KR102247462B1 - 리보플라빈 생성능이 향상된 재조합 유산균 - Google Patents

Abstract

본 발명은 folE 유전자 또는 ribF 유전자가 넉아웃(kmock out) 되거나, folE 유전자 및 ribF 유전자가 넉아웃(kmock out)된 리보플라빈 생성능이 증가된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주 및 상기 재조합 류코노스톡 시트륨 균주를 이용한 리보플라빈의 제조방법에 관한 것이다.

Description

리보플라빈 생성능이 향상된 재조합 유산균{Recombinant Lactic acid bacteria having enhanced Productivity for Riboflavin}

본 발명은 리보플라빈 생성능이 향상된 재조합 유산균에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 folE 유전자 또는 ribF 유전자가 넉아웃(kmock out) 되거나, folE 유전자 및 ribF 유전자가 넉아웃(kmock out)된 리보플라빈 생성능이 증가된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주 및 상기 재조합 류코노스톡 시트륨 균주를 이용한 리보플라빈의 제조방법에 관한 것이다.

유산균(Lactic acid bacteria)은 포도당 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 젖산 발효에 의해 생산되는 젖산에 의해 주변에 존재하는 유해 세균 또는 병원균의 생육을 저하시키는 성질을 가지고 있어 유제품과 같은 발효식품 등의 제조에 이용되고 있다. 또한 유산균은 포유류의 장내에 서식하여 다양한 면역반응 조절에 관여하여 염증반응을 억제하여 장내 환경을 개선하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 따라서 최근 유산균을 이용한 프로바이오틱스(Probiotics) 또는 프리바이오틱스(Prebiotics) 산업이 큰 주목을 받고 있다.

김치는 한국의 전통발효식품으로서 배추나 무를 주원료로 다양한 향신료를 첨가하여 발효시킨 것으로, 발효되는 동안 유산균 등의 의해 다양한 물질이 생성되어 독특한 맛과 향을 지닐 뿐만 아니라, 인체 내에서 여러 기능성을 가지는 것으로 보고되고 있다. 따라서 김치로부터 유용성 있는 기능을 가지는 새로운 유산균을 분리하는 많은 연구가 진행되고 있다.

상기 유산균 중 류코노스톡 시트륨 (Leuconostoc citreum)은 이상젖산발효균 (heterofermentive lactic acid bacteria)으로 김치의 초기-중기 발효에서 나타나는 우점균 중 하나이며, 젖산, 만니톨, 아세트산 및 다양한 대사물질을 생산하여 김치의 독특한 맛과 향을 내는데 기여할뿐만 아니라 인체 내에서 장출혈성 대장균의 생장을 억제하고 배변활동에 도움을 주며 최근에는 관절염 저감과 같은 약리적 기능을 수행하는 것으로 보고되고 있다(Koo, Ok Kyung et al., , J. Kor. Soci. for Appl. Biol. Chem. 58.6:831, 2015). 이에 상기 유산균 류코노스톡 시트륨 (L. citreum)의 유익한 특성을 극대화하기 위한 개량 연구가 지속적으로 이루어지고 있으나 해당 유산균에 가용한 합성생물학 및 유전공학 도구가 부족한 실정이다.

리보플라빈(riboflavin)은 비타민 B2라 불리며, 포유동물 내 대사에 중요한 역할을 수행하는 필수조효소로, 탄수화물, 단백질, 지방 등이 산화되어 에너지를 발생할 때 작용하는 효소의 작용을 도와주는 기능을 하며, 결핍 증세로는 구각염, 구순염, 설염, 지루성 피부염, 안구건조증, 안구 충혈, 백내장, 빈혈 등이있으며, 리보플라빈의 생화학적인 결핍증은 알코올 중독자, 당뇨병 환자, 간질 환자, 빈곤층 노인과 청소년, 경구피임약을 복용하는 여성에서 발견되고 있다. 따라서, 리보플라빈을 다량으로 생성하는 유산균을 섭취하면 이러한 결핍증을 예방할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 리보플라빈 생성능이 향상된 유산균을 개발하고자 예의 노력한 결과, 김치유산균인 류코노스톡 시트륨 (L. citreum)에서 크리스퍼 간섭기술을 이용하여, 리보플라빈 생합성 경로를 조절한 재조합 류코노스톡 시트륨이, 높은 리브플라빈 생성능을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 리보플라빈 생성능이 향상된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리보플라빈 생성능이 향상된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 리보플라빈 생성능이 향상된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주를 이용한 리보플라빈의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 크리스퍼 간섭 기술을 이용하여 류코노스톡 시트륨 균주에서 타겟 유전자를 넉아웃시키는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 folE 유전자 또는 ribF 유전자가 넉아웃(kmock out) 되거나, folE 유전자 및 ribF 유전자가 넉아웃(kmock out)된 리보플라빈 생성능이 증가된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, 류코노스톡 시트륨 균주에서 folE 유전자 또는 ribF 유전자를 넉아웃시키는단계를 포함하는 리보플라빈 생성능이 증가된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 류코노스톡 시트륨 균주를 배양하여 리보플라빈을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 리보플라빈을 수득하는 단계를 포함하는 리보플라빈의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 11로 표시되는 P710 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 SD 서열 및 서열번호 9로 표시되는 SD2 서열을 포함하는 바이시스트로닉 구조체와 타겟 유전자에 대한 가이드 RNA 서열 및 dCas9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여, 크리스퍼 간섭 기술로 류코노스톡 시트륨 균주에서 타겟 유전자를 넉아웃시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 11로 표시되는 P710 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 SD 서열 및 서열번호 9로 표시되는 SD2 서열을 포함하는 류코노스톡 시트륨 발현용 바이시스트로닉 구조체를 제공한다.

본 발명에 따르면 크리스퍼 간섭(CRISPR interference) 기술을 통해 리보플라빈(riboflavin)을 과량 생산하는 재조합 유산균을 제조할 수 있어, 프로바이오틱스로 사용할 수 있는 김치유래 유산균의 리보플라빈 생성을 향상시킬 수 있다.

도 1은 류코노스톡 시트륨(L. citreum)에서의 sfGFP 유전자를 타겟으로 한 크리스퍼 간섭(CRISPR interference) 발현 시스템의 모식도이다.
도 2는 sfGFP 유전자를 타겟으로 한 크리스퍼 간섭 발현 시스템이 도입된 벡터 형질전환체에서의 녹색형광단백질 발현양을 FACS 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 sfGFP 유전자를 타겟으로 한 크리스퍼 간섭(CRISPR interference) 발현 시스템이 도입된 벡터 형질전환체에서의 녹색형광단백질 (sfGFP) 전사량을 qRT-PCR 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 a는 바이시스트로닉 발현 시스템(bicistronic expression system) 도입으로 dCas9 단백질의 발현량의 변화를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. b는 바이시스트로닉 발현 시스템(bicistronic expression system) 도입을 통한 dCas9 단백질 발현량의 변화에 따른 세포 생장률을 분석한 결과룰 너터냔 곳아더,
도 5는 바이시스트로닉 발현 시스템(bicistronic expression system) 도입을 통한 dCas9 단백질의 단독 발현량의 변화에 의한 녹색형광 단백질(sfGFP)의 전사량 변화를 qRT-PCR (Reverse transcriptase PCR) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 류코노스톡 시트륨(L. citreum)에서의 리보플라빈(riboflavin) 합성 경로에 대한 모식도이다.
도 7은 류코노스톡 시트륨(L. citreum)에서 folE 유전자와 ribF 유전자를 타겟하는 크리스퍼 간섭 발현 시스템을 도입한 벡터 형질전환체에서의 두 유전자 전사 억제 효과를 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 folE 유전자와 ribF 유전자를 타겟하는 크리스퍼 간섭발현 시스템을 도입한 벡터 형질전환체에서의 리보플라빈 생성량을 HPLC 분석한 결과이다.
도 9는 folE 유전자와 ribF 유전자를 타겟하는 크리스퍼 간섭 발현 시스템에 ribo operon 발현 시스템을 추가적으로 도입한 벡터 형질전환체에서의 리보플라빈 생성량을 HPLC 분석한 결과이다.

본 발명에서는 김치유래 유산균인 류코노스톡 시트륨에서 리보플라빈 생성능을 향상시키기 위하여, 류코노스톡 시트륨의 리보플라빈 대사회로에서, 리보플라빈의 축적을 방해하는 유전자인 GTP cyclohydrolase효소를 암호화하는 folE 유전자와 합성된 리보플라빈 (Riboflavin)의 FMN (Flavin mononucleotide) 전환 효소를 암호화하는 ribF 유전자를 크리스퍼 간섭 기술을 사용하여 넉아웃시켰다. 아울러, 리보플라빈 합성에 관여하는 효소 집합체인 리보 오페론(ribo operon)을 추가적으로 도입하여, 리보플라빈 생성능을 현저히 향상시킨 재조합 류코노스톡 시트륨을 제작하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, folE 유전자 또는 ribF 유전자가 넉아웃(kmock out) 되거나, folE 유전자 및 ribF 유전자가 넉아웃(kmock out)된 리보플라빈 생성능이 증가된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 ribD 유전자, ribE유전자, ribA 유전자 및 ribH 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, ribD 유전자, ribE유전자, ribA 유전자 및 ribH 유전자로 구성된 리보 오페론(ribo operon)이 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 류코노스톡 시트륨 균주에서 folE 유전자 또는 ribF 유전자를 넉아웃시키는단계를 포함하는 리보플라빈 생성능이 증가된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 넉아웃은 크리스퍼 간섭 기술을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 서열번호 13으로 표시되는 ribF 유전자 타겟팅을 위한 가이드 RNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 서열번호 14로 표시되는 folE 유전자 타겟팅을 위한 가이드 RNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 크리스퍼 간섭기술은 dCas9 유전자를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 크리스퍼 간섭기술은 서열번호 11로 표시되는 P710 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 SD 서열 및 서열번호 9로 표시되는 SD2 서열을 가지는 바이시스트로닉 시스템을 이용하여 dCas9을 발현시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, ribD 유전자, ribE유전자, ribA 유전자 및 ribH 유전자로 구성된 리보 오페론(ribo operon)을 추가로 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 류코노스톡 시트륨 균주를 배양하여 리보플라빈을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 리보플라빈을 수득하는 단계를 포함하는 리보플라빈의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일양태에서는 크리스퍼 간섭 발현 시스템이 도입된 형질전환체는 야생 균주에 비해 세포 성장률이 떨어지는 문제와 dCas9 유전자만이 형질전환되었을 때 목적 유전자의 발현이 증가하는 현상을 확인하였고 이를 개선하기 위하여, 다양한 세기의 프로모터와 SD서열 (Shine-Dalgarno sequence)의 조합을 통한 바이시스트로닉 발현 시스템 (bicistronic expression system)을 포함하는 벡터를 도입하여 dCas9 단백질의 발현양을 조절하였다. 바이시스트로닉 발현시스템은 목적 단백질의 올바른 발현을 위해 하나의 프로모터 바로 뒤 리보솜에 의한 번역이 원할하게 될 수 있는 SD서열을 붙이고 (1^st cistron) 그 뒤에 번역의 세기를 조절할 수 있는 두번째 SD서열 (2^nd cistron)을 붙여서 사용하였으며, 사용한 하기 바이시스트로닉 발현 시스템은 총 4가지 중 D4를 사용하였을 때, 균주 성장능이 회복되고, 타겟 단백질의 이상 발현이 완화되는 것을 확인하였다.

D1: P710V4 프로모터(강한프로모터)/SD1/강한세기 2^nd cistron SD서열 (이하 명칭 eSD2)

D2: P710V4 프로모터/SD1/약한세기 2^nd cistron SD서열 (이하 명칭 SD2)

D3: P710프로모터(약한 프로모터)/SD1/eSD2

D4: P710프로모터/SD1/SD2

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 11로 표시되는 P710 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 SD 서열 및 서열번호 9로 표시되는 SD2 서열을 포함하는 바이시스트로닉 구조체와 타겟 유전자에 대한 가이드 RNA 서열 및 dCas9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여, 크리스퍼 간섭 기술로 류코노스톡 시트륨 균주에서 타겟 유전자를 넉아웃시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 11로 표시되는 P710 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 SD 서열 및 서열번호 9로 표시되는 SD2 서열을 포함하는 류코노스톡 시트륨 발현용 바이시스트로닉 구조체에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 "유전자 넉 아웃" 또는 "넉 아웃"이라는 용어는 "넉 아웃된" 유전자의 발현을 감소시키는 임의의 유전자 변형을 지칭할 수 있다. 발현 감소는 발현하지 않는 것을 포함할 수 있다. 유전자 변형은 게놈 파괴를 포함할 수 있다.

원에서 사용되는 바, "유전자 편집" 및 그의 문법적 등가물은 하나 이상의 뉴클레오티드가 삽입되거나, 대체되거나, 또는 게놈으로부터 제거되는 유전적 조작을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집은 뉴클레아제(예컨대, 자연적으로 존재하는 뉴클레아제 또는 인공적으로 조작된 뉴클레아제)를 사용하여 수행될 수 있다.

유전자의 발현 수준은 다양한 정도로 감소될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현은 100%만큼 또는 약 100%만큼 감소될 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 정상 발현, 예컨대, 비변형된 대조군의 발현과 비교하여, 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50%만큼 또는 약 99%, 95%,90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50%만큼 감소될 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 정상 발현, 예컨대, 비변형된 대조군의 발현과 비교하여, 적어도 또는 적어도 약 99% 내지 90%; 89% 내지 80%, 79% 내지 70%; 69% 내지 60%; 59% 내지 50%만큼 감소될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현은 정상 발현, 예컨대, 비변형된 대조군의 발현과 비교하여, 적어도 또는 적어도 약 90%만큼, 또는 적어도 또는 적어도 약 90% 내지 99%만큼 감소될 수 있다.

본 발명에서 유전자 발현은 PCR, 실시간 PCR(예컨대, Sybr-green), 및/또는 핫(hot) PCR을 포함하나, 이에 제한되지 않는 정량적 PCR(qPCR: quantitative PCR)과 같은 임의의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 유전자의 전사체의 수준을 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현은 노던 블롯팅, 뉴클레아제 보호 분석(예컨대, RN아제 보호 분석), 역전사 PCR, 정량적 PCR(예컨대, 실시간 PCR, 예컨대, 실시간 정량적 역전사 PCR), 동소 하이브리드화(예컨대, 형광 동소 하이브리드화(FISH)), 도트 블롯 분석, 차등 디스플레이, 유전자 발현의 연속 분석, 감산 하이브리드화, 마이크로어레이, 나노스트링, 및/또는 시퀀싱(예컨대, 차세대 시퀀싱)에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준을 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현은 단백질 면역염색, 단백질 면역침전, 전기영동(예컨대, SDS-PAGE), 웨스턴 블롯팅, 비신코닌산 검정법, 분광광도법, 질량 분석법, 효소 검정법(예컨대, 효소 결합 면역흡착 검정법), 면역조직화학법, 유세포 분석법, 및/또는 면역세포화학법에 의해 측정될 수 있다. 하나 이상의 유전자의 발현은 또한 현미경법에 의해 측정될 수

있다. 현미경법은 광학, 전자, 또는 주사형 탐침 현미경법일 수 있다. 광학 현미경법은 명시야, 경사 조명, 교차 편광, 분산 염색, 암시야, 위상차, 차등 간섭 대비, 간섭 반사 현미경법, 형광(예컨대, 입자, 예컨대, 세포가 면역염색되는 경우), 공초점, 단일 평면 조명 현미경법, 광 시트 형광 현미경법, 디콘볼루션, 또는 연속시

간 코딩 증폭 현미경법의 사용을 포함할 수 있다.

본 발명에서 유전자는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 넉 아웃될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자를 넉 아웃시키는 것은 게놈으로부터 하나 이상의 유전자를 결실시키는 것을 포함할 수 있다. 넉 아웃은 또한 유전자 서열 전체 또는 일부를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 넉 아웃이 게놈 내의 유전자의 전체 또는 일부를 하나 이상의 뉴클레오티드로 대체하는 것을 포함할 수 있다는 것 또한 고려된다. 하나 이상의 유전자를 넉 아웃시키는 것은 또한 하나 이상의 유전자 내에 서열을 삽입하여 하나 이상의 유전자의 발현을 파괴하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열을 삽입하는 것은 하나 이상의 유전자의 중간에 종결 코돈을 생성할 수 있다. 서열을 삽입하는 것은 하나 이상의 유전자의 오픈 리딩 프레임을 이동시킬 수 있다.

일부의 경우, 본 발명의 유전자 편집은 넉 아웃을 디자인하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집은 CRISPR 연관 단백질(Cas 단백질, 예컨대, Cas9), 아연 핑커 뉴클레아제(ZFN: Zinc finger nuclease), 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN: Transcription Activator-Like Effector Nuclease), 및 마가뉴클레아제를 비롯한, 뉴클레아제를 사용하여 수행될 수 있다. 뉴클레아제는 자연적으로 존재하는 뉴클레아제, 유전적으로 변형된, 및/또는 재조합일 수 있다. 예를 들어, CRISPR/cas 시스템이 유전자 편집 시스템으로서 적합할 수 있다.

다른 양태로, 본 발명에서 유전자의 넉다운은 RNA 간섭 시약, 예컨대, siRNA, shRNA, 또는 마이크로RNA를 투여함으로써 감소될 수 있다. 예를 들어, shRNA를 발현할 수 있는 핵산이 세포 내로 안정적으로 형질감염되어 발현을 넉다운시킬 수 있다. 추가로, shRNA를 발현할 수 있는 핵산이 게놈 내로 삽입되어, 유전자를 넉다운시킬 수 있다.

유전자 넉아웃을 위하여는 CRISPR/cas 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어, CRISPR/cas 시스템, 예컨대, II형 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 이중 가닥 파단(DSB: double-strand break)이 생성될 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용되는 Cas 효소는 DNA 절단을 촉매화하는 Cas9일 수 있다. 스트렙토코쿠스 파이오진스

(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 Cas9 또는 임의의 밀접하게 관련된 Cas9에 의한 효소 작용은 가이드 서열의 20개 뉴클레오티드에 하이브리드화하고, 표적 서열의 20개 뉴클레오티드 뒤에 프로토스페이서-인접 모티프(PAM:protospacer-adjacent motif)을 가지는 표적 부위 서열에서 이중 가닥 파단을 생성할 수 있다.

벡터는 Cas 단백질과 같은, CRISPR 효소를 코딩하는 효소 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예로는 dCas9, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7,Cas8, Cas9(Csn1 또는 Csx12로서도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4,Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6,Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1,Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, C2c1, C2c2, C2c3, Cpf1, CARF, DinG, 그의 동족체, 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 예컨대, Cas9와 같은 변형되지 않은 CRISPR 효소는 DNA 절단 활성을 가질 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열에서, 예컨대, 표적 서열 내에서 및/또는 표적 서열의 보체 내에서 하나 또는 두 가닥 모두의 절단을 유도할 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소는 표적 서열의 첫 번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개 이상의 염기쌍 이내에서 하나 또는 두 가닥 모두의 절단을 유도할 수 있다. 돌연변이화된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 두 가닥 모두를 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대하여 돌연변이화된 CRISPR 효소를 코딩하는 벡터가 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "가이드　RNA"라는 용어 및 그의 문법적 등가물은 표적 DNA에 특이적일 수 있고, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 RNA를 지칭할 수 있다. RNA/Cas 복합체는 Cas 단백질을 표적 DNA로 "가이드"하는 데 도움을 줄 수 있다.

본원에 개시된 방법은 또한 적어도 하나의 가이드 RNA 또는 핵산, 예컨대, 적어도 하나의 가이드 RNA를 코딩하는 DNA를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제와 상호작용하여 상기 엔도뉴클레아제를 특이적 표적 부위로 유도할 수 있고, 이 부위에서 가이드 RNA의 5' 단부가 염색체 서열 내의 특정한 프로토스페이서 서열과 염기쌍을 형성한다.

가이드　RNA는　2개의　RNA, 예컨대, CRISPR　RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA(tracrRNA: transactivating crRNA)를 포함할 수 있다. 가이드　RNA는 때때로 단일 쇄　RNA를 포함할 수 있거나, 또는 crRNA 일부(예컨대, 기능적 부분) 및 tracrRNA의 융합에 의해 형성된 단일 가이드 RNA(sgRNA: single guide RNA)를 포함할 수 있다. 가이드　RNA는　crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 dualRNA일 수 있다. 더욱이, crRNA는 표적 DNA와 하이브리드화할 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 가이드 RNA는 발현 생성물일 수 있다. 예를 들어, 가이드　RNA를 코딩하는 DNA는 가이드　RNA를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터일 수 있다. 가이드　RNA는　세포 또는 유기체를 단리된　가이드　RNA 또는 가이드　RNA를 코딩하는 서열 및 프로모터를 포함하는 플라스미드 DNA로 형질감염시킴으로써 세포 또는 유기체에 이식될 수 있다. 가이드　RNA는 또한　다른 방식으로, 예컨대 바이러스 매개된 유전자 전달을 사용하여 세포 또는 유기체에 이식될 수 있다.

가이드 RNA는 단리될 수 있다. 예를 들어, 가이드　RNA는　단리된　RNA의 형태로 세포 또는 유기체 내로 형질감염될 수 있다. 가이드　RNA는 당업계에 공지된 임의의　시험관내　전사 시스템을 사용하여 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 가이드　RNA는　가이드　RNA에 대한 코딩 서열을 포함하는 플라스미드의 형태보다는 단리된 RNA의 형태로 세포에 전달될 수 있다.

가이드 RNA는 3개의 영역: 염색체 서열 내의 표적 부위에 상보적일 수 있는 5' 단부에 있는 제1 영역, 줄기 루프 구조를 형성할 수 있는 제2 내부 영역, 및 단일 가닥일 수 있는 제3 3' 영역을 포함할 수 있다. 각 가이드 RNA의 제1 영역은 또한 각 가이드 RNA가 융합 단백질을 특정한 표적 부위로 가이드할 수 있도록 상이할 수 있다. 추가로, 각 가이드 RNA의 제2 및 제3 영역은 모든 가이드 RNA에서 동일할 수 있다.

가이드 RNA의 제1 영역은 가이드 RNA의 제1 영역이 표적 부위와 염기쌍을 형성할 수 있도록 염색체 서열 내의 표적 부위에서의 서열에 상보적일 수 있다. 일부 경우에서, 가이드 RNA의 제1 영역은 10개 뉴클레오티드 내지 25개의 뉴클레오티드 또는 약 10개 뉴클레오티드 내지 25개의 뉴클레오티드(즉, 10 nt 내지 25 nt; 또는 약 10 nt 내지 약 25 nt; 또는 10 nt 내지 약 25 nt; 또는 약 10 nt 내지 25 nt) 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 제1 영역 및 염색체 서열 내의 표적 부위 간의 염기쌍 형성 영역의 길이는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25개 이상, 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 종종, 가이드 RNA의 제1 영역의 길이는 19, 20, 또는 21개 또는 약 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

가이드 RNA는 또한 2차 구조를 형성하는 제2 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA에 의해 형성된 2차 구조는 줄기(또는 헤어핀) 및 루프를 포함할 수 있다. 루프 및 줄기의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 루프길이의 범위는 3 내지 10개, 또는 약 3 내지 10개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 줄기 길이의 범위는 6 내지 20개, 또는 약 6 내지 20개의 염기쌍 길이일 수 있다. 줄기는 1 내지 10개 또는 약 10개의 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 벌지를 포함할 수 있다. 제2 영역의 전체 길이의 범위는 16 내지 60개, 또는 16 내지 60개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 루프 길이는 4개, 또는 약 4개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 줄기는 12개의 염기쌍일 수 있거나, 또는 약 12개의 염기쌍일 수 있다.

가이드 RNA는 또한 본질적으로 단일 가닥일 수 있는 3' 단부에 있는 제3 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제3 영역은 때때로 관심 세포의 임의의 염색체 서열에 상보적이지 않으며, 때때로 가이드 RNA의 나머지 부분에 상보적이지 않다. 추가로, 제3 영역의 길이는 달라질 수 있다. 제3 영역의 길이는 4개 초과 또는 약 4개 초과 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 제3 영역의 길이의 범위는 5개, 또는 약 5개 내지 60개의 뉴클레오티드길이일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 류코노스톡 시트륨 ( L. citreum )에서의 크리스퍼 간섭 (CRISPR interference) 기술 발현 시스템 제작 및 검증

류코노스톡 시트륨(L. citreum, ATCC49370)에 pCB4270 벡터(서열번호 1)를 사용하여 녹색형광단백질 유전자(sfGFP, 서열번호 2)가 게놈(genome)에 삽입되어 발현하는 균주를 제작하였다.

류코토스톡 시트륨(L. citreum)에서 활용할 수 있는 크리스퍼 간섭 기술을 확립하기 위하여, Streptococcus pyogenes 유래 Cas9 단백질에서 RuvC1 (D10A)와 HNH (H841A) 도메인에 변이가 일어나 DNA 절단 기능이 결여된 dCas9 단백질 유전자 서열(서열번호 3)과 녹색형광단백질 (superfolder GFP) 유전자 서열에 선택적으로 결합하는 싱글 가이드 RNA (single guide RNA)(서열번호 4)를 포함하는 크리스퍼sRNA와 dCas9 발현시스템(pCB4270V4BU-CRISPRi)을 pCB4270 벡터(서열번호 1)을 사용하여 구축하였으며(도 1), 구축에 필요한 서열을 아래에 나타내었다.

sfRNA서열(서열번호 4):

AATTCTTGTTGAATTAGATG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG

(밑줄은 sfGFP 결합서열이고, 이탤릭체는 dCas handle서열을 나타낸다)

P710V4 프로모터 서열(서열번호 5):

GAGAACAGTTTAAAGTTAATAGGTGTTTTTAGCCTGAAGTGTTATAATGAGTATAACCAGAA

S. pyogenes terminator (서열번호 6):

TTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT

rrnB terminator(서열번호 7):

GAAGCTTGGGCCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTAAACGGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACT

아울러, pCB4270 백본에 sfGFP 유전자에 대한 결합능력을 가지는 sgRNA 발현 시스템만 들어있는 벡터(pCB4270V4v4sgR)와 pCB4270 백본에 sgRNA 발현 시스템이 없이 dCas9 단백질 발현시스템만 들어있는 벡터(pCB4270v4eSD2dCas)를 제작하였다.

상기 제작된 벡터들을 상기 sfGFP 유전자가 삽입된 류코노스톡 시트륨 균주에 형질전환하였고 형질전환체에서 녹색형광단백질의 발현 억제효과를 검증하였다.

형질전환체를 에리스로마이신(Erythromycin) 10mg/L가 들어있는 MRS 배지 (De Man, Rogosa and Sharpe medium)에 접종하였고 이를 30℃, 200rpm 조건으로 12시간 동안 배양 후 새로운 배지에 OD 600nm 값이 0.05가 되도록 맞추어 옮긴 후 12시간 배양하여 녹색형광단백질의 발현양을 FACS 분석하였고, 그 결과, 도 2에 나타난 바와같이, sgRNA 유전자와 dCas9 유전자가 발현된 형질전환체에서 효과적으로 녹색형광단백질의 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다 (도 2).

녹색형광단백질 (sfGFP)의 발현 억제 효과가 도입된 크리스퍼 간섭 (CRISPR interference) 시스템의 정상 작동으로 인해 발생한 결과인지를 검증하기 위해 sfGFP 유전자에 대한 qRT-PCR (Reverse transcriptase PCR)을 수행하였다. 형질전환체를 에리스로마이신 (Erythromycin) 10 mg/L가 들어있는 MRS 배지에 접종하였고 이를 30℃, 200rpm 조건으로 12시간 동안 배양 후 새로운 배지에 OD 600nm 값이 0.05가 되도록 맞추어 옮긴 후 12시간 배양하였다. 배양 후 OD 600nm 값이 3이 되도록 셀을 수확하고 4℃, 13000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상등액을 제거하고 라이소자임 (lysozyme) 5 mg/mL의 RNase free water 300㎕를 첨가한 후 37 ℃ 200 rpm에서 1시간 인큐베이션 한 후 세포 내 mRNA를 추출하고 qRT-PCR을 진행하였다. 분석 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, sgRNA 유전자와 dCas9 유전자가 발현된 균주에서, sfGFP 유전자의 전사량이 대조군 대비 90% 수준으로 억제된 것을 확인하여 도입된 크리스퍼 간섭 (CRISPR interference) 기술이 효과적으로 작동하는 것을 확인하였다.

아울러, sgRNA 유전자가 포함되지 않은 dCas9 유전자만을 포함하는 pCB4270v4eSD2dCas로 형질전환된 균주에서 sfGFP의 이상 발현향상이 확인되어 이를 바로잡을 필요성이 있는 것으로 판단되었다.

실시예 2: 류코노스톡 시트륨 ( L. citreum )에서의 크리스퍼 간섭 (CRISPR interference) 기술 발현 시스템 최적화

실시예 1의 결과에서 크리스퍼 간섭 발현 시스템이 도입된 형질전환체는 야생 균주에 비해 세포 성장률이 떨어지는 문제와 dCas9 유전자만이 형질전환되었을 때 목적 유전자의 발현이 증가하는 현상을 확인하였고 이를 개선하고자 발현 시스템의 최적화를 진행하였다.

다양한 세기의 프로모터와 SD서열 (Shine-Dalgarno sequence)의 조합을 통한 바이시스트로닉 발현 시스템 (bicistronic expression system)을 포함하는 벡터를 도입하여 dCas9 단백질의 발현양을 조절하였다. 본 실시예에서 바이시스트로닉 발현시스템은 목적 단백질의 올바른 발현을 위해 하나의 프로모터 바로 뒤 리보솜에 의한 번역이 원할하게 될 수 있는 SD서열을 붙이고 (1^st cistron) 그 뒤에 번역의 세기를 조절할 수 있는 두번째 SD서열 (2^nd cistron)을 붙여서 사용하였다.

본 실시예에서 사용한 바이시스트로닉 발현 시스템은 총 4가지를 사용하였으며,

D1: P710V4 프로모터(강한프로모터)/SD1/강한세기 2^nd cistron SD서열 (이하 명칭 eSD2)

D2: P710V4 프로모터/SD1/약한세기 2^nd cistron SD서열 (이하 명칭 SD2)

D3: P710프로모터(약한 프로모터)/SD1/eSD2

D4: P710프로모터/SD1/SD2

여기서, 1^st cistron서열은 SD1으로 고정입니다.

1^st cistron(SD1)(서열번호 8):

GGGCCCAAGTTCACTTAAAAAGGAGATCAACACTCGAG

2nd cistron (SD2)(서열번호 9):

ATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGCAAAGGAGGTGTTTTAA

2nd cistron (eSD2)(서열번호 10):

ATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGGAAGGGAGGGTTTTTAA

P710 프로모터(서열번호 11):

GAGAACAGACTTGACTTAATATCTATTTAATGTGATTTCTGTTATAATTGATATAACCAGAA

P710V4 프로모터(서열번호 12)

GAGAACAGTTTAAAGTTAATAGGTGTTTTTAGCCTGAAGTGTTATAATGAGTATAACCAGAA

상기 각각의 바이시스트로닉 발현시스템을 포함하는 dCas9 유전자 발현 벡터를 형질전환한 세포를 실시예 1과 동일한 조건으로 세포를 12시간 동안 배양한 후 OD 600nm 값이 5가 되도록 세포를 수확하고 13000rpm에서 5분간 원심분리 후 상등액을 제거하고 1xPBS 완충액 300㎕를 첨가한 후 소니케이터 (sonicator)로, 7분간 5초 펄스, 3초 대기, 20% amplitude 조건으로 세포를 파쇄하였다. 파쇄 후 수확한 dCas9 단백질의 발현양을 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 (western blot)을 통해 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 해당 시스템에서 dCas9 단백질의 발현양을 점차적으로 줄임으로서 떨어진 세포 성장률이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, qRT-PCR을 통하여, 도 5에 나타난 바와 같이, D4 시스템(P710프로모터/SD1/SD2)을 사용하여 dCAas9 유전자를 발현시키는 경우, sgRNA 발현없이 dCas9 단백질의 과발현만으로 타겟 유전자(sfGFP)의 전사량이 증가하던 비정상적인 전사 또한 극적으로 회복되는 것을 확인함으로써 류코노스톡 시트륨 (L. citreum)에서의 크리스퍼 간섭 발현 시스템의 최적화를 검증하였다(도 5).

실시예 3: 류코노스톡 시트륨 ( L. citreum )에서의 리보플라빈 합성 대사회로 조절을 통한 리보플라빈 과량 생산 확인

류코노스톡 시트륨 (L. citreum)에서 비타민 B2 리보플라빈 (Riboflavin)을 과량 생산하기 위해 도입된 크리스퍼 간섭 (CRISPR interference) 기술을 활용하여 류코노스톡 시트륨 균주의 리보플라빈 합성경로(도 6 참조)에서 GTP가 folate로 전환되는 경로에 관여하는 효소인 GTP cyclohydrolase효소를 암호화하는 folE 유전자와 합성된 리보플라빈 (Riboflavin)의 FMN (Flavin mononucleotide) 전환 효소를 암호화하는 ribF 유전자의 전사를 억제할 수 있는 크리스퍼 간섭 발현 시스템 벡터를 제작하였다.

상기 folE 유전자를 sgRNA-dCas9 플랫폼을 이용하여 전사억제시켜 GTP가 folate가 아닌 FMN으로 가는 경로를 활성화 시켰으며, 또한 생성된 리보플라빈이 FMN으로 전환되는데 관여하는 효소에 대한 유전자 ribF 유전자의 전사를 sgRNA-dCas9 플랫폼으로 전사억제시켜 생성된 리보플라빈이 FMN으로 전환하는 것을 막아 세포의 리보플라빈 생성을 증가시키도록 하였습니다.

이에 사용한 sgRNA 서열은 다음과 같습니다.

ribF targeting sgRNA 서열 (서열번호 13)

GGCTGTTTGAAATTTTGAAT GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG

(이탤릭 밑줄은 ribF 유전자 결합 서열을 나타냄)

folE targeting sgRNA 서열 (서열번호 14)

ATATTTGACGCCCTGCACGA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG

(이탤릭 밑줄은 folE 유전자 결합 서열을 나타냄)

상기 각각의 sgRNA 서열을 포함하는 sgRNA-dCas9 발현 벡터를 각각 류코노스톡 시트륨에 형질전환 하였다. 형질전환체는 실시예 1의 방법으로 12시간 배양한 뒤 mRNA를 추출하여 두 유전자에 대한 전사 억제효과를 qRT-PCR 분석을 통해 확인하였다 (도 7). 또한 형질전환체의 야생 균주 대비 증가된 리보플라빈 (Riboflavin) 생성량을 확인하기 위해 HPLC 분석을 수행하였다. 배양과정동안 수확한 배지 1 mL을 4℃, 13000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상등액을 1:1로 3차수에 희석하여 0.22 uM syringe filter 로 필터한 후 Zorbax 300SB-C18 column (150 x 4.6 mm; Agilent Technologies, PA, CA, USA)에서 methanol-water (75:25 v/v) 이동상으로 0.5 mL/min, 65ㅀC 조건에서 리보플라빈의 생성량을 정량하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, ribF와 folE가 모두 전사 억제된 형질전환체는 야생균주 대비 25% 수준의 증가된 리보플라빈 (Riboflavin) 생성량을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 류코노스톡 시트륨 ( L. citreum )에서의 ribo operon의 과 발현을 통한 리보플라빈 과량 생산의 검증

실시예 3에서 리보플라빈 생성능이 증가된 균주에서 추가적으로 리보플라빈 (Riboflavin) 생성능을 향상시키기 위하여, 크리스퍼 간섭 발현 시스템에 리보플라빈 합성에 관여하는 효소 암호화 유전자인 ribD 유전자(서열번호 15), ribE 유전자(서열번호 16), ribA 유전자(서열번호 17) 및 ribH 유전자(서열번호 18)를 포함하는 ribo 오페론(서열번호 19)의 발현 시스템을 pCB4270 벡터에 도입한 재조합 벡터를 제작하였다.

상기 제작된 ribo operon 함유 벡터를 방법으로 벡터를 류코노스톡 시트륨에 형질전환 하였고 생성된 형질전환체의 리보플라빈 (Riboflavin) 생성량을 HPLC 분석을 통해 정량하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 분석결과 크리스퍼 간섭 발현 시스템만을 포함한 형질전환체에 비해 ribo operon의 발현 시스템을 추가적으로 도입한 형질전환체는 야생균주 대비 50% 수준의 증가된 리보플라빈 (Riboflavin) 생성량을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Lactic acid bacteria having enhanced Productivity for Riboflavin <130> P19-B280 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCB4270 full sequence <400> 1 gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 60 acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 120 actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 180 gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 240 cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 300 tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 360 gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 420 ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 480 aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 540 tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 600 ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 660 gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 720 tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 780 caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 840 ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 900 cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 960 ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 1020 cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 1080 gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 1140 aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 1200 acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 1260 gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 1320 cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 1380 cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 1440 tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 1500 cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 1560 gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 1620 cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 1680 ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 1740 gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 1800 taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 1860 gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 1920 acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 1980 aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 2040 cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 2100 atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 2160 gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 2220 cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 2280 gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 2340 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 2400 gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 2460 ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 2520 gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 2580 ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct 2640 tgcatgcctg caggtcgatt ataggtatgt ggttttgtat tggaatggca ttttttgcta 2700 tcaaggttat taaaaataaa aattagacca cgcatttatg ccgagaaaat ttattgtgcg 2760 ttgagaagaa cccttaacta aacttgcaga cgaatgtcgg catagcgtga gctattaagc 2820 cgaccattcg acaagttttg ggattgttaa gggttccgag gctcaacgtc aataaagcaa 2880 ttggaataaa gaagcgaaaa aggagaagtc ggttcagaaa aagaaggata tggatctgga 2940 gctgtaatat aaaaaccttc ttcaactaac ggggcaggtt agtgacatta gaaaaccgac 3000 tgtaaaaagt acagtcggca ttatctcata ttataaaagc cagtcattag gcctatctga 3060 caattcctga atagagttca taaacaatcc tgcatgataa ccatcacaaa cagaatgatg 3120 tacctgtaaa gatagcggta 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Claims (13)

1. folE 유전자 및 ribF 유전자가 넉아웃(kmock out)되어 있고, ribD 유전자, ribE유전자, ribA 유전자 및 ribH 유전자로 구성된 리보 오페론(ribo operon)이 도입되어 리보플라빈 생성능이 증가된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 류코노스톡 시트륨 균주에서 folE 유전자 및 ribF 유전자를 넉아웃시키는 단계; 및 ribD 유전자, ribE유전자, ribA 유전자 및 ribH 유전자로 구성된 리보 오페론(ribo operon)을 도입시키는 단계를 포함하는 리보플라빈 생성능이 증가된 재조합 류코노스톡 시트륨 균주의 제조방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 넉아웃은 크리스퍼 간섭 기술을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 서열번호 13으로 표시되는 ribF 유전자 타겟팅을 위한 가이드 RNA를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제5항에 있어서, 서열번호 14로 표시되는 folE 유전자 타겟팅을 위한 가이드 RNA를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제5항에 있어서, 상기 크리스퍼 간섭기술은 dCas9 유전자를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 크리스퍼 간섭기술은 서열번호 11로 표시되는 P710 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 SD 서열 및 서열번호 9로 표시되는 SD2 서열을 가지는 바이시스트로닉 시스템을 이용하여 dCas9을 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 삭제
11. 다음 단계를 포함하는 리보플라빈의 제조방법:
    (a) 제1항의 재조합 류코노스톡 시트륨 균주를 배양하여 리보플라빈을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 리보플라빈을 수득하는 단계.
    
12. 서열번호 11로 표시되는 P710 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 SD 서열 및 서열번호 9로 표시되는 SD2 서열을 포함하는 바이시스트로닉 구조체와 타겟 유전자에 대한 가이드 RNA 서열 및 dCas9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여, 크리스퍼 간섭 기술로 류코노스톡 시트륨 균주에서 타겟 유전자를 넉아웃시키는 방법.
    
13. 서열번호 11로 표시되는 P710 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 SD 서열 및 서열번호 9로 표시되는 SD2 서열을 포함하는 류코노스톡 시트륨 발현용 바이시스트로닉 구조체.
    
    
    
    
    
    
    
    

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