CN111235320A - 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒 - Google Patents

新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新型冠状病毒2019‑nCoV核酸检测试剂盒，具体的地，本发明公开了一种多重检测新型冠状病毒2019‑nCoV核酸的试剂盒及方法，能够同时检测新型冠状病毒2019‑nCoV的3个核酸靶标，可通过不同靶标之间相互验证，防止出现假阳性，对可能因突变而引起的漏检进行确认，显著提高了病毒鉴定的准确性。

Description

新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合及试剂盒。
背景技术
冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）。冠状病毒属的病毒是具外套膜的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类脊椎动物。冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎的病原体，属于RNA病毒。病毒颗粒的直径60～200nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。目前已知的可感染人的冠状病毒共7种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和新型冠状病毒2019-nCoV。
新型冠状病毒2019-nCoV（SARS-CoV-2）属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV 和MERSr-CoV 有明显区别。
新型冠状病毒2019-nCoV为新发现病毒（基因序列参见GISAID：BetaCov/Wuhan/WH01/2019| EPI_ISL_406798），目前对于该病毒的诊断主要依靠临床症状、病毒分离培养和病毒核酸检测技术进行。临床症状可初步判定为疑似病例，病毒的确诊需要通过核酸检测阳性后方可确认。培养法具有较高的特异性和敏感性，但临床检测时间过长，过程繁琐，不适用于大范围检测。实时荧光PCR技术是在核酸反应管中加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时探针结合在DNA一条单链上，在Taq酶的5’－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光PCR技术是一种灵敏度、特异性和精密度更高的核酸检测技术，其检测结果准确，重复性高，能反应病原体变化，同时避免了传统PCR需后处理的问题，降低了污染的可能性。
市场上目前已有一些依据实时荧光定量PCR技术开发的核酸检测试剂盒，但多为单靶标检测试剂，缺乏多基因同时检测以对病毒进行确认，并且试剂性能差异较大，不利于病毒的检测与诊断。基于此，开发一套灵敏度高、特异性强、重复性好的产品用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测显得非常必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，以便能够高效率、高特异性、低成本的对新型冠状病毒2019-nCoV感染患者进行检测。
在本发明的第一方面，提供了一种用于多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对组，所述第一引物对组包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第二引物对组，所述第二引物对组包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
在另一优
选例中，所述引物对集还包括：
第三引物对组，所述第三引物对组包括：
如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
内标引物对组，所述内标引物对组包括：
如SEQ ID NO.10所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.11所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的探针组，所述探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针。
在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针。
在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第三探针。
在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的内控探针。
在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。
本发明的第三方面，提供了一种用于多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1-9所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中还包含SEQ ID NO.10-12所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，使用 PCR用缓冲液（Buffer）配制所述引物探针混合液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含PCR酶系，所述PCR酶系包括热启动酶、和逆转录酶M-MMLV；优选地还包括RNA酶抑制剂。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性质控品。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性质控品。
本发明的第四方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的方法，所述方法包括步骤：
（1）提供待检测对象的核酸样本；
（2）制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、或环境样本。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR酶系。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：N基因检测限；
图2：ORF1ab基因检测限测试；
图3：E基因检测限测试；
图4：内标测试结果；
图5.特异性测试结果；
图6.特异性检测内标测试结果；
图7. N基因精密度检测结果；
图8. ORF1ab基因精密度检测结果；
图9.E基因精密度检测结果；
图10. N基因干扰性检测结果；
图11. ORF1ab基因干扰性检测结果；
图12.E基因干扰性检测结果;
图13.临床样本检测结果；
图14. ORF1ab基因对照引物对检测结果；
图15. ORF1ab基因对照引物对检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒及方法，能够同时检测新型冠状病毒2019-nCoV的3个核酸靶标，可通过不同靶标之间相互验证，防止出现假阳性，对可能因突变而引起的漏检进行确认，显著提高了病毒鉴定的准确性。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101 和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
多重PCR
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
（1）反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
（2）引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
（3）最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
（4）引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
本发明提供一种特异性检测样品中新型冠状病毒2019-nCoV的N、ORF1ab和E基因的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒，
其中，用于N基因扩增的引物序列为：
SEQ ID NO.1：AAGAAATTCAACTCCAGGCAGC 和SEQ ID NO.2: GCTGGTTCAATCTGTCAAGCAG，
对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.3: TCACCGCCATTGCCAGCCA；
用于ORF1ab扩增的引物序列为：
SEQ ID NO.4：TTATCACCCGCGAAGAAG 和SEQ ID NO.5: TCTAGTAGCATGACACCCCT，
对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.6: TAAGACATGTACGTGCATGGATTGGC；
用于E基因扩增的引物序列为：
SEQ ID NO.7：CTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTT和SEQ ID NO.8: CACGTTAACAATATTGCAGCA ，
对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.9: TAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTG。
本发明各基因的探针标记不限于列出的同一波长的单个标记，包括不同标记的不同组合形式的多重检测试剂。
在一个实施例中，所述试剂盒还包括内标质控及扩增引物和检测探针；
内标质控含有序列如SEQ ID NO.13所示的目的基因片段；
内标质控扩增引物序列分别为SEQ ID NO.10: CTAACACTGGCTCGTGTG和SEQ ID NO.11:TGGGATGGGGAGTCTGT，
对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.12： AGGCTGGTGTAAAGCGGCCTT。
SEQ ID NO.13所示的目的基因片段序列如下：
CTAACACTGGCTCGTGTGACAAGGCCATGAGGCTGGTGTAAAGCGGCCTTGGAGTGTGTATTAAGTAGGCGCACAGTAGGTCTGAACAGACTCCCCATCCCA。
选择目的基因片段作为内标既可监测样本采集，也可监测样本提取过程，防止样本核酸提取失败导致假阴性。
在其中一个实施例中，所述试剂盒包括含N/ORF1ab/E基因片段MS2假病毒的阳性对照和灭菌生理盐水的阴性对照。
本发明中新型冠状病毒2019-nCoV的基因序列参见GISAID：BetaCov/Wuhan/WH01/2019| EPI_ISL_406798；关于其N、ORF1ab和E基因的寡核苷酸序列信息可参考文献（Roujian Lu, Xiang Zhao, Juan Li,et.al, Genomic characterisation andepidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins andreceptor binding. Lancet. 2020 Jan 30）。
在其中一个实施例中，所述试剂盒包括含有N/ORF1ab/E基因和内标引物、探针、dNTPs及PCR缓冲液的PCR反应液和含有热启动Hot.Taq酶、逆转录酶M-MMLV和RNA酶抑制剂的PCR酶系，其中引物和探针的浓度为0.1-1μM，dNTPs浓度为0.2-0.4mM，MgCl2浓度为2-5mM，热启动Hot.taq为2.5-10U，逆转录酶M-MMLV为40-100U和RNA酶抑制剂为8-20U。
一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（粤穗械备20150348号），得到核酸样本（阳性质控和阴性质控同步参与提取）；取5μL加入到上述PCR反应液（17μL）和酶系混合物(3μL)中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择FAM、VIC/HEX、Texas red和Cy5,PCR扩增程序如下；
50℃，15min，95℃，15min；1个循环
94℃，15sec，55℃，45sec（搜集荧光）；45个循环。
PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体DNA的阴、阳性，检测结果可用于新型冠状病毒2019-nCoV感染的辅助诊断，为病毒鉴定和防控提供可靠的依据。
本试剂盒组成详见表1和表2，可同时检测新型冠状病毒2019-nCoV的3个靶标基因，可通过不同靶标之间相互验证，防止出现假阳性，对可能因突变而引起的漏检进行确认，显著提高了病毒鉴定的准确性。
表1 试剂盒组成
Figure 521664DEST_PATH_IMAGE002
试剂盒所需引物、探针序列如表2：
表2 引物、探针及序列号
引物探针名称 引物/探针序列 SEQ ID NO.
N-F1 AAGAAATTCAACTCCAGGCAGC 1
N-R1 GCTGGTTCAATCTGTCAAGCAG 2
N-P 5’FAM- TCACCGCCATTGCCAGCCA- BHQ1 3
ORF1ab-F1 TTATCACCCGCGAAGAAG 4
ORF1ab-R1 TCTAGTAGCATGACACCCCT 5
ORF1ab-P 5’HEX- ACGTGCATGGATTGGCTTCGATGT BHQ1-3’ 6
E-F1 CTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTT 7
E-R1 CACGTTAACAATATTGCAGCA 8
E-P 5’Texas red- TAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTG -BHQ2-3’ 9
内标-F1 CTAACACTGGCTCGTGTG 10
内标-R1 TGGGATGGGGAGTCTGT 11
内标-P 5’Cy5- AGGCTGGTGTAAAGCGGCCTT- BHQ2-3’ 12
优选地，所述荧光基团选自下组：FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5。
优选地，所述淬灭基因选自下组：MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3。
本发明的引物设计中，对特异性引物及探针经大量试验筛选，并对其进行组合、优化、验证，最终优选出组合后不会互相干扰、扩增效率高、特异性好的多重检测最优引探组合。
本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：
每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。
本发明所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
（1）提取检测样本中的总核酸，获得核酸样本。
（2）将所述核酸样本与PCR反应液、PCR酶系混合，制得PCR反应体系。
（3）实时荧光PCR反应，程序如下：
第一阶段：50 ℃ 2-15 min，95 ℃ 10-15 min，1个循环；
第二阶段：94 ℃ 10-15 s，55-60 ℃ 45 s，45个循环。
PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体核酸的阴、阳性给出检测结果。
本发明的有益效果在于：
目前的检测试剂多为单靶标检测试剂，RNA病毒变异速度较快，容易对突变病毒造成漏检，不利于病毒的及时发现与防控。本发明针对新型冠状病毒2019-nCoV3个靶标同时进行检测，可通道不同靶标之间相互验证，防止出现假阳性，对可能因突变而引起的漏检进行确认，显著提高了病毒鉴定的准确性。同时体系中含有内源性内标质控体系，可全程监控取样、样本保存、核酸提取以及PCR扩增整个过程，防止假阴性的出现。
本发明适用于对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的检测，为病毒鉴定和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook. J等著《分子克隆实验室指南》（黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒检测限测试
将以已定值的假病毒做为初始样本分别稀释至浓度为105copies/ml，依次稀释至104、103 、500、250copies/ml，各浓度样本中分别加入终浓度为104 copies/ml的含内标扩增片段的假病毒作为待检样本，测试3重检测试剂的灵敏度。PCR反应体系包含本发明SEQ IDNO.:1-12所示的引物、探针组合。
检测结果参见图1-4：
图1：N基因检测限；
图2：ORF1ab基因检测限测试；
图3：E基因检测限测试；
图4：内标测试结果。
结果表明，对不同浓度的阳性质控品进行检测，可检测出的最低浓度为 500copies/ml。
实施例2 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒特异性测试
以与2019新型冠状病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体（如季节性甲型H1N1流感病毒，新型甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型流感H3N2，H5N1，H7N9，乙型流感Yamagata，乙型流感Victoria，呼吸道合胞病毒A型，呼吸道合胞病毒B型，副流感病毒，腺病毒，肠道病毒，人间质肺病毒（人偏肺病毒），EB病毒，麻疹病毒，人巨细胞病毒，轮状病毒，诺如病毒，腮腺炎病毒，水痘—带状疱疹病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体，军团菌，百日咳杆菌，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，肺炎克雷伯杆菌，结核分枝杆菌，烟曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隐球菌，冠状病毒（HKU1，OC43，NL63，229E）以及人基因组DNA为特异性参考品，测试新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒的特异性。
检测结果参见图5-6：
图5.特异性测试结果；
图6.特异性检测内标测试结果；
对特异性参考品进行检测，检测结果均为阴性，内标质控均为阳性。表明本发明的试剂盒具有优异的特异性。
实施例3、新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒精密度测试
分别将N/ORF1ab/E基因假病毒稀释至105和103copies/ml作为精密度参考品，各重复10次，计算各浓度精密度参考品的变异系数。
检测结果参见图7-9：
图7. N基因精密度检测结果；
图8. ORF1ab基因精密度检测结果；
图9.E基因精密度检测结果；
经测试，新型冠状病毒2019-nCoV高浓度和低浓度精密度参考品的变异系数，N基因为1.16%和1.54%，ORF1ab基因为1.16%和1.54% E基因为1.16%和1.54%；三个检测靶标不同浓度的精密度参考品的变异系数均小于5%。
实施例4、新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒干扰物质测试
分别向103copies/ml的假病毒培养物中加入呼吸道病原体治疗药物，如苯福林、羟甲唑啉、氯化钠、倍氯美松、地塞米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、盐酸组胺、干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、洛匹那韦、莫匹罗星、左氟沙星、阿奇霉素、妥布霉素、利托那韦、美罗培南、头孢曲松、利托那韦、妥布霉素、美罗培南和阿比多尔作为干扰物质测试样本，以不含干扰物质的样本作为对照，测试干扰物质对引物探针扩增的影响。
检测结果参见图10-15：
图10. N基因干扰性检测结果；
图11. ORF1ab基因干扰性检测结果；
图12.E基因干扰性检测结果；
结果表明，在待测样本中加入苯福林、羟甲唑啉、氯化钠、倍氯美松、地塞米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、盐酸组胺、干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、洛匹那韦、莫匹罗星、左氟沙星、阿奇霉素、妥布霉素、利托那韦、美罗培南、头孢曲松、利托那韦、妥布霉素、美罗培南和阿比多尔的样本对检测结果无明显干扰，不影响结果判读。
实施例5、临床样本检测
检测样本核酸的提取：
（1）临床待测样本核酸模板提取
采集22例疑似咽拭子临床样本，使用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂（粤穗械备20150348号），得到核酸样本（阳性质控和阴性质控同步参与提取）；取5μL加入到上述PCR反应液（17μL）和酶系混合物(3μL)中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择FAM、VIC/HEX、Texas red和Cy5,PCR扩增程序如下；
50℃，15min，95℃，15min；1个循环
94℃，15sec，55℃，45sec（搜集荧光）；45个循环。
PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体DNA的阴、阳性。
在所检测的22例疑似临床样本中，共检出17例新型冠状病毒2019-nCoV核酸阳性临床样本。典型检测结果如图13所示。
测序验证结果表明本发明检测体系检测准确率达到了100%，进一步证明了本发明体系检测的临床检测准确性。
对比例1
本发明人在研究过程中，针对新型冠状病毒2019-nCoV目标核酸序列筛选了数十组PCR引物和探针，经过大量测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，且能够进行多重检测的引物、探针组合。
针对新型冠状病毒2019-nCoV的N、ORF1ab和E基因检测靶标，本发明人经过了大量的筛选、组合。例如针对ORF1ab基因，设计的部分典型引物序列如下：
ORF1ab基因对照上游引物ORF1ab-F2：ATCAAGTTAATGGTTACCCTAACATG（SEQ ID NO.14）
ORF1ab基因对照下游引物ORF1ab-R2：CAACAGCTTCTCTAGTAGCATGACA（SEQ ID NO.15）
ORF1ab基因对照上游引物ORF1ab-F3：TGGGTTTTAAAATGAATTATCAAGTT（SEQ ID NO.16）
ORF1ab基因对照下游引物ORF1ab-R3：AACCTAGCTGTAAAGGTAAATTGG（SEQ ID NO.17）
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，进行PCR检测测试。
使用ORF1ab-F2和ORF1ab-R2的检测结果如图14所示，检测结果表明该引物对特异性较差。使用ORF1ab-F3和ORF1ab-R3的检测结果表明该引物对在单一检测体系中对ORF1ab基因靶核酸的特异性和灵敏度较佳，但是在多重检测体系中ORF1ab基因靶低浓度核酸扩增收到明显抑制，单重和多重体系检测结果如图15所示。表明对照引物对ORF1ab-F3和ORF1ab-R3无法应用于多重检测体系中。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒
<130> 000056
<150> CN202010078427.9
<151> 2020-02-05
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
aagaaattca actccaggca gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gctggttcaa tctgtcaagc ag 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tcaccgccat tgccagcca 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
ttatcacccg cgaagaag 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
tctagtagca tgacacccct 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
acgtgcatgg attggcttcg atgt 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
ctttcgtggt attcttgcta gtt 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
cacgttaaca atattgcagc a 21
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
tagccatcct tactgcgctt cgattg 26
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
ctaacactgg ctcgtgtg 18
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
tgggatgggg agtctgt 17
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
aggctggtgt aaagcggcct t 21
<210> 13
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
ctaacactgg ctcgtgtgac aaggccatga ggctggtgta aagcggcctt ggagtgtgta 60
ttaagtaggc gcacagtagg tctgaacaga ctccccatcc ca 102
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
atcaagttaa tggttaccct aacatg 26
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
caacagcttc tctagtagca tgaca 25
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
tgggttttaa aatgaattat caagtt 26
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
aacctagctg taaaggtaaa ttgg 24

Claims (10)

1.一种用于多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：
第一引物对组，所述第一引物对组包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：
第二引物对组，所述第二引物对组包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
3.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：
第三引物对组，所述第三引物对组包括：
如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物。
4.一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的探针组，其特征在于，所述探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第三探针；和
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的内控探针。
5.一种用于多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集；和
权利要求4所述的探针组。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1-9所示的多核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含PCR酶系，所述PCR酶系包括热启动酶、和逆转录酶M-MMLV。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性质控品；和/或
所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性质控品。
9.一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
（1）提供待检测对象的核酸样本；
（2）制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、权利要求1所述的引物对集、和权利要求4所述的探针组。
10.权利要求1所述的引物对集、和/或权利要求4所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸。
CN202010278551.XA 2020-02-05 2020-04-10 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒 Active CN111235320B (zh)

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