例正常人口咽拭子，按照本发明的三步法提取样本RNA：第一步取0.5mL样本和0.5mL核酸提取液1，静止10min，磁力架吸附磁珠后弃上清；第二步加400μL核酸提取液2，涡旋混匀后静止5min，磁力架吸附磁珠后吸弃上清；第三步加入100μL核酸提取液3，涡旋混匀后静止5min，磁力架吸附磁珠后，取上清核酸溶液备用。

本发明中核酸提取方法为手工磁珠法，采用三步法对临床样本分别进行裂解、洗涤及洗脱。采用艾康生物技术(杭州)有限公司生产的核酸(RNA)提取试剂盒(磁珠法)作为对照在艾康生物技术(杭州)有限公司制造的

核酸提纯仪上对同样的临床样本进行核酸提取(即仪器磁珠法)，采用本发明的试剂盒检测人基因组管家基因RNaseP，对检测到的Ct值进行比较，对比结果如表2所示，扩增结果如图1和图2所示。由图1和图2可知，本发明的核酸提取方法(手工磁珠法)与利用仪器磁珠法提取核酸的检测结果基本一致，然而在仪器磁珠法中，存在加热的步骤，这可能导致气溶胶产生，而本发明的核酸提取方法(手工磁珠法)不存在加热步骤，可以有效避免仪器操作过程由于加热导致的气溶胶污染。

表2核酸提取方法检测结果对比

实施例2：利用荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒

本实施例中采用试剂盒对新型冠状病毒进行荧光RT-PCR检测，试剂盒包括荧光RT-PCR反应液、酶混合液、阳性质控、阴性质控。优选地，这种试剂盒还可包括实施例1中的核酸提取液1、核酸提取液2和核酸提取液3。荧光RT-PCR反应液配制体系见表3。酶混合液配制体系见表4。阳性质控为新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒，阴性质控为0.9％NaCl溶液。

表3.荧光RT-PCR反应液配制体系表(1人份)

表4.酶混合液配制体系(1人份)

检测临床样本中病原体新型冠状病毒时，需将荧光RT-PCR反应液和酶混合液混匀，以及计算所需的样本数n份[n＝临床样本数+1管阳性对照+1管阴性对照]。将20μL荧光RT-PCR反应液加入到不同的反应管中，然后分别往不同的反应管中加入20μL实施例1中提取的核酸溶液、20μL阴性对照和20μL阳性对照。

将各个反应管按一定顺序放入荧光PCR仪(ABI 7500)上，按以下程序进行荧光RT-PCR扩增，扩增程序如表5所示：

表5.荧光RT-PCR扩增程序

荧光RT-PCR扩增结束后，根据FAM通道、VIC通道、ROX通道、Cy5通道的Ct值检测新型冠状病毒是否存在，其检测结果判断如表6所示。

表6.检测结果Cutoff值及结果判读

a.新型冠状病毒SARS-CoV-2三个靶标基因检测判读标准：

1)阴性：Ct值未检出；

2)阳性：扩增曲线呈S型，且Ct值≤40；

3)可疑：扩增曲线呈S型，且40＜Ct值≤45，需复检；复检结果若一致，判定结果为该基因检测阳性。

b.新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测阳性判读标准：

2个或2个以上靶标基因检测结果为阳性，则判断为新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸阳性。

c.RNaseP内参基因ROX通道为阴性，说明样本中含有PCR反应抑制物、提取失败或实验过程中漏加样本，建议重新采样、提取及测试。极少数样本可能因采样问题出现新型冠状病毒核酸检测结果为阳性，而内参无扩增信号或Ct值＞40，这种情况阳性结果仍然可信，必要时重新采样复测确认。

临床样本常见检测结果如表7所示，其他异常结果需结合临床进行结果解释。

表7.临床样本常见结果解释

实施例3：临床样本验证

在临床中心对290例核酸提取液样本进行测试，用于临床评价。

按照实施例2中描述的方法，配制新型冠状病毒荧光RT-PCR反应液配制体系，对这290例核酸提取液样本进行荧光RT-PCR扩增，并记录检测结果。在这290例样本中，临床中心结合分子检测、CT影像学和流行病学调查结果确定为118例阳性和172例阴性(作为对照结果)。本发明针对三个靶标基因的检测结果分析如表8所示。

表8.新型冠状病毒核酸检测临床验证结果

阳性符合率＝[115/(3+115)]×100％＝97.46％

阴性符合率＝[169/(3+169)]×100％＝98.26％

总符合率＝[(115+169)/(115+3+3+169)]×100％＝97.93％

四方表kappa检验：

n＝a+b+c+d＝115+3+3+169＝290

Po＝(a+d)/n＝(115+169)/690＝0.9793

Pe＝[(a+b)(a+c)+(d+b)(d+c)]/n²

＝[(115+3)(115+3)+(169+3)(169+3)]/290²＝0.5173

Kappa＝(Po-Pe)/(1-Pe)＝(0.9793-0.5173)/(1-0.5173)＝0.9571

Kappa分析判断标准如下：

Kappa	标准
		＝1	表示完全一致
＞0.75	表示有很好的一致性
		＜0.4	表示一致性不好
＝0	表示两组结果是机遇造成的

临床试验表明，本发明试剂的检测结果与对照结果在一致性分析中的Kappa值为0.9571，kappa>0.75，表明本发明试剂的检测结果与对照结果相关性较好。

对不一致的检测结果进行原因分析，见表9所示：

表9.不一致结果原因分析

实施例4参考品体系建立及评价

本实施例中，针对本发明所述的试剂盒设置如下参考品进行性能评价。

阳性参考品设置：选择含有新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA片段的假病毒颗粒浓度在1×10⁴copies/mL～1×10⁶copies/mL范围内的阳性参考品4份，标记为P1～P4。

阴性参考品设置：选择1份甲型流感病毒H1N1核酸提取物，标记为N1；1份甲型流感病毒H3N2核酸提取物，标记为N2；1份乙型流感病毒Victoria型核酸提取物，标记为N3；1份呼吸道合胞病毒A型核酸提取物，标记为N4；1份呼吸道合胞病毒B型核酸提取物，标记为N5；1份腺病毒3型核酸提取物，标记为N6；1份腺病毒7型核酸提取物，标记为N7；1份副流感病毒1型核酸提取物，标记为N8；1份副流感病毒3型核酸提取物，标记为N9；1份人口咽脱落细胞提取物，标记为N10。

按照实施例2种所述的方法对试剂盒中设置的参考品进行阴阳符合率的评价。结果如下所示：

阳性参考品P1～P4检测结果为FAM、VIC、ROX、Cy5通道检测结果均为阳性。如图3～6所示。

阴性参考品N1～N10检测结果为FAM、VIC、Cy5通道检测结果均为阴性，仅ROX通道检测结果为阳性。如图7所示。

实施例5检测灵敏度分析

在本实施例中，对含有新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA片段的假病毒颗粒4倍梯度稀释，按照实施例2中的方法对梯度稀释样本进行检测，初步判断试剂盒的检测下限，初步判断结果为检测下限为500copies/mL左右。如图8～10所示。

按照实施例2所述的方法分别对含有新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA片段的假病毒颗粒在不同浓度(浓度分别为S1:1000copies/mL、S2:500copies/mL、S3:250copies/mL)下重复20次检验，以95％检出率来确认试剂盒的检测下限。检测结果详见表10～12，N、S、Orf1ab基因扩增引物探针分别对1000、500copies/mL假病毒颗粒的检出率均为100％，N、S、Orf1ab基因扩增引物探针分别对125copies/mL假病毒颗粒的检出率为95％、80％、80％。综上所述，本发明的试剂盒检测下限为500copies/mL。如图11～19所示。

表10.检测限样本S1检测结果统计

表11.检测限样本S2检测结果统计

表12.检测限样本S3检测结果统计

实施例6检测精密度分析

按照实施例2所述的方法别对1例中浓度阳性参考品(J1，浓度约10⁶copies/mL)、1例弱阳性参考品(J2,浓度约10⁵copies/mL)分别重复10次检测，统计不同通道检测结果，详见表13，从结果可以得出，试剂盒检测Ct值的CV均小于5％，由此可知本发明的试剂盒批内精密度良好。

表13.精密度样本检测结果

实施例7反应特异性分析

本实施例中，针对本发明所述的试剂盒对其他冠状病毒及呼吸道病原体等交叉样本进行验证。结果详见表14，从结果可以得出，本发明的试剂盒对其他冠状病毒及呼吸道病原体检测无交叉反应，由此可知本发明的试剂盒特异性良好。

表14.交叉病原体验证结果

序列表

<110> 艾康生物技术（杭州）有限公司

<120> 用于检测新型冠状病毒的方法、寡核苷酸和试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgctcttgct ttgctgctgc ttgacaga 28

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctaagcacac gcctattaat ttagtgc 27

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcaagtaaa gtttgaaacc tagtgatg 28

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggcaaatct accaatggtt ctaaagccga 30

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaatcttaa gtaygccatt agtgca 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acagtagctc ctctagtggc ggctat 26

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaatagagc tcgcaccgta gctggtgtc 29

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agatttggac ctgcgagcg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagcggctgt ctccacaagt 20

Claims

1.用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸至少包括(1)～(3)中的一种：(1)用于检测新型冠状病毒基因组中第一个保守性区域的第一引物对和第一探针；(2)用于检测新型冠状病毒基因组中第二个保守性区域的第二引物对和第二探针；(3)用于检测新型冠状病毒基因组中第三个保守性区域的第三引物对和第三探针。

2.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括(4)用于检测内参基因RNaseP基因的第四引物对和第四探针。

3.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第一个保守性区域、所述第二个保守性区域和所述第三个保守性区域来自Orf1ab、N基因或S基因。

4.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第一引物对和第一探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:1～3。

5.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第二引物对和第二探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:4～6。

6.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第三引物对和第三探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:7～9。

7.如权利要求2所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第四引物对和第四探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:10～12。

8.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，每条探针的荧光报告基因和淬灭基团选自FAM-TARMA/BHQ1、VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1、ROX/Texas Red-BHQ2和Cy5/LC Red640-BHQ2/BHQ3中的任何一种。

9.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包括荧光RT-PCR反应液，其特征在于，所述荧光RT-PCR反应液包括如权利要求1～8之一所示的寡核苷酸。

10.如权利要求9所示的试剂盒，所述试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括核酸提取液1、核酸提取液2和核酸提取液3，其特征在于，所述核酸提取液1包括10～1000mM Tris-EDTA，1～8M异硫氢酸胍和1％～10％TritonX-100,pH 4～7,40％～60％异丙醇,顺磁性氧化硅纳米磁珠，所述核酸提取液2包括10～1000mM Tris-EDTA，40％～60％无水乙醇，所述核酸提取液3包括10mM Tris-EDTA pH 8～10。