CN113025752A

CN113025752A - 用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN113025752A
Application number: CN202110312362.4A
Authority: CN
Inventors: 韩琦; 刘勇; 曾林秀; 黄海均; 李春兰; 吴秋保; 陈长君; 陈敬贤
Original assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: CN113025752B

Abstract

本发明提供一种用于2019‑nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因、试剂盒及检测方法。本发明的内参基因通过在小鼠肌肉RAB3A癌基因片段两端连接2019‑nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段得到。本发明试剂盒以上述内参基因或包含上述内参基因的重组质粒作为内部质控，该内参基因为同源性内参基因，在PCR检测过程中可降低对结果的抑制，减少假阴性结果，提高检测准确性。采用本发明的试剂盒可同时检测2019‑nCoV和SARS病毒，检测结果准确可靠，灵敏度高，并同时可检测扩正体系是否正常。

Description

用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术和分子诊断领域，特别是涉及一种用于2019-nCoV和SARS病毒 PCR检测的内参基因、试剂盒及检测方法。

背景技术

冠状病毒是自然界广泛存在的一类病毒，因该病毒形态在电镜下观察类似王冠而得名。目前发现，冠状病毒仅感染脊椎动物，可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病。人感染了冠状病毒后常见体征包括：呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

新型冠状病毒(2019-nCoV)是新发现的冠状病毒新毒株。新型冠状病毒所致疾病目前暂无特异治疗方法。病理解剖中发现，感染后首先累及到肺，表现为肺脏里面有实变，有大量的渗出，有炎症细胞因子的侵润，以及炎症细胞大量的浸润等。同时，在小的支气管里可以看到较多分泌物，堵塞小气道，影响气体交换。电镜下肺部可见病毒颗粒。免疫系统受累比较严重，临床上表现为白细胞少，淋巴细胞减少，病人免疫力下降，容易出现细菌和真菌感染。

冠状病毒(Coronaviruses，CoV)属于尼多病毒目冠状病毒科，为有包膜的单股、正链 RNA病毒，分为α、β和γ三个属。冠状病毒的特征是具有从其表面突出的棍棒状突刺。冠状病毒一般包括纤突蛋白(spike，S)、小包膜蛋白(envelope，E)、囊膜蛋白(membrance，M)、核蛋白(nucleocapsid，N)。SARS-CoV-2为β冠状病毒属类SARS冠状病毒种，基因序列分别为5'非翻译区(UTR)、复制酶复合体(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR 和一些不确定的非结构性开放阅读框，包含4个主要结构蛋白，分别为刺突糖蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)，所有这些蛋白均在病毒基因组的3'端编码。S蛋白可识别宿主细胞受体并介导膜融合，S蛋白与宿主细胞的病毒受体结合。E蛋白具有N端胞外域和C端内域，且具有离子通道活性，有助于病毒的组装和释放，缺乏E蛋白的重组病毒会造成病毒致命性减弱。M蛋白是病毒体中最丰富的结构蛋白，有3 个跨膜结构域，可以使病毒体形成其形状。M蛋白具有一个小的N端糖基化胞外域和一个大的C端内域，在病毒颗粒内延伸6～8nm。M蛋白在病毒体中以二聚体形式存在，并且可能采用两种不同的构象，从而使其既能够促进膜弯曲又能与核衣壳结合。M蛋白保持病毒形态，并连接N蛋白，E蛋白和M蛋白，主要参与病毒的装配过程。N蛋白也与复制酶复合物的关键成分nsp3和M蛋白结合，这些蛋白质相互作用可能有助于将衣壳化的基因组包装成病毒颗粒。由于RNA病毒复制酶缺少校正功能，病毒复制过程中易发生突变。

目前，市面上还没有既可以检测新型冠状病毒又可以检测非典型肺炎病毒的双检试剂。而现有的检测新型冠状病毒的试剂大多是检测ORF Iab和N基因，而内部参考品为非同源性内参，可能会出现对结果的抑制，导致假阴性报告。国家生物信息中心披露的2019-nCoV信息库ORF1ab基因的11083位点，随着疫情发展，其群体发生频率从0逐步增加到22％，随后递减至8％，具有较大的不稳定性，可以预见，后期ORF1ab基因可能还会发生更高突变，故其检测可靠性差。

因此，有必要开发一种采用同源性内参和包含该同源性内参的双检试剂，减少PCR抑制，减少假阴性结果。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因，该内参基因为同源性内参基因，在PCR检测过程中可减少PCR抑制，减少假阴性结果。

一种用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因，通过在小鼠肌肉RAB3A癌基因片段两端连接2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段得到。

上述内参基因，为同源性内参基因，包含RAB3A癌基因片段，该基因片段的侧翼是2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段，在单一的反应中同时扩增和检测样本片段和同源内参基因，可以较为容易地区分PCR抑制和真阴性结果，提高检测准确性。

在其中一个实施例中，所述小鼠肌肉RAB3A癌基因片段序列如SEQ ID No.1所示。具体序列如下：

GCATCCAGGCGACAAGTTATTCTGGTCCATTGGCGCCTCCGCAGCTGGCGGGGAGG TCTATAAACAGGGCCAGGACACGTTCCCAGTTCTGCTTCCTGTGGGAATGGAAGCGATG GGGACCCTGCCCGGCCGCACGGAGAGGAAGAATAGGATAGACCCCAGATTCCCACCTT GACAGGCAGATTTGCAG(SEQ ID No.1)。

小鼠肌肉RAB3A癌基因全长为6348bp，本发明人通过反复比对、筛选后，选取小鼠肌肉RAB3A癌基因的61～250bp位置片段与2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因连接，该段小鼠肌肉RAB3A癌基因片段与SARS及新型冠状病毒基因组均无交叉反应。

在其中一个实施例中，所述2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段序列如SEQID No.2和SEQ ID No.3所示。具体序列如下：

CTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGA(SEQ ID No.2)，

CTGCTTACGGTTTCGTCC(SEQ ID No.3)。

在其中一个实施例中，所述内参基因序列如SEQ ID No.4所示。具体序列如下：

CTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAGCATCCAGGCGACAAGTTATTCTGGTCCATTGG CGCCTCCGCAGCTGGCGGGGAGGTCTATAAACAGGGCCAGGACACGTTCCCAGTTCTG CTTCCTGTGGGAATGGAAGCGATGGGGACCCTGCCCGGCCGCACGGAGAGGAAGAATA GGATAGACCCCAGATTCCCACCTTGACAGGCAGATTTGCAGCTGCTTACGGTTTCGTCC (SEQ ID No.4)。

该序列的内参是由来自小鼠肌肉的190bpRAB3A癌基因片段组成的重组DNA，小鼠肌肉的190bpRAB3A癌基因片段来自小鼠肌肉RAB3A癌基因的61-250bp位置，在该片段的两端连接SARS病毒与SARS-CoV-2同源的基因片段。

本发明还提供一种质粒，包含上述内参基因。

在其中一个实施例中，所述质粒通过在pGSI质粒载体中插入上述内参基因得到。

在其中一个实施例中，所述质粒的序列如SEQ ID No.5所示。具体序列如下：

CTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGC GTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTT CTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTC CGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGT AGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTT AATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTT GATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAA AATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTGCCATTCGCCATTCAGGCT GCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGA AAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG ACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGACCCTTTCTT GTAGATCTGTTCTCTAAACGAGCATCCAGGCGACAAGTTATTCTGGTCCATTGGCGCCTC CGCAGCTGGCGGGGAGGTCTATAAACAGGGCCAGGACACGTTCCCAGTTCTGCTTCCTG TGGGAATGGAAGCGATGGGGACCCTGCCCGGCCGCACGGAGAGGAAGAATAGGATAGA CCCCAGATTCCCACCTTGACAGGCAGATTTGCAGCTGCTTACGGTTTCGTCCTTTGGGGA TATCCTCGAGGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAG CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGC ATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGC TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCA ACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATA CGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGC AAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCC CCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGAC TATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCC TGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATA GCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGC ACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCA ACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGA GCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACAC TAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAG TTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCA AGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACG GGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATC AAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAG TATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCA GCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGA TACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCA CCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTG GTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAA GTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGT CACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTA CATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA GAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTA CTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCT GAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCG CGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAA CTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAAC TGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCA AAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC TTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAA TGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC (SEQ ID No.5)。

本发明还提供一种用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的试剂盒，以上述内参基因或上述质粒作为内部质控。

在其中一个实施例中，所述试剂盒包括：2019-nCoV E基因引物、2019-nCoV M基因引物、2019-nCoV和SARS同源基因引物以及上述内参基因或上述质粒；

所述2019-nCoV E基因引物的序列如SEQ ID No.6～SEQ ID No.7所示：

E-F：CGTGGTATTCTTGCTAGTTACACT(SEQ ID No.6)，

E-R：AAAGAAGGTTTTACAAGACTCACG(SEQ ID No.7)；

所述2019-nCoV M基因引物的序列如SEQ ID No.8～SEQ ID No.9所示：

M-F：ATCTTCGTATTGCTGGACACC(SEQ ID No.8)，

M-R：AATAAGAAAGCGTTCGTGATG(SEQ ID No.9)；

所述2019-nCoV和SARS同源基因引物的序列如SEQ ID No.10～SEQ ID No.11所示：

O-F：CTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGA(SEQ ID No.10)，

O-R：GGACGAAACCGTAAGCAG(SEQ ID No.11)。

2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段序列中的SEQ ID No.2序列与Primer-O-F相同，SEQ ID No.3的序列为Primer-O-R的反向引物序列。

上述试剂盒为四重PCR扩增试剂盒，内部质控是本发明的内参基因或质粒，三对引物分别是针对SARS-CoV-2的M基因的一段保守片段、SARS-CoV-2的E基因的一段保守片段，以及SARS病毒与SARS-CoV-2同源的基因片段设计得到。

截至2020年11月30日，国家生物信息中心2019新型冠状病毒信息库(2019nCoVR)显示，在已统计的12个基因/区域(5’UTR、ORF1ab、S、ORF3a、E、M、ORF6、ORF7a、 ORF8、N、ORF10、3’UTR)中，M基因的核苷酸变异数为452，核苷酸变异频率为0.6756353，是12个基因/区域中核苷酸变异频率最低的区域。因此，上述试剂盒的检测可靠性强，不容易因病毒变异而导致试剂盒检测不到新型冠状病毒。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括引物探针：

所述2019-nCoV E基因引物探针序列如SEQ ID No.12所示：

FAM-CCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTG-BHQ1(SEQ ID No.12)；

所述2019-nCoV M基因引物探针序列如SEQ ID No.13所示；

Primer-M2-P：VIC-ACGCTGTGACATCAAGGACCTGCC-BHQ1(SEQ ID No.13)；

所述2019-nCoV和SARS同源基因引物探针序列如SEQ ID No.14所示：

Primer-O2-P：ROX-CGAGTTACTCGTKTCYTGTCAACG-BHQ2(SEQ ID No.14)；

所述内参基因或质粒探针序列如SEQ ID No.15所示：

IC Probe：CY5-CCAGGCGACAAGTTATTCTGGTCCA-BHQ3(SEQ ID No.15)。

本发明还提供一种非诊断目的的2019-nCoV和SARS病毒检测方法，采用上述试剂盒对待测样本进行PCR检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的内参基因，为同源性内参基因，包含RAB3A癌基因片段，该基因片段的侧翼是2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段，在单一的反应中同时扩增和检测样本片段和同源内参基因，可以很容易地区分PCR抑制和真阴性结果，提高检测准确性。

本发明的质粒，包含上述内参基因，可降低PCR抑制，减少假阴性结果，提高检测准确性。

本发明的试剂盒，包括上述内参基因或质粒，PCR扩增效率高，可检测和区分新型冠状病毒及SARS病毒，检测灵敏度高、特异性好，而且还可检测整个扩增体系是否正常。

本发明的检测方法，采用上述内参基因、质粒或试剂盒，检测效率高，检测结果准确可靠。

附图说明

图1为实施例中环状质粒构建前后示意图。

图2为实施例中目的基因结果验证及引物效果验证凝胶成像图之一。

图3为实施例中目的基因结果验证及引物效果验证凝胶成像图之二。

图4为实施例中SEQ ID No.12所示2019-nCoV E基因引物探针扩增曲线图。

图5为实施例中SEQ ID No.13所示2019-nCoV M基因引物探针扩增曲线图。

图6为实施例中SEQ ID No.14所示2019-nCoV和SARS同源基因引物探针扩增曲线图。

图7为实施例中SEQ ID No.15所示内参基因引物探针扩增曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

制备包含2019-nCoV和SARS病毒PCR检测内参基因的质粒。

一、合成目的基因。

为获得检测2019-nCoV和SARS病毒的同源性内参，发明人选取小鼠肌肉RAB3A癌基因的61～250bp位置片段与2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因连接，作为内参基因。具体为：将SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段连接至SEQ ID No.1所示的小鼠肌肉RAB3A癌基因片段两端。连接后得到的目的基因序列如 SEQID No.4所示。

具体地，在本实施例中，上述SEQ ID No.1～3的基因片段是在广州艾基生物技术有限公司合成，并自行组装得到目的基因序列。

二、构建环状质粒。

参照TaKaRa 6013 PMD^TM19-T Vector Cloning Kit将目的基因插入到pGSI载体。具体地，在冰上操作，将1μL pGSI、5μL SolutionⅠ、2μL目的基因PCR扩增产物、2μL dH₂O添加至 0.5mL EP管，反应得到重组的环状质粒，4℃下保存。环状质粒构建前后示意图如图1所示。环状质粒的序列如SEQ ID No.5所示。

三、环状质粒的克隆和表达。

1、配制LB培养基

称取10g NaCl、5g酵母粉、10g蛋白胨、15g琼脂，混合，加水定容至1L，高压灭菌，冷却，添加氨苄青霉素(终浓度为100mg/L)，混合均匀得LB培养基。倒平板，冷却凝固后，将平板倒置，室温放置一晚后，用袋子封装，4℃保存。

2、转化至感受态细胞

1)从-80℃冰箱取出DH5α感受态细胞(天根CB101)置于冰上解冻。

2)每个EP管加入33μL感受态细胞，混匀，置于冰上30min。提前将水浴箱预热至42℃。

3)将上述EP管置于42℃水浴，90s。置冰上5min。

4)取0.4mL LB培养基加到10mL圆底管。

5)倾斜LB培养基，将T载体和感受态混合物加至LB培养基低液面一侧，从高液面处取少量培养基将原来装有T载体和感受态细胞混合物的EP管冲洗一遍，将所有液体全部转移至LB培养基中，混匀，置于37℃摇床1h，边震荡边培养。

6)将菌液混匀，全部转移至含有氨苄青霉素的LB平板(含40μL 0.1M IPTG和60μL2％x-Gal)上，无菌操作，涂布接种，置于37℃，无CO₂的孵箱中培养过夜。

7)第二天观察有菌生长，阴性对照不长菌。

3、增菌

1)挑选平板上的单个白色菌落接种至3mL LB肉汤(含有100mg/L氨苄青霉素)中，混匀后，置于37℃摇床中孵育过夜。

2)每个平板挑选5个单个菌落(每个菌落都代表一个不同的克隆)，分别接种，做好标记。无菌操作。

4、提取质粒

按照碧云天D0003质粒小量抽提试剂盒进行提取。

1)取过夜菌1.5mL，5000g离心1min收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3mL过夜菌沉淀。

2)每管加入250μL溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

3)每管加入250μL溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。

4)每管加入350μL溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。

5)13000rpm左右室温离心10min。

6)将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60s，倒弃收集管内液体。

7)在质粒纯化柱内加入750μL溶液IV，最高速离心30-60s，洗去杂质，倒弃收集管内液体。

8)再最高速离心1min，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

9)将质粒纯化柱置于洁净1.5mL离心管上，加入50μL溶液V至管内柱面上，放置1min。

10)最高速离心1min，所得液体即为高纯度质粒。

5、检验

用Nanodrop检测浓度纯度，通过RT-PCR扩增，以2019-nCoV和SARS同源基因扩增引物对(SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11)验证目标基因是否成功导入质粒中。扩增产物进行凝胶电泳，观察跑胶条带，若有条带则说明导入成功。

按下表配制环状质粒扩增试剂。

表1环状质粒扩增试剂

试剂名称	1个反应(25μl体系)
		2×One step Buffer	12.5μl
ddH<sub>2</sub>O	5μl
		O-F-1Primer(10mM)	1μl
O-R-1Primer(10mM)	1μl
		环状质粒	5μl
Enzyme Mix	0.5μl

其中，Enzyme Mix是逆转录酶Oligo。

凝胶电泳实验结果如图2-3所示。图2中，泳道从左到右依次为Marker，阴性对照(未加入核酸样本)，内参，含SARS病毒基因片段，Marker；图3中，泳道从左到右依次为Marker， M基因1-3，阴性对照，同源基因1-3，阴性对照，E基因1-3，阴性对照，内参，阴性对照， Marker。图2和图3中的IC泳道可以清晰地观察到有目的基因条带，表明成功将目的基因导入载体。

实施例2

2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的引物和探针筛选。

一、引物和探针设计。

本发明人在进行大量调研的基础上，通过反复筛选和比对，分别针对SARS-CoV-2的M 基因的一段保守片段、SARS-CoV-2的E基因的一段保守片段，以及SARS病毒与SARS-CoV-2 同源的基因片段设计得到以下引物和探针组合。

2019-nCoV E基因引物：

E-F-1Primer：5’-CGTGGTATTCTTGCTAGTTACACT-3’，

E-R-1Primer：5’-AAAGAAGGTTTTACAAGACTCACG-3’。

2019-nCoV M基因引物：

M-F-1Primer：5’-ATCTTCGTATTGCTGGACACC-3’，

M-R-1Primer：5’-AATAAGAAAGCGTTCGTGATG-3’。

2019-nCoV和SARS同源基因引物：

O-F-1Primer：5’-CTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGA-3’，

O-R-1Primer：5’-GGACGAAACCGTAAGCAG-3’。

二、验证RT-PCR引物

使用TAKARA One Step RT-PCR Kit Ver.2(Code No.RR055A)进行引物验证。

1、方法

1.1配制RT-PCR反应液

M基因引物段扩增试剂配制如表2所示：

表2 M基因引物段扩增试剂

试剂名称	1个反应(25μl体系)	4个反应
			2×One step Buffer	12.5μl	12.5×4μl＝50μl
ddH<sub>2</sub>O	5μl	5×4μl＝20μl
			M-F-1Primer(10mM)	1μl	1×4μl＝4μl
M-R-1Primer(10mM)	1μl	1×4μl＝4μl
			RNA	5μl	/
Enzyme Mix	0.5μl	0.5×4μl＝2μl

其中，RNA是待测新冠病毒样本核酸，Enzyme Mix是逆转录酶Oligo。

SARS和2019-nCOV同源基因引物扩增试剂配制如下表所示：

表3 SARS和2019-nCOV同源基因引物扩增试剂

试剂名称	1个反应(25μl体系)	4个反应
			2×One step Buffer	12.5μl	12.5×4μl＝50μl
ddH<sub>2</sub>O	5μl	5×4μl＝20μl
			O-F-1Primer(10mM)	1μl	1×4μl＝4μl
O-R-1Primer(10mM)	1μl	1×4μl＝4μl
			RNA	5μl	/
Enzyme Mix	0.5μl	0.5×4μl＝2μl

其中，RNA是待测新冠病毒样本核酸。

E基因引物段扩增试剂配制如下表所示：

表4 E基因引物段扩增试剂

试剂名称	1个反应(25μl体系)	4个反应
			2×One step Buffer	12.5μl	12.5×4μl＝50μl
ddH<sub>2</sub>O	5μl	5×4μl＝20μl
			E-F-1 Primer(10mM)	1μl	1×4μl＝4μl
E-R-1 Primer(10mM)	1μl	1×4μl＝4μl
			RNA	5μl	/
Enzyme Mix	0.5μl	0.5×4μl＝2μl

其中，RNA是待测新冠病毒样本核酸。

环状质粒扩增试剂配制如下表所示：

表5环状质粒扩增试剂

试剂名称	1个反应(25μl体系)	4个反应
			2×One step Buffer	12.5μl	12.5×4μl＝50μl
ddH<sub>2</sub>O	5μl	5×4μl＝20μl
			O-F-1 Primer(10mM)	1μl	1×4μl＝4μl
O-R-1 Primer(10mM)	1μl	1×4μl＝4μl
			环状质粒	5μl	/
Enzyme Mix	0.5μl	0.5×4μl＝2μl

SARS模板扩增试剂配制如下表所示：

表6 SARS模板扩增试剂

其中，RNA是SARS病毒核酸。

1.2 RT-PCR扩增

在EP管中先加入5μl的ddH₂O，再加入12.5μl 2×One step Buffer，加入上下游引物各1 μl，接着加入0.5μl Enzyme Mix，涡旋混匀后，分装到8联管，20μl/管，按顺序加入样本核酸，每孔加入5μl样本核酸。PCR程序如下：

表7 PCR程序

琼脂糖凝胶电泳实验：

1)称取0.3g琼脂糖干粉到瓶中，加入30mL的1×TAE缓冲液，盖上盖子，放入微波炉中，开中火，加热沸腾直到液体变透彻。

2)加入Safe DNA-gel stdin，摇匀，倒胶。20min后，拔掉梳子，把胶转移到电泳槽中，加入1×TAE缓冲液直至溶液覆盖凝胶。

3)在一次性薄膜手套上加入6×Loading Buffer，每个点加2μl。

4)每个PCR产物取2μl与薄膜手套上的Loading Buffer混合，加到凝胶上的加样孔中。

5)加2μl DL5000到上样孔中。

6)120V跑胶20min。

7)使用凝胶成像仪看结果。

1.3结果

阳性样本在实时荧光PCR仪(ABI7500)扩增各引物探针的扩增曲线如图4-7所示。从图中可以看出采用上述引物探针可准确扩增。

实施例3

一种用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的试剂盒，其中包含的试剂如下表所示：

表8试剂盒

注：RNase Free dH₂O补至50μl。

实施例4

一种2019-nCoV和SARS病毒的检测方法，采用实施例3的试剂盒进行检测，其使用方法如下。

一、核酸提取

使用凯杰QIAamp Viral RNA Mini kit进行核酸提取，步骤如下：

1)吸取carrier RNA-AVE560μl到1.5ml离心管中。

2)加入140μl样本到步骤1)的管子中，涡旋混匀15s。

3)室温孵育10min。

4)瞬离，将盖子上的液体离心下来。

5)加入560μl无水乙醇到样本中，涡旋混匀15s后短暂离心。

6)小心转移630μl步骤5)的样本到QIAamp Mini column中。6000×g(8000rpm)离心 1min。弃废液。

7)重复步骤6)直至所有样本都转移到柱子上，换收集管。

8)加入500μl AW1，6000×g(8000rpm)离心1min，丢弃废液和收集管。

9)加入500μl AW2，20000×g(14000rpm)离心3min，可以直接进行步骤11)，如果要完全去除AW2，就先执行步骤10)再到步骤11)。

10)将QIAamp微型柱放到新的2ml管中，20000×g(14000rpm)离心1min。

11)将QIAamp微型柱放到新的1.5ml管中，加入60μl已平衡至室温的AVE。室温孵育1min。

12)6000×g(8000rpm)离心1min。

13)收集洗脱下来的核酸。

二、检测

使用TAKARA One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(CodeNo.RR064A) 进行qPCR。

按下表配制试剂：

表9 qPCR试剂

试剂	每人份使用量
		2×One Step RT-PCR BufferⅢ	25μl
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)	1-1.5μl
		PrimeScript RT Enzyme MixⅡ	1-1.5μl
E-F-1 Primer(10μM)	1μl
		E-R-1 Primer(10μM)	1μl
M-F-1 Primer(10μM)	1μl
		M-R-1 Primer(10μM)	1μl
O-F-1 Primer(20μM)	1.25μl
		O-R-1 Primer(20μM)	1.25μl
IC模板(环状质粒)	0.5μl
		E Probe(E基因探针)	2μl
M Probe(M基因探针)	2μl
		O Probe(同源基因探针)	3μl
IC Probe(内参探针)	2μl
		Total RNA	4μl
Total	50μl

注：RNase Free dH₂O补至50μl。

探针配制方法如下：

TE溶液配制：向10mmol/L Tris中添加EDTA，EDTA终浓度为0.5mmol/L。

探针配制：加入TE溶液将探针配制成100Pmol/mL的储存液，使用时用Tris稀释成需要的工作液。

三、上机测试

在ABI公司的7500实时荧光定量PCR仪进行上机扩增及分析。PCR程序如下表：

表10 PCR程序

参照下表所示的检测结果判断标准判断样品情况。

表11检测结果判断标准

注：样本结果阳性：样本有ct值及S型曲线；样本结果阴性：样本没有ct值或无S型曲线。

实验例1

分别采用实施例3的试剂盒对待测样本进行测试。同时采用Sanger法(一代测序)对测试结果进行验证。

表12样本检测结果

以上结果可以看出，采用本发明的试剂盒可以准确检测新冠病毒样品和SARS病毒样品。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州金域医学检验中心有限公司

<120> 用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因、试剂盒及检测方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 190

<212> DNA

<213> mouse

<400> 1

gcatccaggc gacaagttat tctggtccat tggcgcctcc gcagctggcg gggaggtcta 60

taaacagggc caggacacgt tcccagttct gcttcctgtg ggaatggaag cgatggggac 120

cctgcccggc cgcacggaga ggaagaatag gatagacccc agattcccac cttgacaggc 180

agatttgcag 190

<210> 2

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> coronavirus

<400> 2

cttgtagatc tgttctctaa acga 24

<210> 3

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> coronavirus

<400> 3

ctgcttacgg tttcgtcc 18

<210> 4

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttgtagatc tgttctctaa acgagcatcc aggcgacaag ttattctggt ccattggcgc 60

ctccgcagct ggcggggagg tctataaaca gggccaggac acgttcccag ttctgcttcc 120

tgtgggaatg gaagcgatgg ggaccctgcc cggccgcacg gagaggaaga ataggataga 180

ccccagattc ccaccttgac aggcagattt gcagctgctt acggtttcgt cc 232

<210> 5

<211> 3095

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 60

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 240

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 300

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 360

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 420

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttg ccattcgcca ttcaggctgc 480

gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag 540

ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt 600

gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcgaccct ttcttgtaga 660

tctgttctct aaacgagcat ccaggcgaca agttattctg gtccattggc gcctccgcag 720

ctggcgggga ggtctataaa cagggccagg acacgttccc agttctgctt cctgtgggaa 780

tggaagcgat ggggaccctg cccggccgca cggagaggaa gaataggata gaccccagat 840

tcccaccttg acaggcagat ttgcagctgc ttacggtttc gtcctttggg gatatcctcg 900

aggttccctt tagtgagggt taattgcgag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 960

tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 1020

taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 1080

cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1140

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1200

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1260

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1320

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1380

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1440

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1500

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1560

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1620

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1680

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1740

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1800

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 1860

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 1920

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 1980

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 2040

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 2100

tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 2160

atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 2220

tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 2280

aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 2340

catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 2400

gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 2460

ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 2520

aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 2580

atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 2640

cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 2700

gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 2760

agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 2820

gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 2880

caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 2940

ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 3000

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 3060

aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccac 3095

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtggtattc ttgctagtta cact 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaagaaggtt ttacaagact cacg 24

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcttcgtat tgctggacac c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aataagaaag cgttcgtgat g 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttgtagatc tgttctctaa acga 24

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggacgaaacc gtaagcag 18

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccatccttac tgcgcttcga ttgtg 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgctgtgac atcaaggacc tgcc 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgagttactc gtktcytgtc aacg 24

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccaggcgaca agttattctg gtcca 25

Claims

1.一种用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因，其特征在于，通过在小鼠肌肉RAB3A癌基因片段两端连接2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段得到。

2.根据权利要求1所述的内参基因，其特征在于，所述小鼠肌肉RAB3A癌基因片段序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的内参基因，其特征在于，所述2019-nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

4.根据权利要求1所述的内参基因，其特征在于，所述内参基因序列如SEQ ID No.4所示。

5.一种质粒，其特征在于，包含权利要求1～4任一项所述的内参基因。

6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述质粒的序列如SEQ ID No.5所示。

7.一种用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的试剂盒，其特征在于，以权利要求1～4任一项所述的内参基因或权利要求5～6任一项所述的质粒作为内部质控。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括：2019-nCoV E基因引物、2019-nCoVM基因引物、2019-nCoV和SARS同源基因引物以及权利要求1～4任一项所述的内参基因或权利要求5～6任一项所述的质粒；

所述2019-nCoV E基因引物的序列如SEQ ID No.6～SEQ ID No.7所示；

所述2019-nCoV M基因引物的序列如SEQ ID No.8～SEQ ID No.9所示；

所述2019-nCoV和SARS同源基因引物的序列如SEQ ID No.10～SEQ ID No.11所示。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括引物探针：所述2019-nCoV E基因引物探针序列如SEQ ID No.12所示；所述2019-nCoV M基因引物探针序列如SEQ ID No.13所示；所述2019-nCoV和SARS同源基因引物探针序列如SEQ ID No.14所示；所述内参基因或质粒探针序列如SEQ ID No.15所示。

10.一种非诊断目的的2019-nCoV和SARS病毒检测方法，其特征在于，采用权利要求7～9任一项所述的试剂盒对待测样本进行PCR检测。