CN111808990A - 2019-nCoV核酸检测试剂盒 - Google Patents
2019-nCoV核酸检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种2019‑nCoV核酸检测试剂盒,属于分子生物学检测技术领域,该包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标引物对和探针组,所述探针组包括ORF1ab基因探针、N基因探针和内参探针。本发明提供的2019‑nCoV核酸检测试剂盒,其提供的引物探针组扩增的核酸序列片段更短且覆盖序列更全面,有效改善了现有引物探针对存在漏检的问题,且特异性强,灵敏度高;无需针对不同基因进行多次检测,极大的提高检测效率,降低了检测成本。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域,具体涉及一种2019-nCoV核酸检测试剂盒。
背景技术
2019-nCoV主要传播途径为经呼吸道飞沫传播,以呼吸道分泌物排出体外,经口液、喷嚏传染,亦可通过接触传播。感染新冠病毒后潜伏期在3-7天,一般不超过14天,临床表现以发热乏力、干咳为主,鼻塞流涕等上呼吸道症状少见,约半数患者多在一周后出现呼吸困难,严重者进展为急性呼吸窘迫综合征、休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。
冠状病毒为单链RNA病毒,属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae),正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinac),根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ、δ4个属,已知感染人的冠状病毒有6 种,包括α属的冠状病毒(HCoV-229E和HCoV-NL63)和β属的冠状病毒 (HCoV-HKU1、HCoV-OC43、MERS-CoV和SARS-CoV),2019-nCoV为β属的新型冠状病毒。
2019-nCoV具有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,经常为多形性,直径60-140nm。病毒基因组5’端具有甲基化的帽状结构,3’端具有poly(A)尾,基因组全长约 27-32kb,是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒全基因组通常含有7个开放阅读框,每相邻两基因之间存在间隔序列,5’端为非编码区帽子结构,3’端为多聚腺苷酸非编码区;从5’端起约占据全基因组的三分之二的 ORF1(包含ORF1a和1b)也称为复制酶基因,负责编码16个以上与病毒复制相关的非结构蛋白;靠近3’端的4个开放阅读框,依次编码S蛋白(spikeprotein)、 E蛋白(envelope protein)、M蛋白(membrane protein)和N蛋白(nucleoprotein)。冠状病毒S蛋白位于病毒表面形成棒状结构,是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因组可用作诊断抗原。
各研究机构及生物公司都致力于相关核酸检测试剂盒的开发和生产,经过半年多的使用发现,目前市场上的2019-nCoV核酸检测试剂盒,患者在早期感染阶段存在漏检情况。“根据天津疾控中心1月30日公布的新增确诊案例情况显示,天津疾控第28例患者,男,55岁,与本单位多名新型冠状病毒感染的肺炎患者为密切接触者。1月19日出现发热,1月25日就诊于市第四中心医院,两次核酸检测阴性,予以居家隔离。1月27日再次发热,1月28日核酸检测阴性,1月30日第四次检测为阳性。”上述案例的出现说明一部分早期感染的患者在体液中病毒载量低,虽然用现有的检测试剂盒反复多次检测结果为阴性,但是仍然是病毒感染者且具有感染性。而这类患者的漏检很可能造成周围人群进一步的感染,不利于病毒传播的控制。申请号为202010160474.8的中国发明专利,公开了一种新型冠状病毒N基因核酸检测试剂盒,采用N基因特异引物和 Taqman探针,结合特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程,实现对2019-nCoV N基因的检测。申请号为202010160162.7的中国发明专利,公开了一种新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒用ORF1ab基因特异引物和Taqman探针,结合特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程,实现对2019-nCoVORF1ab基因的检测。但上述方法分别对不同靶基因进行检测,仍然存在漏检的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷,本发明所要解决的技术问题是:提供一种能够实现早期检测,灵敏度高,特异性高的2019-nCoV核酸检测试剂盒。
ORF1ab基因和N基因有较高的同源性和特异性,采用ORF1ab基因和N 基因双靶基因检测的检出效果优于单基因检测,但是由于不同靶基因间引物的相互扩增,影响检测结果的准确性,使得目前还未出现能够避免这一问题的 2019-nCoV核酸检测试剂盒。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:2019-nCoV核酸检测试剂盒,包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标引物对和探针组;
所述ORF1ab基因引物对包括SEQ ID NO.1所示的正向引物ORF1ab-F和SEQ IDNO.2所示的反向引物ORF1ab-R;
所述N基因引物对包括SEQ ID NO.3所示的正向引物N-F和SEQ ID NO.4 所示的反向引物N-R;
所述内标引物对包括SEQ ID NO.5所示的正向引物β-actin-RNA-F和SEQ ID NO.6所述反向引物β-actin-RNA-R;
所述探针组包括SEQ ID NO.7所示的ORF1ab基因探针、SEQ ID NO.8所示的N基因探针和SEQ ID NO.9所示的内参探针。
表1
本发明的有益效果在于:本发明提供的2019-nCoV核酸检测试剂盒,选用 ORF1ab基因和N基因双靶基因检测,通过对引物的设计,控制各靶基因的引物扩增片段在100bp内,克服了不同靶基因间引物相互扩增的问题,可在单管中一次检测3个基因。本发明提供的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其提供的引物探针组扩增的核酸序列片段更短且覆盖序列更全面,有效改善了现有引物探针对存在漏检的问题,且特异性强,灵敏度高;无需针对不同基因进行多次检测,极大的提高检测效率,降低了检测成本。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式的2019-nCoV核酸检测试剂盒用于检测不同浓度样本的结果示意图;
图2所示为本发明具体实施方式的2019-nCoV核酸检测试剂盒用于检测不同病毒的结果示意图;
图3所示为本发明具体实施方式的2019-nCoV核酸检测试剂盒用于检测不同地区样本的结果示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明的2019-nCoV核酸检测试剂盒,包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标引物对和探针组;
所述ORF1ab基因引物对包括SEQ ID NO.1所示的正向引物ORF1ab-F和 SEQ IDNO.2所示的反向引物ORF1ab-R;
所述N基因引物对包括SEQ ID NO.3所示的正向引物N-F和SEQ ID NO.4 所示的反向引物N-R;
所述内标引物对包括SEQ ID NO.5所示的正向引物β-actin-RNA-F和SEQ ID NO.6所述反向引物β-actin-RNA-R;
所述探针组包括SEQ ID NO.7所示的ORF1ab基因探针、SEQ ID NO.8所示的N基因探针和SEQ ID NO.9所示的内参探针。
从上述描述可知,本发明的有益效果在于:本发明提供的2019-nCoV核酸检测试剂盒,选用ORF1ab基因和N基因双靶基因检测,通过对引物的设计,控制各靶基因的引物扩增片段在100bp内,克服了不同靶基因间引物相互扩增的问题,可在单管中一次检测3个基因(ORF1ab基因、N基因及内标)。本发明提供的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其提供的引物探针组扩增的核酸序列片段更短且覆盖序列更全面,有效改善了现有引物探针对存在漏检的问题,且特异性强,灵敏度高;无需针对不同基因进行多次检测,极大的提高检测效率,降低了检测成本。
进一步的,所述ORF1ab基因探针、N基因探针和内参探针的3’端使用MGB、TAMRA或BHQ修饰,5’端使用FAM、HEX、VIC、Cy3或Cy5修饰。
进一步的,上述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,还包括缓冲体系、dATP、 dUTP、dGTP、dCTP、Mg2+、Taq酶、UDG酶、MMLV逆转录酶和RNase抑制剂。
进一步的,所述Mg2+的浓度为2-4mM。
进一步的,所述dATP、dUTP、dGTP、dCTP的浓度均为0.5-2mM。
进一步的,所述ORF1ab基因引物对、N基因引物和内标引物对的每个引物的浓度为200-500nM,所述探针组的每个探针的浓度100-300nM。
从上述描述可知,引物的浓度太低,会出现扩增产物太少的问题,而引物的浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会,本申请通过对引物和探针浓度的控制,对试剂盒进行优化,保证检测的准确性。
进一步的,上述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,包括第一反应液、第二反应液和第三反应液;
所述第一反应液包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标引物对和探针组;
所述第二反应液包括缓冲体系、dATP、dUTP、dGTP、dCTP和Mg2+;
所述第三反应液包括Taq酶、UDG酶、MMLV逆转录酶和RNase抑制剂。
进一步的,上述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,还包括阳性对照A,所述阳性对照A为含2019-nCoV ORF1ab基因片段的病毒样颗粒。
进一步的,上述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,还包括阳性对照B,所述阳性对照B为含2019-nCoV N基因片段的病毒样颗粒。
进一步的,上述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,还包括阴性对照,所述阴性对照为生理盐水。
实施例1:
一种2019-nCoV核酸检测试剂盒,包括1管第一反应液(55μL)、1管第二反应液(425μL)、1管第三反应液(85μL);、1管阳性对照A(1800μL)、1管阳性对照B(1800μL)和1管阴性对照(1800μL);
所述第一反应液包括:
SEQ ID NO.1所示的正向引物ORF1ab-F、SEQ ID NO.2所示的反向引物 ORF1ab-R、SEQ ID NO.3所示的正向引物N-F、SEQ ID NO.4所示的反向引物 N-R、SEQ ID NO.5所示的正向引物β-actin-RNA-F、SEQ ID NO.6所述反向引物β-actin-RNA-R、SEQ ID NO.7所示的ORF1ab基因探针、SEQ ID NO.8所示的N基因探针和SEQ ID NO.9所示的内参探针;
其中,ORF1ab-F的浓度为500nM,ORF1ab-R的浓度为500nM,N-F的浓度为500nM,N-R的浓度为500nM,β-actin-RNA-F的浓度为500nM,β -actin-RNA-R的浓度为500nM,ORF1ab基因探针的浓度为300nM,N基因探针的浓度为300nM,内参探针的浓度为300nM;
所述第二反应液包括缓冲体系、dATP、dUTP、dGTP、dCTP和Mg2+;
其中,dATP、dUTP、dGTP、dCTP的浓度为1mM,Mg2+的浓度为4mM;
所述第三反应液包括Taq酶、UDG酶、MMLV逆转录酶和RNase抑制剂;
所述阳性对照A为含2019-nCoV ORF1ab基因片段的病毒样颗粒;
所述阳性对照B为含2019-nCoV N基因片段的病毒样颗粒;
所述阴性对照为生理盐水。
实施例2:
实施例2的一种2019-nCoV核酸检测试剂盒,与实施例1的不同仅在于, ORF1ab-F的浓度为200nM,ORF1ab-R的浓度为200nM,N-F的浓度为200nM, N-R的浓度为200nM,β-actin-RNA-F的浓度为200nM,β-actin-RNA-R的浓度为200nM,ORF1ab基因探针的浓度为100nM,N基因探针的浓度为100nM,内参探针的浓度为100nM;
dATP、dUTP、dGTP、dCTP的浓度为0.5mM,Mg2+的浓度为2mM。
实施例3:
实施例3的一种2019-nCoV核酸检测试剂盒,与实施例1的不同仅在于, ORF1ab-F的浓度为400nM,ORF1ab-R的浓度为400nM,N-F的浓度为400nM, N-R的浓度为400nM,β-actin-RNA-F的浓度为400nM,β-actin-RNA-R的浓度为400nM,ORF1ab基因探针的浓度为200nM,N基因探针的浓度为200nM,内参探针的浓度为200nM;
dATP、dUTP、dGTP、dCTP的浓度为2mM,Mg2+的浓度为3mM。
实施例4:
使用实施例1提供的2019-nCoV核酸检测试剂盒进行核算检测,提供一种 2019-nCoV核酸检测方法,具体包括以下步骤:
步骤1、试剂准备:
从试剂盒中取出第一反应液和第二反应液,室温融化,充分振荡混匀后瞬间离心,再取出第三反应液;根据样品数量准备试剂N份(N=样本数+1份阳性对照+1份阴性对照),每份试剂中包括第一反应液1μL,第二反应液7.5μL和第三反应液1.5μL,装在PCR反应管;
步骤2、样本处理:
待测样本、阳性对照及阴性对照使用核酸提取试剂盒进行核酸提取,然后在步骤1的PCR反应管中分别加入待测样本、阳性对照和阴性对照的核酸,各 20μL,终体积为30μL/管,盖紧管盖,瞬时离心;
步骤3、PCR扩增检测:
将步骤2瞬时离心后的PCR反应管放入荧光定量PCR仪中,程序设置如表 2所示;其中,荧光信号收集在阶段4:60℃40sec(*标记),收集的荧光信号为探针标记的荧光(Cy5/FAM/VIC);
表2
步骤4、参数设定:
根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值。Start值设在3-15、End值建议设在5-20,同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线,点击Analysis自动获得分析结果,在Report界面察看结果;
步骤5、质量控制:
阴性质控品:Cy5和FAM通道无Ct值,VIC通道扩增曲线呈S形,且Ct 值≤35;
阳性质控品:Cy5和FAM通道扩增曲线呈S形,且Ct值≤30;
以上要求须全部满足,否则应重新实验;
其中,Cy5通道检测ORF1ab基因;FAM通道检测N基因,VIC通道检测内标;
步骤6、结果分析
2019-nCoV阴性判定:Cy5和FAM通道无明显扩增曲线,或Ct值>33,且 VIC通道扩增曲线呈S形,且Ct值≤35;
2019-nCoV阳性判定:Cy5和FAM通道扩增曲线呈S形,且Ct值≤33;
需重复检测:Cy5或FAM通道其中一个扩增曲线呈S形,且Ct值≤33,VIC通道无明显扩增曲线。若复检结果一致,则判定为2019-nCoV阳性。若复检结果Cy5和FAM通道无明显扩增曲线,或Ct值>33,且VIC通道扩增曲线呈S形,且Ct值≤35,则判定为阴性。
实施例5:
将经质粒标定的2019-nCoV临床样本稀释至约10000和300copies/mL,分别使用使用实施例1的试剂盒(AJA),以及WHO、CDC公布的引物探针对其进行检测,检测结果如图1所示。
从图1中可以看出,本试剂盒的最低检出限可达到300copies/ml。经重复实验,结果显示浓度为300copies/ml的病毒样本检出率为95%。
实施例6:
使用实施例1的试剂盒,分别对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSVA/B)、冠状病毒(HKU1,OC43,NL63,229E,SARS假病毒, MERS假病毒)、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ/Ⅱ型(PIVⅠ/Ⅱ)、肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和2019-nCoV进行检测,检测结果如图2所示。
从图2中可以看出,只有2019-nCoV样本检出为阳性,其他均为阴性(类水平线),表明本试剂盒特异性良好。
实施例7:
取不同地区样本用实施例1的试剂盒(AJA)及WHO,CDC公布引物探针序列进行检测,样本中包括福建、湖北、浙江地区的2019新型冠状病毒阳性样本各一例,结果如图3所示。
从图3中可以看出,WHO公布引物探针检测福建地区一例阳性样本结果为阴性,CDC公布引物探针检测浙江地区一例阳性样本结果为阴性,本试剂盒检测结果均显示为阳性,符合率为100%。可以看出,WHO,CDC公布的引物探针存在漏检的情况,而本发明提供的试剂盒具有更高的检出率。
综上所述,本发明提供的2019-nCoV核酸检测试剂盒,有效改善了现有引物探针对存在漏检的问题,特异性良好,灵敏度高;无需针对不同基因进行多次检测,极大的提高检测效率,降低了检测成本。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换,或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司
<120> 2019-nCoV核酸检测试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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cccgggccgt cttcccctc 19
Claims (10)
1.2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标引物对和探针组;
所述ORF1ab基因引物对包括SEQ ID NO.1所示的正向引物ORF1ab-F和SEQ ID NO.2所示的反向引物ORF1ab-R;
所述N基因引物对包括SEQ ID NO.3所示的正向引物N-F和SEQ ID NO.4所示的反向引物N-R;
所述内标引物对包括SEQ ID NO.5所示的正向引物β-actin-RNA-F和SEQ ID NO.6所述反向引物β-actin-RNA-R;
所述探针组包括SEQ ID NO.7所示的ORF1ab基因探针、SEQ ID NO.8所示的N基因探针和SEQ ID NO.9所示的内参探针。
2.根据权利要求1所述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,所述ORF1ab基因探针、N基因探针和内参探针的3’端使用MGB、TAMRA或BHQ修饰,5’的修饰使用FAM、HEX、VIC、Cy3或Cy5修饰。
3.根据权利要求1所述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,还包括缓冲体系、dATP、dUTP、dGTP、dCTP、Mg2+、Taq酶、UDG酶、MMLV逆转录酶和RNase抑制剂。
4.根据权利要求3所述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,所述Mg2+的浓度为2-4mM。
5.根据权利要求1所述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,所述dATP、dUTP、dGTP、dCTP的浓度均为0.5-2mM。
6.根据权利要求1所述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,所述ORF1ab基因引物对、N基因引物和内标引物对的每个引物的浓度为200-500nM,所述探针组的每个探针的浓度100-300nM。
7.根据权利要求1所述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,包括第一反应液、第二反应液和第三反应液;
所述第一反应液包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标引物对和探针组;
所述第二反应液包括缓冲体系、dATP、dUTP、dGTP、dCTP和Mg2+;
所述第三反应液包括Taq酶、UDG酶、MMLV逆转录酶和RNase抑制剂。
8.根据权利要求7所述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,还包括阳性对照A,所述阳性对照A为含2019-nCoV ORF1ab基因片段的病毒样颗粒。
9.根据权利要求7所述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,还包括阳性对照B,所述阳性对照B为含2019-nCoV N基因片段的病毒样颗粒。
10.根据权利要求7所述的2019-nCoV核酸检测试剂盒,其特征在于,还包括阴性对照,所述阴性对照为生理盐水。
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