CN112111601A - 一种新型冠状病毒双重快速rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒双重快速rt-pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明开了一种新型冠状病毒双重快速RT‑PCR检测试剂盒，包括正反向引物对集和荧光探针组，所述正反向引物对集包括第一引物对、第二引物对和内参质控引物对，还包括阳性标准品、内参质控品、阴性标准品和RT‑Taq mix试剂。本发明可以实现快速检测的目的，缩短检测时间；本发明还可以实现对新型冠状病毒COVID‑19的高灵敏度的检测，能稳定检测出低至100copies/mL的核酸样本；此外，本发明可以降低出现非特异性扩增及假阳性结果的几率，提高检测结果可靠性。

Description

一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒COVID-19属于β属冠状病毒，可引发新型冠状病毒肺炎疫情。目前国际疫情局势仍然十分严峻。
新型冠状病毒感染的一般症状有：发热、乏力、干咳，逐渐出现呼吸困难，部分患者起病症状轻微，甚至可无明显发热。严重症状有：急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍。除上述症状，还有可能具有如下不典型症状：如轻度纳差、乏力、恶心呕吐、腹泻、头痛等。从目前的收治的病例情况看，多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至与其它基础性疾病并发导致死亡。因此及时、准确检测该新型冠状病毒十分重要。
实时荧光RT-PCR是冠状病毒核酸检测常用方法之一，可用于实验室检查、流行病学研究、排除诊断等。该方法灵敏度高、特异性好，可以准确快速提供目标病毒的检测结果。目前，对新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光RT-PCR鉴定，主要针对新型冠状病毒基因组开放读码框1a/b(ORF1ab)、核壳蛋白基因(N)和小包膜糖蛋白基因(E)。但是，目前已有的基于RT-PCR方法的检测试剂盒存在检测速度慢，特异性及灵敏度不高的问题。
因此，仍有必要开发基于新方法的检测试剂盒，提供一种检测灵敏度高、特异性好的方案。
发明内容
本发明提供了一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒，包括正反向引物对集和荧光探针组，所述正反向引物对集包括第一引物对、第二引物对和内参质控引物对，
所述第一引物对包括：
如SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物；
所述第二引物对包括：
如SEQ ID No.3所示的正向引物和SEQ ID No.4所示的反向引物；
所述内参质控引物对包括：
如SEQ ID No.5所示的正向引物和SEQ ID No.6所示的反向引物；
所述荧光探针组包括
如SEQ ID No.7所示的第一探针，如SEQ ID No.8所示的第二探针和SEQ ID No.9所示的内参质控探针。
上述序列具体组成如下
SEQ ID NO.1：5’-GACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGC-3’
SEQ ID NO.2：5’-CTTCCATGCCAATGCGCGACATTC-3’
SEQ ID NO.3：
5’-CGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCG-3’
SEQ ID NO.4：5’-CACGTTAACAATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’
SEQ ID NO.5：5’-TGACGGTGCGTAACTCGATCGGTCAC-3’
SEQ ID NO.6：5’-GGACAGGCCTCGGAACCAAGTGCAT-3’
SEQ ID NO.7：5’-FAM-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-MGB-3’
SEQ ID NO.8：
5’-CY3-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-MGB-3’
SEQ ID NO.9：5’-CY5-TGCGCGAAAGATCCCAGCGCT-MGB-3’。
本发明提供的第一引物对及第一探针和第二引物对及第二探针根据新型冠状病毒COVID-19保守且特异于其它已发现冠状病毒的两个基因片段(N基因片段和E基因片段)进行特异性设计而成，第一引物对及第一探针可特异性检测新型冠状病毒COVID-19的N基因片段，第二引物对及第二探针可特异性检测新型冠状病毒COVID-19的E基因片段；该两组引物探针组合与其他呼吸道病毒无交叉反应，仅能检测新型冠状病毒COVID-19，且能够将低至100copies/mL浓度的阳性样本检测出；采用第一核酸组合或第二核酸组合，或者是两种的组合均可以实现对新型冠状病毒COVID-19的高灵敏度和高特异性的检测。
内参质控引物对、内参质控探针组合作为内参对照，使用该组合同时检测，有利于提高对检测结果判读的准确性，且内参质控引物探针组合与第一引物探针组合和第二引物探针组合相互间没有干扰，不会产生非特异性扩增，能够确保检测结果的可靠性。
作为优选，所述荧光探针组的所有探针均含有5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团，所述荧光探针组中第一探针5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为MGB；所述荧光探针组中第二探针5’端荧光报告基团为CY3，3’端荧光淬灭基团为MGB；所述荧光探针组中内参质控探针5’端荧光报告基团为CY5，3’端荧光淬灭基团为MGB，所述荧光报告基团可选自FAM、HEX、ROX、JOE、CY3、VIC、TET、TAXAS RED、NED、ALEXA、TAMRA、CY5.5和CY5中的一种。
通过长片段正反向引物对和MGB荧光淬灭基团设计提高了荧光探针Tm值，使得RT-PCR扩增反应程序可以兼容更高的退火/延伸温度，缩小了退火/延伸温度与变性温度之间的温度差，缩短了升温、降温所需时间，从而有效缩短了RT-PCR扩增反应时间。同时，高温退火进一步消除了非特异性扩增，提高了检测特异性。
作为优选，还包括阳性标准品：包含新型冠状病毒N基因(SEQ ID NO.10)和E基因(SEQ ID NO.11)序列片段的质粒；内参质控品：包含内参基因序列片段的假病毒溶液；阴性标准品：RNase free H2O；RT-Taq mix试剂。
作为优选，所述阳性标准品质粒包括标准品1：浓度为1*102copies/mL；标准品2：浓度为1*103copies/mL；标准品3：浓度为1*104copies/mL；标准品4：浓度为1*105copies/mL；标准品5：浓度为1*106copies/mL。
一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测方法，使用上述新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒，包括以下步骤：
(1)以样本RNA为模板，加入RNase free H2O，RT-Taq mix试剂，正反向引物对集和荧光探针组，配制扩增反应体系；
(2)设置反应条件进行RT-PCR反应得到扩增曲线，对扩增曲线进行结果分析。
作为优选，所述样本RNA模板来自对环境样本的核酸提取，在提取之前，环境样本中需要提前加入内参质控品；所述扩增反应体系包括：样本模板、正反向引物对集和荧光探针组、RT-Taq mix试剂。
作为优选，对每一个样本每次检测时同时扩增三个重复孔，另以阴性标准品代替扩增反应体系(1)中的样本RNA模板，加入RNase free H2O，RT-Taq mix试剂，正反向引物对集和荧光探针组，配制扩增反应体系，作为阴性对照孔。
作为优选，所述步骤(2)最适扩增程序为：50℃7.5min；95℃5min；随后95℃30s；72℃30s，循环40次。
作为优选，所述扩增程序中68-72℃为本试剂盒推荐退火/延伸温度，本试剂盒可适用退火/延伸温度范围为60-72℃。
作为优选，对扩增曲线进行分析判断原则为：当同一个样本的三个重复孔中有两个以上FAM和CY3荧光通道中Ct<40时，判断样本为新型冠状病毒COVID-19阳性；当只有1个FAM和CY3荧光通道中Ct<40时，对该样本重复一次实验，若三个重复孔中有两个以上FAM和CY3荧光通道中Ct<40时，判断样本为新型冠状病毒检测阳性；否则就判断样品为新型冠状病毒阴性。除满足上述条件外，所有环境样本孔必须还必须满足CY5通道Ct<40，阴性对照孔无扩增曲线，本次实验才被判定有效；当CY5荧光通道中无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取样本RNA和重新扩增。
因此，本发明具有如下有益效果：本发明可以实现对新型冠状病毒COVID-19的高灵敏度和高特异性的检测；操作简单，可以实现快速检测的目的，缩短检测时间；而且可以降低出现非特异性扩增及假阳性结果的几率，提高检测灵敏度。
附图说明
图1是COVID-19N基因扩增曲线图。
图2是COVID-19E基因扩增效果图。
图3是采用本发明试剂盒最适扩增程序扩增的时间-温度变化曲线图。
图4是采用普通RT-PCR扩增程序扩增的时间-温度变化曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
试剂盒中具体的核酸检测与结果判读方法，如下：
本实施例提供的检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物包括：
第一引物对和第一探针组合，其包括：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对，以及SEQ ID NO.7所示的第一探针；其中，第一探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
第二引物对和第二探针组合，其包括：
如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第二引物对，以及如SEQ ID NO.8所示的第二探针；第二探针的5’端标记有荧光报告基团CY3，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
内参质控引物对和内参质控探针组合，其包括：
如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的内参质控引物对，以及如SEQ ID NO.9所示的内参质控探针；内参质控探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
上述序列具体组成如下：
SEQ ID NO.1：5’-GACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGC-3’
SEQ ID NO.2：5’-CTTCCATGCCAATGCGCGACATTC-3’
SEQ ID NO.3：
5’-CGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCG-3’
SEQ ID NO.4：5’-CACGTTAACAATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’
SEQ ID NO.5：5’-TGACGGTGCGTAACTCGATCGGTCAC-3’
SEQ ID NO.6：5’-GGACAGGCCTCGGAACCAAGTGCAT-3’
SEQ ID NO.7：5’-FAM-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-MGB-3’
SEQ ID NO.8：
5’-CY3-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-MGB-3’
SEQ ID NO.9：5’-CY5-TGCGCGAAAGATCCCAGCGCT-MGB-3’
本实施例还提供采用上述核酸组合物检测新型冠状病毒COVID-19的方法，该方法包括：
(1)RT-PCR扩增：
取50μL待检测核酸样本与RT-Taq mix试剂及上述三组核酸组合物混合，另取阴性标准品与RT-Taq mix试剂及上述三组核酸组合物混合，混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，每个待检测核酸样本及阴性对照每次扩增三个重复孔，PCR程序如下：
50℃7.5min；95℃5min；随后95℃5s，72℃30s，循环40次。
其中，上述待检测核酸样本可以通过市售病毒核酸提取试剂盒进行提取，详细提取方法及样本用量参照市售病毒核酸提取试剂盒说明书。需注意的是，在提取前，需在待测样本中加入与提取所需待测样本等量的内参质控品。
其中，待测样本可以是咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽分泌物、肺泡灌洗液、痰液、血清和血浆中的任一种；
(2)结果判读：
按下表判读方法，根据Ct值进行判读：
Figure BDA0002560107030000081
Figure BDA0002560107030000091
实施例2
验证实施例1的核酸组合物的灵敏度，验证方法如下：
将不同浓度含有N基因片段(SEQ ID NO.10)和E基因片段(SEQ ID NO.11)的阳性质粒模板混合后进行核酸提取，在其他的实施例中，阳性质粒模板可不用经提取处理即可进行RT-PCR扩增检测，本实施例中对其进行提取，主要是为了模拟外源样本经过提取后用本发明的试剂盒进行检测的灵敏度。取50μL核酸提取物与实施例1所述RT-Taq mix试剂及核酸组合物混合，另取阴性标准品与RT-Taq mix试剂及核酸组合物混合，混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，每个核酸提取样本及阴性对照每次扩增3个重复孔，PCR扩增程序如下：
50℃7.5min；95℃5min；随后95℃5s；72℃30s，循环40次。
N基因片段序列如下(SEQ ID NO.10)：
5’-AAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAA-3’
E基因片段序列如下(SEQ ID NO.11)：
5’-ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAA-3’
扩增结果如图1和图2所示，图1和图2中的数字是基线的数值，从图1、图2中可以看出：采用实施例1的核酸组合物，对两个基因片段均能稳定检测出低至100copies/mL的模板，而目前已知的同类产品的灵敏度多数为200～1000copies/mL；可见，本发明实施例的核酸组合物的检测灵敏度较高。
实验例3
验证实施例1的核酸组合物的检测速度，验证方法如下：
将不同浓度含有N基因片段(SEQ ID NO.10)和E基因片段(SEQ ID NO.11)的阳性质粒模板分别与含内参质控基因的假病毒溶液混合后进行核酸提取，取50μL核酸提取物与实施例1所述RT-Taq mix试剂及核酸组合物混合，另取阴性标准品与RT-Taq mix试剂及核酸组合物混合，混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，每个核酸提取样本及阴性对照每次扩增3个重复孔，反应程序设置为本试剂盒最适扩增程序：
50℃7.5min；95℃5min；随后95℃5s；72℃30s，循环40次。
同时，另将不同浓度含有N基因片段(SEQ ID NO.10)和E基因片段(SEQ ID NO.11)的阳性质粒模板分别与含内参质控基因的假病毒溶液混合后进行核酸提取，取50μL核酸提取物与实施例1所述RT-Taq mix试剂及核酸组合物混匀后放到荧光定量PCR仪上进行扩增检测，每个核酸提取样本扩增3个重复孔，反应程序设置为普通RT-PCR扩增程序：
50℃7.5min；95℃5min；随后95℃5s；60℃30s，循环40次。
扩增时间结果分别如图3，图4所示，从图3、图4中可以看出：采用实施例1的核酸组合物及其最适的RT-PCR扩增程序，其扩增用时明显短于采用普通RT-PCR扩增程序；可见，本发明实施例1的核酸组合物在保持较高的灵敏度与特异性的同时，还提高了PCR扩增反应的速度，具有明显的扩增优势。
上述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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Claims (6)

1.一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒，其特征是，包括正反向引物对集和荧光探针组，所述正反向引物对集包括第一引物对、第二引物对和内参质控引物对，
所述第一引物对包括如SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物；
所述第二引物对包括如SEQ ID No.3所示的正向引物和SEQ ID No.4所示的反向引物；
所述内参质控引物对包括如SEQ ID No.5所示的正向引物和SEQ ID No.6所示的反向引物；
所述荧光探针组包括如SEQ ID No.7所示的第一探针，如SEQ ID No.8所示的第二探针和SEQ ID No.9所示的内参质控探针；
SEQ ID NO.1：5’-GACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGC-3’
SEQ ID NO.2：5’-CTTCCATGCCAATGCGCGACATTC-3’
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5’-CGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCG-3’
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SEQ ID NO.7：5’-FAM-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-MGB3’
SEQ ID NO.8：5’-CY3-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-MGB-3’
SEQ ID NO.9：5’-CY5-TGCGCGAAAGATCCCAGCGCT-MGB-3’。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒，其特征是，所述荧光探针组的所有探针均含有5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团，所述荧光探针组中第一探针5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为MGB；所述荧光探针组中第二探针5’端荧光报告基团为CY3，3’端荧光淬灭基团为MGB；所述荧光探针组中内参质控探针5’端荧光报告基团为CY5，3’端荧光淬灭基团为MGB，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、JOE、CY3、VIC、TET、TAXAS RED、NED、ALEXA、TAMRA、CY5.5和CY5中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒，其特征是，还包括阳性标准品：包含新型冠状病毒N基因即SEQ ID NO.10，和E基因即SEQ ID NO.11序列片段的质粒；内参质控品：包含内参基因序列片段的假病毒溶液；阴性标准品：RNase freeH2O；RT-Taq mix试剂。
4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒，其特征是，所包含的正反向引物对集和荧光探针组所用扩增反应程序推荐的退火/延伸温度为68-72℃；所包含的正反向引物对集和荧光探针组适用于退火/延伸温度60-72℃的RT-PCR反应条件。
5.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒，其特征是，所述阳性标准品质粒包括标准品1：浓度为1*102copies/mL；标准品2：浓度为1*103copies/mL；标准品3：浓度为1*104copies/mL；标准品4：浓度为1*105copies/mL；标准品5：浓度为1*106copies/mL。
6.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒双重快速RT-PCR检测试剂盒，其特征是，所述RT-Taq mix试剂含有PCR缓冲物质、阳离子、脱氧核糖核苷酸中的至少一种，还包含DNA聚合酶、逆转录酶和UNG酶中的至少两种；所述RT-Taq mix试剂由上述成分与冻干保护剂混合后经冻干制得，冻干保护剂选自甘露醇、葡聚糖、海藻糖、明胶和蔗糖中的至少一种。
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