CN112342245B - 用于促进CHO细胞悬浮的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于促进CHO细胞悬浮的CRISPR‑Cas13d系统以及重组CHO细胞。本发明提供了用于抑制IGFBP4基因表达的物质的应用，为如下：促进CHO细胞增殖；促进CHO细胞悬浮；促进CHO细胞由贴壁细胞向悬浮细胞转化。本发明还保护sgRNAIGFBP4‑1，其靶序列结合区如序列3中第1至22位核苷酸所示。本发明还保护表达sgRNAIGFBP4‑1和Cas13d蛋白的重组慢病毒。本发明的发明人筛选特定的靶点，设计了特定的sgRNA，通过CRISPR/Cas13d系统有效抑制了CHO细胞中的IGFBP4基因表达，得到了重组CHO细胞CHO细胞适应悬浮生长的时间显著缩短，增殖能力和/或悬浮能力极其显著的提高。本发明对于生物制药领域具有巨大的应用前景。

Description

用于促进CHO细胞悬浮的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO 细胞
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于促进CHO细胞悬浮的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO细胞。
背景技术
生物制药离不开细胞表达系统，而最常用的细胞系则是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表达系统。
1987年，基因泰克公司的tPA被FDA批准，这是第一个CHO细胞表达的上市药品。之后，CHO细胞作为哺乳动物蛋白表达系统全面走入制药行业。CHO细胞大规模培养技术及其生物反应器工程可广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产。
CHO细胞最初是上皮贴壁形成纤维细胞，在培养器皿面形成单细胞层，培养空间极其有限，传代时受到蛋白水解酶、机械力等造成的创伤，传代后细胞生长速率下降。经多次传代筛选后，CHO也可悬浮生长。但是，将贴壁细胞转化为悬浮细胞需要多次驯化，效率很低。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于促进CHO细胞悬浮的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO细胞。
本发明提供了用于抑制IGFBP4基因表达的物质的应用，为如下(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)：
(Ⅰ)促进CHO细胞增殖；
(Ⅱ)促进CHO细胞悬浮；
(Ⅲ)促进CHO细胞由贴壁细胞向悬浮细胞转化。
本发明还提供了一种促进CHO细胞增殖和/或促进CHO细胞悬浮的方法，包括如下步骤：在CHO细胞中导入抑制IGFBP4基因表达的物质。
本发明还提供了一种促进CHO细胞由贴壁细胞向悬浮细胞转化的方法，包括如下步骤：在CHO细胞中导入抑制IGFBP4基因表达的物质。
以上任一所述用于抑制IGFBP4基因表达的物质可为下述任一所述的CRISPR-Cas13d系统。
本发明还保护一种sgRNA，命名为sgRNAIGFBP4-1，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至22位核苷酸所示。具体来说，所述sgRNAIGFBP4-1如序列表的序列3所示。
本发明还保护一种特异DNA分子，其转录得到所述sgRNAIGFBP4-1。
本发明还保护一种特异重组质粒，其表达所述sgRNAIGFBP4-1和Cas13d蛋白。
本发明还保护表达sgRNAIGFBP4-1和Cas13d蛋白的重组慢病毒。所述重组慢病毒的制备方法具体如下：将Cas13d-IGFBP4-1质粒、psPAX2质粒和VSVG质粒共转染哺乳动物细胞(具体可为293T细胞)，然后培养细胞并收集上清，即为重组慢病毒病毒液。
本发明还保护一种CRISPR-Cas13d系统，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：
(b1)包括sgRNAIGFBP4-1和Cas13d蛋白；
(b2)包括所述特异DNA分子和Cas13d基因；
(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒和具有Cas13d基因的质粒；
(b4)包括所述特异重组质粒；
(b5)包括所述重组慢病毒。
以上任一所述特异重组质粒具体可为Cas13d-IGFBP4-1质粒。
Cas13d-IGFBP4-1质粒如序列表的序列2所示。
对于(b4)来说，所述CRISPR-Cas13d系统还包括psPAX2质粒和VSVG质粒。具体的，所述CRISPR-Cas13d系统还包括用于慢病毒包装的哺乳动物细胞(具体可为293T细胞)。
本发明还保护将所述重组慢病毒导入CHO细胞得到的重组CHO细胞。所述重组CHO细胞的增殖能力和/或悬浮能力显著提高，可以作为生物反应器用于生物制药。
以上任一所述IGFBP4基因为编码IGFBP4蛋白的基因。
IGFBP4蛋白为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列4所示的蛋白质；
(c2)来源于CHO细胞且与(c1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
IGFBP4基因为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)编码区如序列表的序列1中第1-765位核苷酸所示的DNA分子；
(d2)序列表的序列1所示的DNA分子；
(d3)来源于CHO细胞且与(d1)或(d2)具有98％以上同一性且编码IGFBP4蛋白的DNA分子。
以上任一所述Cas13d基因为编码Cas13d蛋白的基因。
Cas13d蛋白为如下(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列5所示的蛋白质；
(e2)来源于CHO细胞且与(e1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
Cas13d基因为如下(f1)或(f2)：
(f1)编码区如序列表的序列2中第2646-5552位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)来源于CHO细胞且与(f1)具有98％以上同一性且编码Cas13d蛋白的DNA分子。
本发明的发明人筛选特定的靶点，设计了特定的sgRNA，通过CRISPR/Cas13d系统有效抑制了CHO细胞中的IGFBP4基因表达，得到了重组CHO细胞。与野生型CHO细胞相比，可极大缩短CHO细胞适应悬浮生长的时间，重组CHO细胞的增殖能力和/或悬浮能力极其显著的提高。所述重组细胞可以作为生物反应器，大大提高生物制品的产量。本发明对于生物制药领域具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为Cas13d-IGFBP4-1质粒的结构示意图。
图2为实施例3中试验第17天的细胞照片。
图3为实施例3中Western Blot的结果图。
图4为实施例3中实时定量PCR检测的结果。
图5为实施例3中各个时间点的细胞浓度统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。无缝连接试剂盒：北京擎科新业生物技术有限公司，货号为TSV-S2。psPAX2质粒：addgene，addgene#12260。VSVG质粒(全称为pCMV-VSV-G)：addgene，addgene#8454。EF1a-CasRx-2A-EGFP质粒：addgene，addgene#109049。lentiCRISPR v2质粒：addgene，addgene#52961。Megatran 1.0转染试剂：ORIGEN，TT200004。CHO细胞：国家生物医学实验细胞资源库。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、重组质粒的构建
一、构建慢病毒表达载体lentiCRISPR-Cas13d-EGFP
1、以EF1a-CasRx-2A-EGFP质粒为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物(约3.8kb)，PCR扩增产物中具有Cas13d蛋白和EGFP蛋白的编码基因。
F1：5'-CAGAACACAGGACCGGTATGAGCCCCAAGAAGAAG-3'；
R1：5'-GTTTGTTGCGCCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCAT-3'。
2、取lentiCRISPR v2质粒，采用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收线性大片段(约8.8kb)。
3、采用无缝连接试剂盒，将步骤1得到的扩增产物和步骤2得到的线性大片段连接，得到环形质粒，即为慢病毒表达载体lentiCRISPR-Cas13d-EGFP，简称lentiCRISPR-Cas13d-EGFP质粒。
二、构建Cas13d-IGFBP4-1质粒和Cas13d-IGFBP4-2质粒
发明人通过分析仓鼠IGFBP4基因序列(如序列表的序列1所示，序列1中编码框为第1-765位)，选择确定了靶向IGFBP4 mRNA的特异性序列。
IGFBP4-1正义链：5'-TGGCTTTATATATCTTCACCAAGTGCTGGTGTGTGGATCGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'；
IGFBP4-1反义链：5'-GCTATTTCTAGCTCTAAAACTGCGATCCACACACCAGCACTTGGTGAAGATATATAAAGCCA-3'。
IGFBP4-2正义链：5'-TGGCTTTATATATCTTCACCGGTCCGAGTCCTGGCTCTCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'；
IGFBP4-2反义链：5'-GCTATTTCTAGCTCTAAAACCAGAGAGCCAGGACTCGGACCGGTGAAGATATATAAAGCCA-3'。
IGFBP4-1正义链、IGFBP4-1反义链、IGFBP4-2正义链和IGFBP4-2反义链均为单链DNA分子。分别合成IGFBP4-1正义链和IGFBP4-1反义链，然后混合并进行退火，得到双链DNA分子，命名为DNA分子IGFBP4-1。分别合成IGFBP4-2正义链和IGFBP4-2反义链，然后混合并进行退火，得到双链DNA分子，命名为DNA分子IGFBP4-2。
取lentiCRISPR-Cas13d-EGFP质粒，用限制性内切酶BsmB I进行酶切，回收线性载体。
采用无缝连接试剂盒，将DNA分子IGFBP4-1与线性载体连接，得到重组质粒lentiCRISPR-Cas13d-EGFP-IGFBP4-1，简称Cas13d-IGFBP4-1质粒。采用无缝连接试剂盒，将DNA分子IGFBP4-2与线性载体连接，得到重组质粒lentiCRISPR-Cas13d-EGFP-IGFBP4-2，简称Cas13d-IGFBP4-2质粒。
经测序，Cas13d-IGFBP4-1质粒的全序列如序列表的序列2所示。与Cas13d-IGFBP4-1质粒相比，Cas13d-IGFBP4-2质粒的差异仅在于将“AAGTGCTGGTGTGTGGATCGCA”替换为了“GGTCCGAGTCCTGGCTCTCTG”。
Cas13d-IGFBP4-1质粒的结构示意图见图1。Cas13d-IGFBP4-1质粒表达序列表的序列3所示的sgRNAIGFBP4-1。Cas13d-IGFBP4-1质粒中，第2646-5552位核苷酸为Cas13d基因(2907bp)，第5688-6404位核苷酸为EGFP基因(717bp)，第6470-7066位核苷酸为PuroR基因(597bp)。
实施例2、利用哺乳动物细胞表达慢病毒，得到重组慢病毒病毒液
1、将293T细胞接种于培养皿(直径为6cm)，采用DMEM培养基培养24h(此时细胞密度为50％-70％，细胞数量约为1×106个)。
2、将1μg Cas13d-IGFBP4-1质粒、0.5μg psPAX2质粒和0.5μg VSVG质粒加至200μL不含血清双抗的DMEM培养基中，振荡混匀，然后加入10μL Megatran 1.0转染试剂，再次振荡混匀，然后室温静置10min。此为1个培养皿的加入量。
3、将步骤2得到的混合液加入至完成步骤1的培养皿中，37℃培养48h。
4、完成步骤3后，收集上清液，即为IGFBP4-1病毒液。
用Cas13d-IGFBP4-2质粒代替Cas13d-IGFBP4-1质粒，依次进行上述步骤1至4，得到IGFBP4-2病毒液。
实施例3、重组CHO细胞的制备和增殖/悬浮性能比较
1、采用DMEM培养基在6cm培养皿中培养CHO细胞，至密度约为60％，每个培养皿中的细胞数量约为1×106个。
2、IGFBP4-1组：完成步骤1后，加入300μL实施例1制备的IGFBP4-1病毒液并培养24小时；然后更换新的DMEM培养基，再加入300μL实施例1制备的IGFBP4-1病毒液并培养24小时；然后采用含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基培养7天(每隔一天更换新的含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基)；然后采用DMEM培养基培养(每隔一天更换新的DMEM培养基)。只有重组CHO细胞才可以在含有嘌呤霉素的培养基中存活，野生型CHO细胞被嘌呤霉素杀死。步骤2中连续计天数，试验第1天第一次加入病毒液，试验第2天第二次加入病毒液，试验第3天至第9天采用含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基培养，试验第10天开始采用DMEM培养基培养。
3、IGFBP4-2组：用IGFBP4-2病毒液代替IGFBP4-1病毒液，其他同IGFBP4-1组。
4、野生型组：不加入病毒液，其他同IGFBP4-1组。
步骤2、3、4为平行操作。
二、每天取样细胞，拍照并统计细胞直径大小。
试验第17天的细胞照片见图2。感染IGFBP4-1病毒液后，得到了具有EGPF荧光的重组CHO细胞，且重组CHO细胞主要为悬浮状态。感染IGFBP4-2病毒液后，得到了具有EGPF荧光的重组CHO细胞，且重组CHO细胞主要为贴壁状态。
三、Western印迹检测
试验第12天，收集细胞。提取细胞总蛋白，进行Western Blot。Western Blot采用的抗体为IGFBP4抗体(Abcam，ab239594)或β-actin抗体(Santa Cruz Biotechnology,sc-47778HRP)。β-actin作为内参。
结果见图3。感染IGFBP4-1病毒液后的重组CHO细胞的全蛋白中基本观察不到IGFBP4蛋白。感染IGFBP4-2病毒液后的重组CHO细胞的全蛋白中的IGFBP4蛋白丰度相对正常CHO细胞无显著差异。
四、逆转录和实时定量PCR检测
试验第12天，收集细胞。提取细胞的总RNA，然后反转录得到cDNA。以cDNA为模板，采用实时定量PCR检测IGFBP4基因的表达水平。以β-actin基因为内参基因。利用2-ΔΔCt公式计算基因的IGFBP4基因的相对表达量。
用于检测IGFBP4基因的引物如下：
上游引物：5'-TCCCAACAACAGCTTCAACC-3'；
下游引物：5'-CTTGCTCCGATCTCGCATTT-3'。
用于检测β-actin基因的引物如下：
上游引物：5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3'；
下游引物：5'-CAATGCCTGGGTACATGGTG-3'。
结果见图4。与正常CHO细胞相比，感染IGFBP4-1病毒液后的重组CHO细胞的IGFBP4基因表达水平极其显著下降，感染IGFBP4-2病毒液后的重组CHO细胞的IGFBP4基因表达水平无显著差异。
五、细胞增殖性能的比较
细胞培养条件均为：置于37℃、5％CO2培养箱中150rpm振荡培养。
SFM4CHO培养基：Thermo Fisher Scientific。
1、IGFBP4-1组细胞的增殖性能
(1)IGFBP4-1组完成步骤一后，收集细胞。
(2)取步骤(1)得到的细胞，进行消化和计数，然后接种至含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105个细胞/mL，然后培养72小时。
(3)完成步骤(2)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(4)取步骤(3)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105个细胞/mL，然后培养至细胞浓度为1×106细胞/mL。
(5)完成步骤(4)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(6)取步骤(5)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105细胞/mL，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养48小时后(试验第2天时间点)细胞浓度达到1.3×106细胞/mL。
(7)步骤(6)中培养48小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(8)取步骤(7)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为3×105细胞/mL，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第5天时间点)细胞浓度达到1.35×106细胞/mL。
(9)步骤(8)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(10)取步骤(9)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为3×105细胞/mL，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第8天时间点)细胞浓度达到1.46×106细胞/mL。
2、IGFBP4-2组细胞的增殖性能
(1)IGFBP4-2组完成步骤一后，收集细胞。
(2)取步骤(1)得到的细胞，进行消化和计数，然后接种至含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105个细胞/mL，然后培养72小时。
(3)完成步骤(2)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(4)取步骤(3)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105个细胞/mL，然后培养至细胞浓度为1×106细胞/mL。
(5)完成步骤(4)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(6)取步骤(5)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105细胞/mL，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第3天时间点)细胞浓度仍未达到1×106细胞/mL。
(7)步骤(6)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(8)取步骤(7)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105细胞/mL，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第6天时间点)细胞浓度仍未达到1×106细胞/mL。
(9)步骤(8)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(10)取步骤(9)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105细胞/mL，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第9天时间点)细胞浓度刚刚达到1×106细胞/mL。
3、野生型组细胞的增殖性能
(1)野生型组完成步骤一后，收集细胞。
(2)取步骤(1)得到的细胞，进行消化和计数，然后接种至含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105个细胞/mL，然后培养72小时。
(3)完成步骤(2)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(4)取步骤(3)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105个细胞/mL，然后培养至细胞浓度为1×106细胞/mL。
(5)完成步骤(4)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(6)取步骤(5)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105细胞/mL，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第3天时间点)细胞浓度仍未达到1×106细胞/mL。
(7)步骤(6)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(8)取步骤(7)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105细胞/mL，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第6天时间点)细胞浓度仍未达到1×106细胞/mL。
(9)步骤(8)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
(10)取步骤(9)得到的细胞，悬浮于30mL含10％FBS的SFM4CHO培养基，使细胞浓度为5×105细胞/mL，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第9天时间点)细胞浓度达到1.23×106细胞/mL。
各组细胞在上述各个步骤中的各个时间点的细胞浓度见图5。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<120> 用于促进CHO细胞悬浮的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO细胞
<130> GNCYX202827
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1873
<212> DNA
<213> Chinese Hamster
<400> 1
atgctgccct tcggcctcgt ggccgccctg ctgctggccg cagggcctcg gccgagcctg 60
ggcgacgaag ccatccactg ccccccctgc tccgaggaga agctggcccg ctgccgcccc 120
cctgtgggtt gcgaggagct ggtgcgggag cctggctgcg gttgttgcgc cacttgtgcc 180
ctgggcttgg ggatgccctg cggggtgtac accccacgct gtggctcagg catgcgctgc 240
taccctcccc ggggagtgga gaaacccctg cgcacactga tgcacgggca aggcgtgtgc 300
acggagctgt cggagatcga ggccatccag gaaagcctgc agtcctctga caaggatgag 360
agcgaccatc ccaacaacag cttcaacccc tgcagtgccc atgatcatag gtgcctgcag 420
aagcatatgg cgaaaatgcg agatcggagc aagatgaagg tggtggggac acctcgggag 480
gagccccgtc ctgtgcccca gggttcctgc cagagcgagc tgcaccgggc cctggagcgg 540
ctggctgcct ctcagagccg gacccaagag gacctagtca tcatccctat tcccaactgt 600
gaccgcaatg gcaacttcca ccccaaacag tgtcaccccg ccctggacgg acaacgtggc 660
aagtgctggt gtgtggatcg caagacaggg gtgaagcttc cagggggctt ggaacccaaa 720
ggggagctgg actgccacca actggctgac agcttccaag agtgaggcct gccagtaggt 780
ggggtcctca gtgctcccta ctaggcccct gtgctctggg ggctgtagag ttgacctggc 840
atggagtttt ggtccgagtc ctggctctct gcctctggcc ctgcccaaag tttcccttga 900
tgtgtatgtg caagtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 960
tttatgggca caaatgtggc ccatggggta agcctgaacc tagagtaccc actatgggcg 1020
tagatagccc aagaggtctg agtgtagcaa caggaagccc cagtatgttt tcaaatcaat 1080
cttgaattca ttcattcatt cattcattca gccatctgaa aacatgtatt ggcaacatac 1140
tacatgccag ctttagtttt cagccctggg aggcctcatt ctaatttcct ctgattgtgg 1200
tagtcctata aagtcaccag agtcctgtag aagagaaacc tcattcttgg aatcagagag 1260
aaagaaaggt gtgaacattg accactctcc ctctcctcaa cctagtcagt gtgggattgt 1320
gtggagtaga agagggcttt aggctcatga gacccacccc cactattatg ccaagctttg 1380
ttctcattcc tcaggttctc cagggggaag agattgaggg acagggccca tctttgggtc 1440
tgggtattgg gttaccttgc agatggagct ctgctgtggg agaggaatgg ggtcagagga 1500
aggcctgaag ggcagggagt caggagagaa gagaggatgc aggattgggt tgtatgtgtc 1560
tgatggagag gaggacacgt gtgctggggg atgaggagct gatgaggtcc tgtcctgggt 1620
cctaattgtg gtctctggtc atgacgtcac cgggatgacc ctacctttcc agctgcccac 1680
tgcctgtggc cctgcctgcc tccctgtatc ccccttccat cacaactgtc ccacccactc 1740
taccctcctg ggcattttct ggcttgcctg gatagactta gagacctgct tgttggctgt 1800
gatgtctttt cattcatttt ttttcttttt ttaaaaaaac aaaacagaac aaaaccaaaa 1860
agtgtccaga taa 1873
<210> 2
<211> 12608
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 60
caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 120
ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180
gggaggtcta tataagcagc gcgttttgcc tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc 240
tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg 300
ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc 360
ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga 420
aagcgaaagg gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca 480
cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct 540
agaaggagag agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat 600
gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat 660
gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag 720
gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta 780
gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag 840
acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac 900
agcaagcggc cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt 960
gaattatata aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca 1020
aagagaagag tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg 1080
ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc 1140
agacaattat tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg 1200
caacagcatc tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg 1260
gctgtggaaa gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa 1320
ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag 1380
atttggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta 1440
atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg 1500
gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat 1560
ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta 1620
ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc 1680
ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac 1740
agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tcggcactgc gtgcgccaat tctgcagaca 1800
aatggcagta ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg 1860
ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat 1920
tacaaaaatt caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggttaat 1980
taaggtaccg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 2040
gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 2100
tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 2160
gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttc 2220
accaagtgct ggtgtgtgga tcgcagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 2280
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttgaa ttcgctagct 2340
aggtcttgaa aggagtggga attggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc 2400
ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg atccggtgcc tagagaaggt 2460
ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg 2520
ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg 2580
ccgccagaac acaggaccgg ttctagagcg ctgccaccat gagccccaag aagaagagaa 2640
aggtggaggc cagcatcgaa aaaaaaaagt ccttcgccaa gggcatgggc gtgaagtcca 2700
cactcgtgtc cggctccaaa gtgtacatga caaccttcgc cgaaggcagc gacgccaggc 2760
tggaaaagat cgtggagggc gacagcatca ggagcgtgaa tgagggcgag gccttcagcg 2820
ctgaaatggc cgataaaaac gccggctata agatcggcaa cgccaaattc agccatccta 2880
agggctacgc cgtggtggct aacaaccctc tgtatacagg acccgtccag caggatatgc 2940
tcggcctgaa ggaaactctg gaaaagaggt acttcggcga gagcgctgat ggcaatgaca 3000
atatttgtat ccaggtgatc cataacatcc tggacattga aaaaatcctc gccgaataca 3060
ttaccaacgc cgcctacgcc gtcaacaata tctccggcct ggataaggac attattggat 3120
tcggcaagtt ctccacagtg tatacctacg acgaattcaa agaccccgag caccataggg 3180
ccgctttcaa caataacgat aagctcatca acgccatcaa ggcccagtat gacgagttcg 3240
acaacttcct cgataacccc agactcggct atttcggcca ggcctttttc agcaaggagg 3300
gcagaaatta catcatcaat tacggcaacg aatgctatga cattctggcc ctcctgagcg 3360
gactgaggca ctgggtggtc cataacaacg aagaagagtc caggatctcc aggacctggc 3420
tctacaacct cgataagaac ctcgacaacg aatacatctc caccctcaac tacctctacg 3480
acaggatcac caatgagctg accaactcct tctccaagaa ctccgccgcc aacgtgaact 3540
atattgccga aactctggga atcaaccctg ccgaattcgc cgaacaatat ttcagattca 3600
gcattatgaa agagcagaaa aacctcggat tcaatatcac caagctcagg gaagtgatgc 3660
tggacaggaa ggatatgtcc gagatcagga aaaatcataa ggtgttcgac tccatcagga 3720
ccaaggtcta caccatgatg gactttgtga tttataggta ttacatcgaa gaggatgcca 3780
aggtggctgc cgccaataag tccctccccg ataatgagaa gtccctgagc gagaaggata 3840
tctttgtgat taacctgagg ggctccttca acgacgacca gaaggatgcc ctctactacg 3900
atgaagctaa tagaatttgg agaaagctcg aaaatatcat gcacaacatc aaggaattta 3960
ggggaaacaa gacaagagag tataagaaga aggacgcccc tagactgccc agaatcctgc 4020
ccgctggccg tgatgtttcc gccttcagca aactcatgta tgccctgacc atgttcctgg 4080
atggcaagga gatcaacgac ctcctgacca ccctgattaa taaattcgat aacatccaga 4140
gcttcctgaa ggtgatgcct ctcatcggag tcaacgctaa gttcgtggag gaatacgcct 4200
ttttcaaaga ctccgccaag atcgccgatg agctgaggct gatcaagtcc ttcgctagaa 4260
tgggagaacc tattgccgat gccaggaggg ccatgtatat cgacgccatc cgtattttag 4320
gaaccaacct gtcctatgat gagctcaagg ccctcgccga caccttttcc ctggacgaga 4380
acggaaacaa gctcaagaaa ggcaagcacg gcatgagaaa tttcattatt aataacgtga 4440
tcagcaataa aaggttccac tacctgatca gatacggtga tcctgcccac ctccatgaga 4500
tcgccaaaaa cgaggccgtg gtgaagttcg tgctcggcag gatcgctgac atccagaaaa 4560
aacagggcca gaacggcaag aaccagatcg acaggtacta cgaaacttgt atcggaaagg 4620
ataagggcaa gagcgtgagc gaaaaggtgg acgctctcac aaagatcatc accggaatga 4680
actacgacca attcgacaag aaaaggagcg tcattgagga caccggcagg gaaaacgccg 4740
agagggagaa gtttaaaaag atcatcagcc tgtacctcac cgtgatctac cacatcctca 4800
agaatattgt caatatcaac gccaggtacg tcatcggatt ccattgcgtc gagcgtgatg 4860
ctcaactgta caaggagaaa ggctacgaca tcaatctcaa gaaactggaa gagaagggat 4920
tcagctccgt caccaagctc tgcgctggca ttgatgaaac tgcccccgat aagagaaagg 4980
acgtggaaaa ggagatggct gaaagagcca aggagagcat tgacagcctc gagagcgcca 5040
accccaagct gtatgccaat tacatcaaat acagcgacga gaagaaagcc gaggagttca 5100
ccaggcagat taacagggag aaggccaaaa ccgccctgaa cgcctacctg aggaacacca 5160
agtggaatgt gatcatcagg gaggacctcc tgagaattga caacaagaca tgtaccctgt 5220
tcagaaacaa ggccgtccac ctggaagtgg ccaggtatgt ccacgcctat atcaacgaca 5280
ttgccgaggt caattcctac ttccaactgt accattacat catgcagaga attatcatga 5340
atgagaggta cgagaaaagc agcggaaagg tgtccgagta cttcgacgct gtgaatgacg 5400
agaagaagta caacgatagg ctcctgaaac tgctgtgtgt gcctttcggc tactgtatcc 5460
ccaggtttaa gaacctgagc atcgaggccc tgttcgatag gaacgaggcc gccaagttcg 5520
acaaggagaa aaagaaggtg tccggcaatt ccggatccgg acctaagaaa aagaggaagg 5580
tggcggccgc ttacccatac gatgttccag attacgctgc tagcggcagt ggagagggca 5640
gaggaagtct gctaacatgc ggtgacgtcg aggagaatcc tggcccagtg agcaagggcg 5700
aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc 5760
acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga 5820
agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga 5880
cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca 5940
agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca 6000
actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc 6060
tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact 6120
acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact 6180
tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga 6240
acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 6300
ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 6360
ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaagatccg gcgcaacaaa 6420
cttctctctg ctgaaacaag ccggagatgt cgaagagaat cctggaccga ccgagtacaa 6480
gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6540
cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6600
ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6660
ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6720
ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6780
gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6840
ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6900
ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6960
ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 7020
cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 7080
caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 7140
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 7200
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 7260
gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 7320
tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7380
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7440
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7500
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7560
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7620
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7680
agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7740
ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7800
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7860
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7920
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7980
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 8040
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 8100
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 8160
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 8220
gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc tctagggggt atccccacgc 8280
gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 8340
acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 8400
cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc 8460
tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc 8520
gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 8580
cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg 8640
gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 8700
gaattaattc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 8760
ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca 8820
ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc 8880
ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 8940
catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc ctctgagcta 9000
ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctcccggga 9060
gcttgtatat ccattttcgg atctgatcag cacgtgttga caattaatca tcggcatagt 9120
atatcggcat agtataatac gacaaggtga ggaactaaac catggccaag ttgaccagtg 9180
ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt cgagttctgg accgaccggc 9240
tcgggttctc ccgggacttc gtggaggacg acttcgccgg tgtggtccgg gacgacgtga 9300
ccctgttcat cagcgcggtc caggaccagg tggtgccgga caacaccctg gcctgggtgt 9360
gggtgcgcgg cctggacgag ctgtacgccg agtggtcgga ggtcgtgtcc acgaacttcc 9420
gggacgcctc cgggccggcc atgaccgaga tcggcgagca gccgtggggg cgggagttcg 9480
ccctgcgcga cccggccggc aactgcgtgc acttcgtggc cgaggagcag gactgacacg 9540
tgctacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt 9600
tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc 9660
accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 9720
tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 9780
tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat 9840
agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 9900
gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 9960
gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 10020
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 10080
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 10140
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 10200
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 10260
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 10320
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 10380
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 10440
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 10500
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 10560
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 10620
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 10680
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 10740
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 10800
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 10860
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 10920
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 10980
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 11040
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 11100
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 11160
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 11220
tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 11280
ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 11340
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 11400
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 11460
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 11520
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 11580
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 11640
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 11700
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 11760
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 11820
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 11880
gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 11940
ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtcgacggat 12000
cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 12060
gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt gcgcgagcaa 12120
aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc tgcttagggt 12180
taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt 12240
gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt 12300
ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 12360
attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 12420
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 12480
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 12540
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 12600
taccatgg 12608
<210> 3
<211> 98
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagugcuggu guguggaucg caguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugc 98
<210> 4
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Chinese Hamster)
<400> 4
Met Leu Pro Phe Gly Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Gly Pro
1 5 10 15
Arg Pro Ser Leu Gly Asp Glu Ala Ile His Cys Pro Pro Cys Ser Glu
20 25 30
Glu Lys Leu Ala Arg Cys Arg Pro Pro Val Gly Cys Glu Glu Leu Val
35 40 45
Arg Glu Pro Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Leu Gly Leu Gly
50 55 60
Met Pro Cys Gly Val Tyr Thr Pro Arg Cys Gly Ser Gly Met Arg Cys
65 70 75 80
Tyr Pro Pro Arg Gly Val Glu Lys Pro Leu Arg Thr Leu Met His Gly
85 90 95
Gln Gly Val Cys Thr Glu Leu Ser Glu Ile Glu Ala Ile Gln Glu Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Ser Asp Lys Asp Glu Ser Asp His Pro Asn Asn Ser Phe
115 120 125
Asn Pro Cys Ser Ala His Asp His Arg Cys Leu Gln Lys His Met Ala
130 135 140
Lys Met Arg Asp Arg Ser Lys Met Lys Val Val Gly Thr Pro Arg Glu
145 150 155 160
Glu Pro Arg Pro Val Pro Gln Gly Ser Cys Gln Ser Glu Leu His Arg
165 170 175
Ala Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gln Ser Arg Thr Gln Glu Asp Leu
180 185 190
Val Ile Ile Pro Ile Pro Asn Cys Asp Arg Asn Gly Asn Phe His Pro
195 200 205
Lys Gln Cys His Pro Ala Leu Asp Gly Gln Arg Gly Lys Cys Trp Cys
210 215 220
Val Asp Arg Lys Thr Gly Val Lys Leu Pro Gly Gly Leu Glu Pro Lys
225 230 235 240
Gly Glu Leu Asp Cys His Gln Leu Ala Asp Ser Phe Gln Glu
245 250
<210> 5
<211> 969
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ala Ser Ile Glu Lys Lys Lys Ser Phe Ala Lys Gly Met Gly Val
1 5 10 15
Lys Ser Thr Leu Val Ser Gly Ser Lys Val Tyr Met Thr Thr Phe Ala
20 25 30
Glu Gly Ser Asp Ala Arg Leu Glu Lys Ile Val Glu Gly Asp Ser Ile
35 40 45
Arg Ser Val Asn Glu Gly Glu Ala Phe Ser Ala Glu Met Ala Asp Lys
50 55 60
Asn Ala Gly Tyr Lys Ile Gly Asn Ala Lys Phe Ser His Pro Lys Gly
65 70 75 80
Tyr Ala Val Val Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Thr Gly Pro Val Gln Gln
85 90 95
Asp Met Leu Gly Leu Lys Glu Thr Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Gly Glu
100 105 110
Ser Ala Asp Gly Asn Asp Asn Ile Cys Ile Gln Val Ile His Asn Ile
115 120 125
Leu Asp Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Tyr Ile Thr Asn Ala Ala Tyr
130 135 140
Ala Val Asn Asn Ile Ser Gly Leu Asp Lys Asp Ile Ile Gly Phe Gly
145 150 155 160
Lys Phe Ser Thr Val Tyr Thr Tyr Asp Glu Phe Lys Asp Pro Glu His
165 170 175
His Arg Ala Ala Phe Asn Asn Asn Asp Lys Leu Ile Asn Ala Ile Lys
180 185 190
Ala Gln Tyr Asp Glu Phe Asp Asn Phe Leu Asp Asn Pro Arg Leu Gly
195 200 205
Tyr Phe Gly Gln Ala Phe Phe Ser Lys Glu Gly Arg Asn Tyr Ile Ile
210 215 220
Asn Tyr Gly Asn Glu Cys Tyr Asp Ile Leu Ala Leu Leu Ser Gly Leu
225 230 235 240
Arg His Trp Val Val His Asn Asn Glu Glu Glu Ser Arg Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Trp Leu Tyr Asn Leu Asp Lys Asn Leu Asp Asn Glu Tyr Ile Ser
260 265 270
Thr Leu Asn Tyr Leu Tyr Asp Arg Ile Thr Asn Glu Leu Thr Asn Ser
275 280 285
Phe Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Val Asn Tyr Ile Ala Glu Thr Leu
290 295 300
Gly Ile Asn Pro Ala Glu Phe Ala Glu Gln Tyr Phe Arg Phe Ser Ile
305 310 315 320
Met Lys Glu Gln Lys Asn Leu Gly Phe Asn Ile Thr Lys Leu Arg Glu
325 330 335
Val Met Leu Asp Arg Lys Asp Met Ser Glu Ile Arg Lys Asn His Lys
340 345 350
Val Phe Asp Ser Ile Arg Thr Lys Val Tyr Thr Met Met Asp Phe Val
355 360 365
Ile Tyr Arg Tyr Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Lys Val Ala Ala Ala Asn
370 375 380
Lys Ser Leu Pro Asp Asn Glu Lys Ser Leu Ser Glu Lys Asp Ile Phe
385 390 395 400
Val Ile Asn Leu Arg Gly Ser Phe Asn Asp Asp Gln Lys Asp Ala Leu
405 410 415
Tyr Tyr Asp Glu Ala Asn Arg Ile Trp Arg Lys Leu Glu Asn Ile Met
420 425 430
His Asn Ile Lys Glu Phe Arg Gly Asn Lys Thr Arg Glu Tyr Lys Lys
435 440 445
Lys Asp Ala Pro Arg Leu Pro Arg Ile Leu Pro Ala Gly Arg Asp Val
450 455 460
Ser Ala Phe Ser Lys Leu Met Tyr Ala Leu Thr Met Phe Leu Asp Gly
465 470 475 480
Lys Glu Ile Asn Asp Leu Leu Thr Thr Leu Ile Asn Lys Phe Asp Asn
485 490 495
Ile Gln Ser Phe Leu Lys Val Met Pro Leu Ile Gly Val Asn Ala Lys
500 505 510
Phe Val Glu Glu Tyr Ala Phe Phe Lys Asp Ser Ala Lys Ile Ala Asp
515 520 525
Glu Leu Arg Leu Ile Lys Ser Phe Ala Arg Met Gly Glu Pro Ile Ala
530 535 540
Asp Ala Arg Arg Ala Met Tyr Ile Asp Ala Ile Arg Ile Leu Gly Thr
545 550 555 560
Asn Leu Ser Tyr Asp Glu Leu Lys Ala Leu Ala Asp Thr Phe Ser Leu
565 570 575
Asp Glu Asn Gly Asn Lys Leu Lys Lys Gly Lys His Gly Met Arg Asn
580 585 590
Phe Ile Ile Asn Asn Val Ile Ser Asn Lys Arg Phe His Tyr Leu Ile
595 600 605
Arg Tyr Gly Asp Pro Ala His Leu His Glu Ile Ala Lys Asn Glu Ala
610 615 620
Val Val Lys Phe Val Leu Gly Arg Ile Ala Asp Ile Gln Lys Lys Gln
625 630 635 640
Gly Gln Asn Gly Lys Asn Gln Ile Asp Arg Tyr Tyr Glu Thr Cys Ile
645 650 655
Gly Lys Asp Lys Gly Lys Ser Val Ser Glu Lys Val Asp Ala Leu Thr
660 665 670
Lys Ile Ile Thr Gly Met Asn Tyr Asp Gln Phe Asp Lys Lys Arg Ser
675 680 685
Val Ile Glu Asp Thr Gly Arg Glu Asn Ala Glu Arg Glu Lys Phe Lys
690 695 700
Lys Ile Ile Ser Leu Tyr Leu Thr Val Ile Tyr His Ile Leu Lys Asn
705 710 715 720
Ile Val Asn Ile Asn Ala Arg Tyr Val Ile Gly Phe His Cys Val Glu
725 730 735
Arg Asp Ala Gln Leu Tyr Lys Glu Lys Gly Tyr Asp Ile Asn Leu Lys
740 745 750
Lys Leu Glu Glu Lys Gly Phe Ser Ser Val Thr Lys Leu Cys Ala Gly
755 760 765
Ile Asp Glu Thr Ala Pro Asp Lys Arg Lys Asp Val Glu Lys Glu Met
770 775 780
Ala Glu Arg Ala Lys Glu Ser Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ala Asn Pro
785 790 795 800
Lys Leu Tyr Ala Asn Tyr Ile Lys Tyr Ser Asp Glu Lys Lys Ala Glu
805 810 815
Glu Phe Thr Arg Gln Ile Asn Arg Glu Lys Ala Lys Thr Ala Leu Asn
820 825 830
Ala Tyr Leu Arg Asn Thr Lys Trp Asn Val Ile Ile Arg Glu Asp Leu
835 840 845
Leu Arg Ile Asp Asn Lys Thr Cys Thr Leu Phe Arg Asn Lys Ala Val
850 855 860
His Leu Glu Val Ala Arg Tyr Val His Ala Tyr Ile Asn Asp Ile Ala
865 870 875 880
Glu Val Asn Ser Tyr Phe Gln Leu Tyr His Tyr Ile Met Gln Arg Ile
885 890 895
Ile Met Asn Glu Arg Tyr Glu Lys Ser Ser Gly Lys Val Ser Glu Tyr
900 905 910
Phe Asp Ala Val Asn Asp Glu Lys Lys Tyr Asn Asp Arg Leu Leu Lys
915 920 925
Leu Leu Cys Val Pro Phe Gly Tyr Cys Ile Pro Arg Phe Lys Asn Leu
930 935 940
Ser Ile Glu Ala Leu Phe Asp Arg Asn Glu Ala Ala Lys Phe Asp Lys
945 950 955 960
Glu Lys Lys Lys Val Ser Gly Asn Ser
965

Claims (3)

1.用于抑制IGFBP4基因表达的物质的应用，为如下(Ⅱ)和/或(Ⅲ)：
(Ⅱ)促进CHO细胞悬浮；
(Ⅲ)促进CHO细胞由贴壁细胞向悬浮细胞转化；
所述抑制IGFBP4基因表达的物质为CRISPR-Cas13d系统；
所述CRISPR-Cas13d系统为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：
(b1)包括特异sgRNA和Cas13d蛋白；所述sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至22位核苷酸所示；
(b2)包括特异DNA分子和Cas13d基因；所述特异DNA分子转录得到所述特异sgRNA；
(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒和具有Cas13d基因的质粒；
(b4)包括特异重组质粒；所述特异重组质粒，其表达所述sgRNA和Cas13d蛋白；
(b5)包括特异重组慢病毒，其为表达所述sgRNA和Cas13d蛋白的重组慢病毒。
2.一种促进CHO细胞悬浮的方法，包括如下步骤：在CHO细胞中导入抑制IGFBP4基因表达的物质；所述抑制IGFBP4基因表达的物质为CRISPR-Cas13d系统；
所述CRISPR-Cas13d系统为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：
(b1)包括特异sgRNA和Cas13d蛋白；所述sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至22位核苷酸所示；
(b2)包括特异DNA分子和Cas13d基因；所述特异DNA分子转录得到所述特异sgRNA；
(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒和具有Cas13d基因的质粒；
(b4)包括特异重组质粒；所述特异重组质粒，其表达所述sgRNA和Cas13d蛋白；
(b5)包括特异重组慢病毒，其为表达所述sgRNA和Cas13d蛋白的重组慢病毒。
3.一种促进CHO细胞由贴壁细胞向悬浮细胞转化的方法，包括如下步骤：在CHO细胞中导入抑制IGFBP4基因表达的物质；所述抑制IGFBP4基因表达的物质为CRISPR-Cas13d系统；
所述CRISPR-Cas13d系统为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：
(b1)包括特异sgRNA和Cas13d蛋白；所述sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至22位核苷酸所示；
(b2)包括特异DNA分子和Cas13d基因；所述特异DNA分子转录得到所述特异sgRNA；
(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒和具有Cas13d基因的质粒；
(b4)包括特异重组质粒；所述特异重组质粒，其表达所述sgRNA和Cas13d蛋白；
(b5)包括特异重组慢病毒，其为表达所述sgRNA和Cas13d蛋白的重组慢病毒。
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