CN111334608B - 用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了新型冠状病毒(2019‑nCoV)双重荧光冻干微芯片、试剂盒及方法，所述试剂盒包括一个冻干微芯片、一管矿物油、一管阳性对照、一管阴性对照、一管稀释液及一管无核酸酶水，所述冻干微芯片包被有引物、探针、Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris‑Cl、dNTP、Mg2+。冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到‑55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至‑25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h，得到冻干微芯片，使用时加入稀释液和样本核酸即可。本发明同时检测ORF 1a/b基因和N基因，所述检测试剂盒检测方法准确性、特异性和敏感性高，检测时间短。

Description

用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片、试 剂盒及方法
技术领域
本发明涉及病毒的分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于检测新型冠状病毒 2019-nCoV双重荧光冻干微芯片、试剂盒及方法。
背景技术
近日全球爆发了一次极为严重的新型冠状病毒感染事件，致病病毒为新型冠状病毒，即“2019-nCoV”，2020年1月12日被世界卫生组织命名。新型冠状病毒2019-nCOV为线性单链RNA(ssRNA)病毒，基因组全长约29903个核苷酸，共包含10个基因。新型冠状病毒传播途径主要有三个：通过咳嗽或打喷嚏在空气传播；与病人的密切接触；触摸被污染的物体表面，然后用脏手触碰嘴巴、鼻子或眼睛。其感染人群覆盖从婴儿到80岁以上的老人。此外，其传染力远在非典病毒之上。非典病毒当年在全球范围内总共感染的人数也不过只有8000多人，而总共的流行的时长却超过了一年。而新型冠状病毒在仅仅一周的时间，却已经有超过八百名感染者，如果这种病毒能够持续一年，那么后果何其严重不敢想象。即从传染力来说新型冠状病毒是非典病毒的百倍都不为过。如果疾病的严重性定义为传染性和致死率的乘积，很明显新型冠状病毒在传染性的优势不是非典病毒在致死率上的优势能够比拟的。另外，基于目前的研究，由新型冠状病毒引起的肺炎，其潜伏期一般为3到7天，最短的潜伏期为 1天，最长的潜伏期为14天，潜伏期具有传染性。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。此疾病带来严重的威害，因此，早发现，早确诊对疾病的控制和治疗都是很有必要的。
目前，对新型冠状病毒的核酸检测方法有高通量测序法，一代测序法，荧光PCR法。高通量测序方法由于需要建库过程，加上上机时间长，耗时过长。一代测序法，需要以普通PCR 为基础，普通PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于其特异性、敏感性高，能在短时间内通过基因扩增得到大量的目的片段，克服了传统的病毒检测技术包括病毒分离鉴定试验周期长的缺点，为新型冠状病毒的早期快速检测提供了敏感、快速、实用的检测方法，但普通PCR仍存在操作繁琐、检测时间长且易污染等弊端。
发明内容
基于本领域的上述需求，本发明的目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV 的双重荧光冻干微芯片、试剂盒及方法，在有效地对新型冠状病毒进行检测，确保准确性、特异性和敏感性高，重复性好的同时，能在短时间内完成检测获得结果，并且可常温运输和保存。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片，其特征在于，用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；所述荧光PCR 反应体系包括下述引物和探针：
ORF1a/b基因上游引物：5＇-ATGTACGTGCATGGATTGGC-3＇，
ORF1a/b基因下游引物：5＇-GGTGTATCAACATAACCTGTAGGTAC-3＇，
ORF1a/b基因Taqman探针：5＇-CCAATTTACCTTTACAGCTAG-3＇；
N基因上游引物：5＇-TCTCCTGCTAGAATGGCTGG-3＇，
N基因下游引物：5＇-TCAAGCAGCAGCAAAGCAAG-3＇，
N基因Taqman探针：5＇-AATGGCGGTGATGCT-3＇。
所述荧光PCR反应体系还包括：Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、dNTP、Mg2+；
优先地，所述ORF1a/b基因和N基因的Taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。所述ORF1a/b基因的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为FAM；所述N基因的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为ROX；所述ORF1a/b基因和N基因的Taqman探针的3`端标记的荧光淬灭基团均为MGB。
所述荧光PCR反应体系包括：上游引物0.8μM；下游引物0.8μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.4mM；Mg2+4mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 6mM，其余为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL。
所述微芯片上设置有若干个加样孔；所述荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述加样孔内；
优选地，所述微芯片上的加样孔为30个；所述微芯片的底部结构、形状、大小与PCR仪的加样板相适配。
所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光PCR反应体系的微芯片置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干；
优选地，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。
用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，包括所述的所有冻干微芯片特征。
所述试剂盒，还包括：稀释液，将10×稀释液使用无核酸酶水稀释成2×稀释液，用于滴入冻干微芯片的加样孔中，再将冻干微芯片置于荧光PCR仪上进行荧光PCR扩增。
所述的试剂盒，还包括：矿物油，用于封闭所述冻干微芯片上的加样孔；
阳性对照，具体为带有ORF 1a/b基因目的片段和N基因目的片段的阳性质粒；
阴性对照，具体为无核酸酶水。
用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，其特征在于，采用具有所述特征的冻干微芯片，以及具有所述特征的试剂盒对待测样品进行荧光PCR扩增。
在冻干微芯片的加样孔中加入待测样品及稀释液后，将冻干微芯片置于荧光PCR仪上进行所述荧光PCR扩增；
优选地，所述稀释液为10×buffer；
进一步优选地，所述荧光PCR扩增的反应程序为：45℃5min；95℃1min；以95℃5s，60℃15s为1个循环，进行40个循环，每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
此设计方案有关的试剂盒特征如下：
1.组分：本发明提供一种荧光RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括一个冻干微芯片、一管矿物油、一管阳性对照、一管阴性对照、一管稀释液及一管无核酸酶水。所述冻干微芯片包含引物、探针、Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、dNTP、Mg2+。
2.引物及探针：所述试剂盒中的冻干微芯片包被具有如下核苷酸序列的引物和Taqman 探针：
ORF1a/b基因上游引物：5＇-ATGTACGTGCATGGATTGGC-3＇，
ORF1a/b基因下游引物：5＇-GGTGTATCAACATAACCTGTAGGTAC-3＇，
ORF1a/b基因Taqman探针：5＇FAM-CCAATTTACCTTTACAGCTAG-MGB-3＇；
N基因上游引物：5＇-TCTCCTGCTAGAATGGCTGG-3＇，
N基因下游引物：5＇-TCAAGCAGCAGCAAAGCAAG-3＇，
N基因Taqman探针：5＇ROX-AATGGCGGTGATGCT-MGB-3＇。
作为进一步地改进，所述Taqman探针的3＇端标记MGB荧光淬灭基团。所述ORF1a/b基因Taqman探针的5＇端标记FAM荧光报告基团；N基因Taqman探针的5＇端标记ROX 荧光报告基团。
3.反应体系：
所述荧光PCR的冻干体系各组分的终浓度为：上游引物0.8μM；下游引物0.8μM；Taqman 探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.4mM；Mg2+4mM；海藻糖5μM； Tris-Cl 6mM；余量为灭菌去离子水；
优选地，所述荧光定量PCR的冻干体系的总体积为36μL，每孔体积为1.2μL；
所述荧光定量PCR的AriaYSB冻干微芯片的上样孔为30个，将上述荧光PCR反应体系 (包含ORF 1a/b基因和N基因2套引物探针)，每个微芯片孔加入1.2μL。
4.冻干技术：
所述荧光定量PCR的冻干微芯片先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。
5.反应条件：
新型冠状病毒(2019-nCoV)冻干微芯片荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述冻干微芯片荧光RT-PCR反应条件为：45℃5min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步，40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
6.其他方面：
所述常规试剂包括矿物油、稀释液、无核酸酶水在内的商品化分子试剂。
所述商品化稀释液为10×buffer(不含Mg2+)，使用无核酸酶水稀释为2×buffer。
所述冻干微芯片荧光定量PCR的1.2μl反应体系包括：荧光PCR冻干试剂孔、稀释液0.6μl；检测样品RNA 0.6μl。
所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为含有ORF1a/b基因目的片段和N基因目的片段的阳性质粒。
所述新型冠状病毒(2019-nCoV)冻干微芯片荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，采用所述的引物探针和所述的试剂盒对待测样品进行检测。
所述检测指冻干微芯片荧光PCR检测；所述上游引物0.8μM；下游引物0.8μM；Taqman 探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.4mM；Mg2+4mM；海藻糖5μM； Tris-Cl 6mM；余量为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL。
所述冻干微芯片荧光RT-PCR的反应条件包括：45℃5min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明根据已公布的ORF1a/b基因和N基因设计并合成特异性引物及Taqman-MGB 探针，采用荧光定量PCR方法可同时快速灵敏地检测ORF1a/b基因和N基因。多个靶位点，双重荧光PCR检测，提高准确性和可靠性，防止漏检。
(2)本发明一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用Taqman-MGB探针荧光PCR检测法，使得灵敏度约是普通PCR的100倍。
(3)由于采用荧光检测技术——Taqman-MGB荧光PCR(Real-time PCR)，该方法(Real-time PCR)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统PCR方法只能终点检测的局限。
(4)冻干微芯片技术相对于目前使用的荧光PCR检测技术，反应体系更小，仅1.2μL，常规市售产品的反应体系为20-25μL，所以微芯片技术可以节省RT-PCR扩增试剂以及样品的用量。
(5)冻干微芯片较小的反应体系可以保证在PCR扩增过程中体系受热更加均匀，升降温速率更快。升温速率(10-12℃/S)相比目前采用的荧光PCR检测系统的升降温速率(3-5℃/S) 快。荧光PCR整个过程(包括加样)可在30分钟内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作。扩增产物载体芯片使用完后，无需特殊处理，避免了生成的产物气溶胶进而造成的实验室污染和检测假阳性。既方便了操作又减少了污染。
(6)冻干微芯片可进行常温保存和运输，避免试剂反复冻融，检测结果更稳定。
本发明采用的实时荧光PCR技术(Real-time PCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。
本发明采用的微芯片是由硅胶或者铝盘形成的带有由保护膜覆盖的微反应器(微反应器的体积和质量取决于微芯片的类型)的反应区域。微芯片的反应区有一层矿物油覆盖。试剂穿过一层矿物油通过手动或者自动的带枪头的移液器注入至微反应器上，可避免检测样本的交叉污染和反应体系蒸发。
本发明将PCR反应试剂冻干在微芯片上，结合Taqman探针荧光定量PCR技术，核酸的分析是微芯片在热循环的同时读取由PCR产物产生的荧光信号。本发明采用的微芯片技术，不同于目前常用的塑料PCR管作为载体的PCR扩增，而是采用金属载体的微芯片，反应体系及样本直接加到金属载体上进行PCR扩增。金属载体热传导效率和升降温速率更快，可大幅度缩短反应程序时间。具有反应体系小、自动化程度高、反应时间短、特异性强、敏感性高、重复性强、反应试剂不需低温保存、可进行定量检测及微芯片操作污染可能性小等特点。本发明产品可在反应条件一致的情况下快速鉴定并可区分新型冠状病毒ORF 1a/b基因和N基因，操作简单，从样本处理到结果分析可在1个小时内完成，即，临床诊断1个小时出结果，而分子检测部分的时间缩短至30分钟。
综上，由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针，并优化微芯片冻干条件，发展了能够快速、有效地检测ORF1a/b基因和N基因的微芯片荧光PCR的反应体系，同时制备了基于该方法的检测试剂盒。本发明通过大量实验验证，本发明的引物探针/试剂盒/检测方法比常规方法准确性更高、特异性优良，同时最低检出限可达250copies/mL，说明敏感性较高，同时ORF1ab基因的批内变异系数在0.26％～0.93％之间，批间变异系数在 0.74％～1.35％之间；N基因的批内变异系数在0.26％～0.87％之间，批间变异系数在0.43％～ 1.06％之间，说明重复性良好。本发明相比现有技术最大的创新在于，将可以快速、准确、灵敏度高的检测新型冠状病毒的荧光PCR法与芯片法相结合，将PCR反应体系冻干在微芯片上，在不降低检测效果的情况下，微芯片在反应过程中，升降温速度较快，使得检测时间缩短到30分钟；微芯片技术的加入使得整个试剂盒可以可以常温保存和运输；操作简单，不用配制PCR体系，直接加入稀释液，矿物油和样本即可，大大简化操作、降低污染风险、减少试剂用量、缩短反应时间，可以为新型冠状病毒的防治提供先进、有效的早期快速检测技术和监测手段的同时，也为新型冠状病毒的防治争取到极为宝贵的快速反应时间。
附图说明
图1是冻干微芯片荧光RT-PCR检测ORF 1a/b基因的特异性检测。图中，1：2019-nCoV 病毒；2：HCoV-229E病毒；3：HCoV-OC43病毒；4：HCoV-NL63病毒；5：HCoV-HKU1 病毒；6：SARS-CoV病毒；7：MERS-CoV病毒；8：无核酸酶水。
图2是冻干微芯片荧光RT-PCR检测N基因的特异性检测。图中，1：2019-nCoV病毒；2：HCoV-229E病毒；3：HCoV-OC43病毒；4：HCoV-NL63病毒；5：HCoV-HKU1病毒； 6：SARS-CoV病毒；7：MERS-CoV病毒；8：无核酸酶水。
具体实施方式
为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
第1组实施例：本发明的冻干微芯片
本组实施例提供一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的双重荧光冻干微芯片，其特征在于，用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；
所述荧光PCR反应液包括下述引物和探针：
ORF1a/b基因上游引物：5＇-ATGTACGTGCATGGATTGGC-3＇，
ORF1a/b基因下游引物：5＇-GGTGTATCAACATAACCTGTAGGTAC-3＇，
ORF1a/b基因Taqman探针：5＇-CCAATTTACCTTTACAGCTAG-3＇；
N基因上游引物：5＇-TCTCCTGCTAGAATGGCTGG-3＇，
N基因下游引物：5＇-TCAAGCAGCAGCAAAGCAAG-3＇，
N基因Taqman探针：5＇-AATGGCGGTGATGCT-3＇。
在具体的实施例中，所述荧光PCR反应体系还包括：Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、 dNTP、Mg2+；
优先地，所述ORF1a/b基因和N基因的Taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。
在更具体的实施例中，所述荧光PCR反应体系包括：上游引物0.8μM；下游引物0.8μM； Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.4mM；Mg2+4mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 6mM，其余为灭菌去离子水；
上述为这些成分的终浓度，既是冻干前荧光PCR反应体系的终浓度，也是冻干后，加样 0.6uL并加入0.6μL 2×稀释液后的终浓度。
冻干前配制的荧光PCR反应体系的总体积一般为36μL，每孔体积为1.2μL。
优先地，所述ORF1a/b基因的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为FAM；
所述N基因的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为ROX；
所述ORF 1a/b基因和N基因的Taqman探针3`端标记的荧光淬灭基团为MGB。
在一些实施例中，所述微芯片上设置有若干个加样孔；所述荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述加样孔内；
优选地，所述微芯片上的加样孔为30个；所述微芯片的结构与PCR仪的加样板结构相适配。所述微芯片的结构类似于一块PCR板，但本发明的微芯片是无盖的，需使用矿物油进行加样孔的封闭，在加样时候不容易串孔，不容易污染。因此不会出现PCR体系流动溢出或者串孔污染现象。
在另一些实施例中，所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光PCR反应体系的微芯片置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干；
将装有所述荧光PCR反应体系的微芯片先置于-80℃冷冻1h的目的是预冷冻，使第一步预冻阶段的体系能保持固体状态，并且这一步还可以缩短干燥时间。
设备冻干指的是在专门的冻干设备中通过设定设备的工作条件来进行冻干；优选地，所述冻干设备指真空冷冻干燥机。
优选地，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。
所述隔板温度指冷冻干燥机内的托盘隔板的温度，需要在所述托盘隔板上放置装有所述荧光PCR反应体系的微芯片；预冻阶段这一步的作用是使荧光PCR反应体系能保持固体状态。“对设备抽真空，保持冷冻干燥1h”这一步的主要目的是真空冷冻干燥机，需要把内部空气抽干，使固体中的水分升华，从而达到冻干效果。接下来的两步“将隔板温度升至-25℃保持1h”和“将隔板温度升至37℃并保持2h”均为了保持干燥升华过程；最后“将隔板降至25℃并保持1h”的作用是将冻干成品在25℃并保持稳定，至此，基本完成了整个冻干过程。
上述“设备冻干”过程是本发明针对装有所述荧光PCR反应体系的微芯片独创的一套冻干工艺。由于冻干试剂共晶点不同，需要进行分别测定，而且干燥过程中的升温时间、干燥时间需要进行优化。冻干试剂里面的组分对共晶点的影响，都需要通过调整试剂组分浓度来摸索。特别是反应体系里的酶，在常温长时间放置，酶的活性是会降低，需要加入保护剂和稳定剂组分，例如海藻糖5μM；Tris-Cl 6mM，而且其浓度对PCR反应是否有抑制需要通过实验验证和调整，才能保证冻干微芯片在用来进行荧光PCR检测时，获得本发明记载的优良的高灵敏度、高重复性、高准确性、高特异性等优异效果。另外，还需要同时兼顾冻干工艺冻干后使用稀释液的复溶效果，这也需要经过调整冻干工艺，才能使承载于冻干微芯片的检测方法获得的高灵敏度、高重复性、高准确性、高特异性等优异效果。
本领域技术人员可根据本发明的公开，人工合成所述引物，将它们用来定性或定量检测 ORF1a/b基因和N基因，能获得如本发明所述的预期效果，因此任何基于商业目的合成的引物，并将其放入标有“检测ORF1a/b基因和N基因”用途的商品包装盒内的行为，或采用上述序列的引物用于商业检测ORF1a/b基因和N基因的行为，均落入本发明请求保护的范围。第2组实施例：本发明的试剂盒
本组实施例提供一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的试剂盒，包括第1组实施例任一项所述的冻干微芯片。
所述稀释液具体为PCR 10×buffer，具体成分不含Mg2+，含500mM KCl，100mMTris-HCl， 0.1％明胶，该稀释液可商购获得。在使用时，需使用无核酸酶水将该稀释液稀释成2×buffer，在微芯片的每孔内加入0.6μL。
在更进一步的实施例中，所述试剂盒还包括“矿物油”，用于对所述微芯片上的加样孔进行封闭。由于体系非常微量，不封油很容易风干，封油相当于盖住PCR管的管盖，使样本不容易污染。
阳性对照，具体为ORF 1a/b基因和N基因的阳性质粒；
阴性对照，具体为无核酸酶水。
在具体的实施例中，所述探针的3＇端标记MGB淬灭基团，5＇端标记FAM或ROX荧光报告基团。上述“MGB”、“FAM”和“ROX”基团均为本领域常见的荧光基团，本领域技术人员还可以选用其它本领域常见的荧光淬灭基团和荧光报告基团来替换本文的“MGB”、“FAM”和“ROX”，例如，常见的荧光淬灭基团还包括：BHQ-1、BHQ-2、Dabcyl 2；常见的荧光报告基团还可以选自：TET、HEX、5-TAMRA、Texas Red-X、Cy3(TYETM 563)、 Cy5(TYETM 665)、JOE。
在进一步的实施例中，所述试剂盒还包括用于进行荧光PCR检测的AriaYSB微芯片及常规试剂。
所述冻干微芯片试剂还包括DNA聚合酶、反转录酶、dNTP、Mg2+、海藻糖、Tris-Cl。
在优选的实施例中，所述常规试剂包括DNA聚合酶、反转录酶、dNTP、Mg2+、海藻糖、Tris-Cl；和/或，包括所述矿物油、稀释液、双蒸水在内的商品化分子试剂；
在进一步优选的实施例中，所述商品化稀释液为10×buffer(不含Mg2+)，使用无核酸酶水稀释为2×buffer。本领域商品化的DNA聚合酶、反转录酶、dNTP、10×buffer还有多种，本领域技术人员可以选用其它品牌和其它类型的分子试剂。
第3组实施例：本发明的检测方法
本组实施例提供一种用于鉴别新型冠状病毒ORF 1a/b基因和N基因的冻干微芯片荧光 RT-PCR检测方法。本组所有实施例都具有如下特征：所述方法包括：采用第1组实施例任一所述的冻干微芯片，和/或，第2组实施例任一所述的试剂盒对待测样品进行荧光PCR扩增。
在一些实施例中，在冻干微芯片的加样孔中加入待测样品及稀释液后，将冻干微芯片置于荧光PCR仪上进行所述荧光PCR扩增；
优选地，所述稀释液2×buffer的加入量为0.6μL，阳性对照、阴性对照或样本的加入量为 0.6μL；
进一步优选地，所述荧光PCR扩增的反应程序为：45℃5min；95℃1min；以95℃5s，60℃15s为1个循环，进行40个循环，每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
在一些实施例中，所述检测指荧光定量PCR检测；所述ORF 1a/b基因和N基因的冻干微芯片包括：上游引物0.8μM；下游引物0.8μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.4mM；Mg2+4mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 6mM；余量为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL。
所述荧光定量PCR的冻干微芯片的上样孔为30个，将上述荧光PCR体系(包含ORF1a/b 基因和N基因2套引物探针)，每个微芯片孔加入1.2μL。
在一些实施例中，所述冻干条件为荧光定量PCR的冻干微芯片先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。
在进一步的实施例中，所述荧光定量PCR的反应程序包括：45℃5min，为第一步循环； 95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
实验例1新型冠状病毒(2019-nCoV)冻干微芯片荧光RT-PCR检测试剂盒特异性验 证
1、设计引物和Taqman-MGB探针
根据国内已公布的新型冠状病毒基因，找ORF 1a/b基因和N基因的特异性保守序列，并设计多对引物和探针。经过比对筛选，最终确定一组最佳的引物和Taqman-MGB探针，具体序列如下：
ORF1a/b基因上游引物：5＇-ATGTACGTGCATGGATTGGC-3＇，
ORF1a/b基因下游引物：5＇-GGTGTATCAACATAACCTGTAGGTAC-3＇，
ORF1a/b基因Taqman探针：
5＇FAM-CCAATTTACCTTTACAGCTAG-MGB-3＇；
N基因上游引物：5＇-TCTCCTGCTAGAATGGCTGG-3＇，
N基因下游引物：5＇-TCAAGCAGCAGCAAAGCAAG-3＇，
N基因Taqman探针：5＇ROX-AATGGCGGTGATGCT-MGB-3＇。
其中ORF1a/b基因的Taqman探针的5＇端标记FAM荧光报告基团；N基因的Taqman 探针的5＇端标记ROX荧光报告基团。3＇端均标记MGB淬灭荧光基团。淬灭荧光基团选择MGB的原因在于，TaqMan-MGB探针与传统的TaqMan-TAMRA探针相比具有以下优势： (1)提高TM值--平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异。(2)提高信噪比-- 由于探针的3＇端淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。
2、质粒制备
由华大基因科技服务有限公司合成2019-nCoV病毒、HCoV-229E病毒、HCoV-OC43病毒、HCoV-NL63病毒、HCoV-HKU1病毒、SARS-CoV病毒、MERS-CoV病毒基因质粒。分别稀释至5×107copies/mL，放置于-20℃备用。
3、冻干微芯片制备
按照下表进行冻干微芯片的RT-PCR体系配制：
Figure RE-GDA0002483711600000121
Figure RE-GDA0002483711600000131
荧光定量PCR的AriaYSB微芯片(北京亿森宝生物科技有限公司)的整个冻干微芯片上样孔为30个，将上述荧光定量PCR体系(包含ORF 1a/b基因和N基因2套引物探针)，每个微芯片孔加入1.2μL。
将包被有PCR试剂的微芯片先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。
4、冻干微芯片特异性验证
将10×buffer稀释液加入24μL无核酸酶水振荡混匀后，每孔加入0.6μL，在微芯片表面加入600μL矿物油，待其覆盖所有上样孔后。再分别加入0.6μL 2019-nCoV病毒、HCoV-229E 病毒、HCoV-OC43病毒、HCoV-NL63病毒、HCoV-HKU1病毒、SARS-CoV病毒、MERS-CoV 病毒基因质粒，最后一孔加入0.6μL无核酸酶水作为阴性对照。
冻干微芯片荧光RT-PCR反应条件如下：45℃5min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
实验结果如图，冻干微芯片包被的是ORF 1a/b基因和N基因双重荧光RT-PCR试剂，图 1结果显示ORF 1a/b基因通道检测2019-nCoV病毒质粒为阳性扩增，Ct值为25.05，有扩增曲线。HCoV-229E病毒、HCoV-NL63病毒、HCoV-OC43病毒、HCoV-HKU1病毒、SARS-CoV 病毒、MERS-CoV病毒以及阴性对照样品无非特异性扩增。图2结果显示，N基因通道检测 2019-nCoV病毒质粒为阳性扩增，Ct值为24.29，有S形扩增曲线。HCoV-229E病毒、HCoV-OC43病毒、HCoV-NL63病毒、HCoV-HKU1病毒、SARS-CoV病毒、MERS-CoV病毒及阴性对照样品无非特异性扩增。所得结果与预期完全吻合。从所有样本的扩增曲线上可以看到，在扩增的前期，特别是在荧光临界值(threshold)附近，曲线重合性较好。
实验例2、新型冠状病毒2019-nCoV冻干微芯片荧光RT-PCR检测试剂盒与常规市售 荧光RT-PCR试剂进行敏感性验证和比较
将浓度为1×108copies/mL的2019-nCoV病毒质粒进行10倍梯度稀释。取103copies/mL 的质粒进行2倍稀释。取1×108copies/mL～103copies/mL，500copies/mL，250copies/mL 各梯度浓度2019-nCoV病毒的质粒作为模板，无核酸酶水作为阴性对照，进行冻干微芯片荧光RT-PCR试剂和常规市售荧光RT-PCR试剂的敏感性检测。
冻干微芯片荧光RT-PCR体系按实施例1进行制备，将10×buffer稀释液加入24μL无核酸酶水振荡混匀后，每孔加入0.6μL，在微芯片表面加入600μL矿物油，待其覆盖所有上样孔后。在孔中分别加入1×108copies/mL～250copies/mL各梯度浓度的2019-nCoV病毒质粒，最后1孔加入0.6μL无核酸酶水作为阴性对照。
冻干微芯片荧光RT-PCR反应条件如下：45℃5min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
常规市售产品1反应程序如下：50℃15min，为第一步循环；95℃15min，为第二步循环；94℃10s，55℃40s，为第三步45个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
常规市售产品2反应程序如下：50℃10min，为第一步循环；95℃5min，为第二步循环； 94℃15s，55℃45s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
表1结果显示，冻干微芯片荧光RT-PCR，由于优化了PCR体系，其最低检测样本浓度为 250copies/mL，Ct值为38.89，因此反应循环数40可大大满足最低检测要求。常规市售产品1 最低检测样本浓度1×103copies/mL，Ct值为38.43。常规市售产品2最低检测样本浓度1×103copies/mL，Ct值为38.76。结果表明，冻干微芯片荧光RT-PCR检测的敏感性比常规市售产品高。
表1试剂盒敏感性分析
样品名称 冻干微芯片Ct值 市售产品1Ct值 市售产品2Ct值
1×10<sup>8</sup>copies/mL 23.17±0.10 24.52±0.07 24.15±0.09
1×10<sup>7</sup>copies/mL 26.44±0.15 27.36±0.11 27.23±0.16
1×10<sup>6</sup>copies/mL 29.30±0.17 30.49±0.23 30.34±0.22
1×10<sup>5</sup>copies/mL 32.48±0.21 33.63±0.25 33.47±0.26
1×10<sup>4</sup>copies/mL 34.65±0.14 36.84±0.26 36.57±0.21
1×10<sup>3</sup>copies/mL 37.32±0.21 38.43±0.13 38.76±0.14
500copies/mL 38.05±0.23 无 无
250copies/mL 38.89±0.27 无 无
阴性对照 无 无 无
冻干微芯片荧光RT-PCR反应体系为1.2μL，常规市售产品荧光RT-PCR体系为25μL，冻干微芯片荧光RT-PCR反应体系缩小了20多倍。冻干微芯片荧光RT-PCR反应运行时间不到30分钟，常规市售产品实际上机运行时间为60-90分钟，运行时间缩短2/3。
实验例3：新型冠状病毒(2019-nCoV)冻干微芯片荧光RT-PCR检测试剂盒的制备及 检测
1、试剂盒的制备：
冻干微芯片的制备：
按照如下反应体系进行冻干微芯片RT-PCR体系配制：
Figure RE-GDA0002483711600000151
Figure RE-GDA0002483711600000161
荧光定量PCR的AriaYSB微芯片(北京亿森宝生物科技有限公司)的整个冻干微芯片上样孔为30个，将上述荧光定量PCR体系(包含ORF 1a/b基因和N基因2套引物探针)，每个微芯片孔加入1.2μL。
将包被有PCR试剂的微芯片先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。
试剂1：稀释液Taq Buffer(10×)(Thermo Scientific，货号B650060)，6μl
试剂2：矿物油(Sangon Biotech，货号A630217)1mL
试剂3：阳性对照(N基因、ORF 1a/b基因阳性质粒)30μl；
试剂4：阴性对照(无核酸酶)30μl。
试剂5：无核酸酶水50μl。
2、试剂盒的重复性分析
选取3个已知阳性的样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复检测：将 3个已知阳性样品在同一批实验中进行，每个样品设置3个重复。批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。
每孔冻干微芯片荧光RT-PCR反应体系为1.2μL：试剂1(Taq Buffer)使用前需吸取24μL 试剂5(无核酸酶水)加入试剂1(Taq Buffer)内振荡混匀后，每孔加入0.6μL。在微芯片表面加入600μL试剂2(矿物油)，待其覆盖所有上样孔后。每孔再分别加入阳性样品、试剂3(阳性对照)或试剂4(阴性对照)各0.6μL。
冻干微芯片荧光RT-PCR反应条件如下：45℃5min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，并记录实验结果。
从表2中的检测结果可以看出，ORF1ab基因的批内变异系数在0.26％～0.93％之间，批间变异系数在0.74％～1.35％之间；N基因的批内变异系数在0.26％～0.87％之间，批间变异系数在0.43％～1.06％之间，说明本试剂盒重复性良好。
表2试剂盒重复性分析
Figure RE-GDA0002483711600000171
由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针并优化微芯片冻干条件，发展了能够快速、有效地检测ORF 1a/b基因和N基因的微芯片荧光定量PCR检测的反应体系，同时制备了基于该方法的检测试剂盒，所述检测方法准确性、特异性和敏感性高，所述检测试剂盒重复性好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京亿森宝生物科技有限公司
<120> 用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片、试剂盒及方法
<130> P200084/YSB
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF1a/b基因上游引物
<400> 1
atgtacgtgc atggattggc 20
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF1a/b基因下游引物
<400> 2
ggtgtatcaa cataacctgt aggtac 26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF1a/b基因Taqman探针
<400> 3
ccaatttacc tttacagcta g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N基因上游引物
<400> 4
tctcctgcta gaatggctgg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N基因下游引物
<400> 5
tcaagcagca gcaaagcaag 20
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N基因Taqman探针
<400> 6
aatggcggtg atgct 15
<210> 7
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF 1a/b基因
<400> 7
atgtacgtgc atggattggc ttcgatgtcg aggggtgtca tgctactaga gaagctgttg 60
gtaccaattt acctttacag ctaggttttt ctacaggtgt taacctagtt gctgtaccta 120
caggttatgt tgatacacc 139
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N基因
<400> 8
tctcctgcta gaatggctgg caatggcggt gatgctgctc ttgctttgct gctgcttga 59

Claims (23)

1.用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片，其特征在于，用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；所述荧光PCR反应体系包括下述引物和探针：
ORF1a/b基因上游引物：5＇- ATGTACGTGCATGGATTGGC-3＇，
ORF1a/b基因下游引物：5＇-GGTGTATCAACATAACCTGTAGGTAC-3＇，
ORF1a/b基因Taqman探针：5＇- CCAATTTACCTTTACAGCTAG-3＇；
N基因上游引物：5＇- TCTCCTGCTAGAATGGCTGG -3＇，
N基因下游引物：5＇- TCAAGCAGCAGCAAAGCAAG-3＇，
N基因Taqman探针：5＇- AATGGCGGTGATGCT-3＇。
2.根据权利要求1所述的冻干微芯片，其特征在于，所述荧光PCR反应体系还包括：Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、dNTP、Mg2+。
3.根据权利要求1所述的冻干微芯片，其特征在于，所述ORF1a/b基因和N基因的Taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的冻干微芯片，其特征在于，所述ORF1a/b基因的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为FAM；所述N基因的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为ROX；所述ORF1a/b基因和N基因的Taqman探针的3`端标记的荧光淬灭基团均为MGB。
5. 根据权利要求1所述的冻干微芯片，其特征在于，所述荧光PCR反应体系包括：上游引物0.8μM；下游引物0.8μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP0.4mM；Mg2+4mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 6mM，其余为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL。
6. 根据权利要求2所述的冻干微芯片，其特征在于，所述荧光PCR反应体系包括：上游引物0.8μM；下游引物0.8μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP0.4mM；Mg2+4mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 6mM，其余为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL。
7.根据权利要求1-6任一所述的冻干微芯片，其特征在于，所述微芯片上设置有若干个加样孔；所述荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述加样孔内。
8.根据权利要求7所述的冻干微芯片，其特征在于，所述微芯片上的加样孔为30个；所述微芯片的底部结构、形状、大小与PCR仪的加样板相适配。
9.根据权利要求1-6、8任一所述的冻干微芯片，其特征在于，所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光PCR反应体系的微芯片置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干。
10.根据权利要求7所述的冻干微芯片，其特征在于，所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光PCR反应体系的微芯片置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干。
11.根据权利要求9所述的冻干微芯片，其特征在于，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。
12.根据权利要求10所述的冻干微芯片，其特征在于，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。
13.用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-12任一所述的用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，还包括：稀释液。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为10×buffer。
16.根据权利要求13-15任一所述的试剂盒，其特征在于，还包括：矿物油，用于封闭所述冻干微芯片上的加样孔。
17.根据权利要求13-15任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性对照，和/或，阴性对照。
18.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性对照，和/或，阴性对照。
19. 根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为带有ORF 1a/b基因目的片段和N基因目的片段的阳性质粒；所述阴性对照为无核酸酶水。
20. 根据权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为带有ORF 1a/b基因目的片段和N基因目的片段的阳性质粒；所述阴性对照为无核酸酶水。
21.用于非诊断治疗目的的检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，其特征在于，采用具有权利要求1-12任一所述的用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片，以及具有权利要求13-20任一所述的试剂盒对待测样品进行荧光PCR扩增。
22.根据权利要求21所述的用于非诊断治疗目的的检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，其特征在于，在冻干微芯片的加样孔中加入待测样品及稀释液后，将冻干微芯片置于荧光PCR仪上进行所述荧光PCR扩增。
23. 根据权利要求21或22所述的用于非诊断治疗目的的检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增的反应程序为：45℃ 5min；95℃ 1min；以95℃ 5s，60℃ 15s为1个循环，进行40个循环，每个循环的结束时进行荧光信号检测。
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