CN110564766A - 一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，公开了一种全基因组表达载体pBR322‑DHN3的制备方法，包括如下步骤：步骤1：建立pBR322‑Base载体；步骤2：构建pBR322‑PNP质粒、pBR322‑PDP质粒、pBR322‑LPD3质粒；步骤3：回收片段PNP、片段PDP、片段LPD3；并将片段PNP、片段PDP，以及片段LPD3连接得到全长DHN3‑A备用；步骤4：将步骤1所得pBR322‑Base载体为模板，扩增、纯化后制得带同源臂的质粒片段；步骤5：将步骤4得到的质粒片段与步骤3得到的DHN3‑A进行同源重组得到重组产物。本发明的方法其能够成功制备全基因组表达载体pBR322‑DHN3，无随机突变发生。

Description

一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种主要侵害鸡、火鸡、野禽及观赏鸟类的高度接触传染性、致死性疾病，俗称鸡瘟。属高度接触性、急性、烈性传染病。人类偶会感染，表现为结膜炎。世卫组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国农业部也将其列为必须通报的一类动物疫病。因其传播速度快且发病和病死率均可达100％，一旦波及将严重危害家禽业,造成不可估量的损失。

新城疫的防预除了合理饲养，疫苗免疫预防仍是关键措施。除了建立建全正确的免疫程序，提供优良广谱高效廉价疫苗是预防该病的根本。

鸡新城疫疫苗分灭活苗和活苗。活苗主要有Ⅰ系，Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F系)、Ⅳ系(Lasota株)。其中Ⅳ系活疫苗(Lasota株)是目前国内外广泛应用的较优良的低毒苗,其毒力与免疫性能高于Ⅱ系苗,安全性良好。随着克隆技术的应用新一代克隆苗正逐步上市。目前被市场青睐的新一代弱毒活苗主要有由荷兰研制的新城疫克隆活苗C/30和由美国通研制的Ⅳ系优化克隆苗。此外新城疫中等毒力克隆株活疫苗(I系克隆苗)也表现出与普通I系苗相似但毒力稍温和,安全性较强的优势。

据流行病学调查，NDV的流行基因型随时间和地理环境而变化。上世纪20-50年代主要流性I-IV型，70年代首次发现V型主要在南美和中美以致全欧洲。80年代出现VI型并盛行于中东，亚洲和欧洲。85年VII型开始蔓延，并与VIII型流行于世界多个国家并在90年代导致在亚洲，非洲和中东的大流行。V-VIII型均为强毒。IX和X型尚局限在局部散发状态。由于针对IV型的疫苗得到了广泛应用，IV型NDV已得到良好控制。但针对其它基因型的疫苗尚欠缺从而均有流行的趋势。因此利用反向遗传克隆技术迅速开发针对实时流行株的高效，广谱，安全甚至多价的弱毒苗势在必行。此外，由于疫苗的广泛使用使疫检更加困难。因为无法甄别被感染鸡携带的是疫苗株还是野生毒株。通过重组方式可引入人工标签，使其能与野毒有效鉴别。

鸡新城疫病毒(NDV)属于单股负链RNA目，副粘病毒科副粘病毒属。该病毒具有一个双脂层囊膜，内衬一层M蛋白。膜外被具有纤突的糖蛋白(HN和F)包被使之外形呈花穗状。囊内含有由壳蛋白和一条负链RNA组成的长螺旋状核衣壳。新城疫病毒有6组基因，分别用于编码6个病毒蛋白，即具血凝素和神经氨酸酶活性的(HN)糖蛋白、具融合功能的(F)糖蛋白，非糖基化内膜蛋白(M)，核壳蛋白(NP)，磷蛋白(P)和高分子量蛋白(L)。NDV基因全长为15186nt到15198nt。

已有研究表明将NDV的cDNA克隆作人功突变，更换，或在其中插入外源序列并不会阻碍该病毒的复制，装配和释放。NDV的cDNA克隆已用于基础研究和疫苗开发。NDV的cDNA克隆可作为载体表达其它病原菌的抗原蛋白从而获得抗多种病原菌的多价疫苗。如1999年Peeters等将F基因裂解点作碱基突变使Latasa株弱毒变成了强毒(ref1)；2004年Huang等将强度和弱毒株的HN基因互换也获得了不同毒力的新毒株(ref2)。2002年，Mebatson等用肝炎病毒的S2糖蛋白抗原表位基因取代NDV的NP蛋白优势抗原表位，成功获得了既抗NDV又抗肝炎病毒的杂合病毒(ref3)；2006年，Man等将H7禽流感病毒的HA基因、插在NDVB1株的P-M基因之间也成功获得了既抗NDV又抗H7禽流感病毒的杂合病毒(ref4)。最近Abzeid等又成功将埃及当前流行的IBVS蛋白组装进重组NDV，获得了既针对原NDV又针对相应的IBV免疫保护的杂合病毒。(ref5)我国学者也用LaSota株为载体先后获得多个具二价功能的杂合病毒。如既抗NDV又抗IBDV5杂合病毒(ref6)；既抗NDV又抗H5N1的杂合病毒(ref7)；既抗NDV又抗鸡支原体TM1病毒的杂合病毒(ref8)。由于NDV只有一个血清型，因此它的遗传性能相对稳定。虽然NDV的感染性cDNA克隆在国际上早有建立但国内基本上仅限于Latasa株，且基本局限在基础和临床的研究层面，这可能与国内疫苗生产单位的研发技术能力有关。

在实际应用过程中，DHN3全基因组共15192nt，如将全长cDNA一次性通过RT-PCR获得，一是困难，一般市场可买到的DNA聚合酶很难合成大过10k的DNA片段，二是容易在PCR过程中引入随机突变。

所以，本申请所要解决的技术问题是：如何成功制备全基因组表达载体pBR322-DHN3，并避免随机突变。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，其能够成功制备全基因组表达载体pBR322-DHN3，无随机突变发生。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：建立pBR322-Base载体，在pBR322载体上引入能够与DHN3全基因组进行同源重组的片段；所述片段上具有与DHN3全基因组的3’末端和5’末端对应的同源臂；

步骤2：构建过渡载体；所述过渡载体为质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3；所述质粒pBR322-PNP的目的片段包括NP、MINI和P基因；所述质粒pBR322-PDP的目标片段包括P，PD1和PD2,PD3基因；所述质粒pBR322-LPD3的目标片段包括PD3和L1,L2,L3,L4基因；

步骤3：构建DHN3全基因组DHN3-A；将质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3进行酶切得到基因片段PNP、PDP和LPD3，将基因片段PNP、PDP和LPD3通过T4链接酶连接得到DHN3全基因组DHN3-A；

步骤4：构建带同源臂的质粒片段；将步骤1中的pBR322-Base载体为模板进行PCR扩增得到带同源臂的质粒片段；

步骤5：构建全基因组表达载体pBR322-DHN3；将步骤4中的质粒片段和步骤3中的DHN3全基因组DHN3-A进行同源重组得到具有DHN3全基因组DHN3-A的质粒pBR322-DHN3；

DHN3全基因组DHN3-A的序列如序列表SEQ ID NO：1；

MINI基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1414-1949nt；PD1基因在序列表SEQ IDNO：1中位置为2935-4956nt；PD2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为4838-6454nt；PD3基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为6261-8283nt；L1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-10709nt；L2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为10174-12299nt；L3基因在序列表SEQ IDNO：1中位置为12238-14433nt；L4基因在序列表SEQ ID NO：1中位置14214-15192nt。

在上述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法中，所述步骤2中pBR322-PNP质粒构建的具体方法为：

步骤211：将pBR322载体用Hind3和Nhe1作双酶切，然后经胶回收pBR322载体片段备用；

步骤212：分别用带同源臂的引物和相应的模板在高保真DNA聚合酶的作用下扩增带同源臂的DNA片段，经跑DNA胶验证后回收备用；

其中，模板为质粒pMD19-NP、质粒pMD19-MINI、质粒pMD19-P；

质粒pMD19-NP对应的引物为C-Sac11BtNhe-ST-R和C-NP-F；

质粒pMD19-MINI对应的引物为C-Mini-R和C-Mini-F；

质粒pMD19-P对应的引物为C-P-R和C-HindBt-P-F；

其中，质粒pMD19-NP为NP基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pMD19--MINI为MINI基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pMD19-P为P基因克隆进pMD19载体中的产物；引物C-Sac11BtNhe-ST-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-NP-F如序列表SEQ ID NO：1；引物为C-Mini-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-Mini-F如序列表SEQ ID NO：1；引物C-P-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-HindBt-P-F如序列表SEQ ID NO：1；

步骤213：将步骤212所获得的DNA片段和步骤211所获得的pBR322载体片段用重组酶链接，得到pBR322-PNP质粒。

在上述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法中，所述步骤2中pBR322-PDP质粒构建的具体方法为：

步骤221：将pBR322载体用Hind3和Nhe1作双酶切,然后经胶回收pBR322载体片段备用；

步骤222：分别用带同源臂的引物和相应的模板在高保真DNA聚合酶的作用下扩增带同源臂的DNA片段，经跑DNA胶验证后回收备用；

其中，模板为质粒pMD19-P、质粒pMD19-PD1、质粒pMD19-PD2、pMD19-PD3；

质粒pMD19-P对应的引物为C-BtNhe-P-R和C-P-F；

质粒pMD19-PD1对应的引物为C-PD1-R和C-PD1-F；

质粒pMD19-PD2对应的引物为C-PD2-R和C-PD2-F；

质粒pMD19-PD3对应的引物为C-PD3-R和C-HindBtg-PD3-F；

质粒pMD19-PD1为PD1基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pMD19-PD2为PD2基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pMD19-PD3为PD3基因克隆进pMD19载体中的产物；引物C-BtNhe-P-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-P-F如序列表SEQ ID NO：1；引物为C-PD1-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD1-F如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD2-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD2-F如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD3-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-HindBtg-PD3-F如序列表SEQ ID NO：1；

步骤223：将步骤222所获得的DNA片段和步骤221所获得的pBR322载体片段用重组酶链接，得到pBR322-PDP质粒。

在上述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法中，所述步骤2中pBR322-LPD3质粒构建的具体方法为：

步骤231：将pBR322载体用Hind3和Nhe1作双酶切，然后经胶回收pBR322载体片段备用；

步骤232：分别用带同源臂的引物和相应的模板在高保真DNA聚合酶的作用下扩增带同源臂的DNA片段，经跑DNA胶验证后回收备用；

其中，模板为质粒PMD19-PD3、质粒pXJ40-L；

质粒PMD19-PD3，对应的引物为C-BtNhe-PD3-R和C-PD3-F；

质粒pXJ40-L，对应的引物为C-L1-R、P-L2-R、P-L3-F、C-HindBtNot-L4-F；

质粒PMD19-PD3为PD3基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pXJ40-L为L基因克隆进pXJ40载体中的产物；引物C-BtNhe-PD3-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD3-F如序列表SEQ ID NO：1；引物C-L1-R如序列表SEQ ID NO：1；引物P-L2-R如序列表SEQ ID NO：1；引物P-L3-F如序列表SEQ ID NO：1；引物C-HindBtNot-L4-F如序列表SEQ ID NO：1；

步骤233：将步骤232所获得的DNA片段和步骤231所获得的pBR322载体片段用重组酶链接，得到pBR322-PDP质粒。

在上述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法中，所述步骤3中，从pBR322-PNP质粒回收片段PNP的方法为：pBR322-PNP质粒用BtgZ1和Hind3双酶切后回收片段PNP；

从pBR322-PDP质粒回收片段PDP的方法为：pBR322-PDP质粒用BtgZ1单酶切后回收片段PDP；

从pBR322-LPD3质粒回收片段LPD3的方法为：pBR322-LPD3质粒用BtgZ1单酶切后回收片段LPD3；

所述片段PNP、片段PDP、片段LPD3通过高浓度T4链接酶作体外连接，获得全长DHN3-A。

在上述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法中，所述步骤1具体为：

在pBR322质粒上分别引入1个T7启动子，1个T7终止子以及1个HDV Ribozyme；T7启动子下游引入DHN3的3’末端的部分碱基HC1；在HDV Ribozyme的上游引入DHN3的5’末端部分碱基HC2；其中，碱基HC1在DHN3全基因组序列中的位置顺序为15192-15159nt；碱基HC2在DHN3全基因组序列中的位置顺序为141-1nt。

本发明的有益效果是：

本发明将DHN3全基因组分成3个片段，将其分别克隆到pBR322载体。片段的大小是基于它所持有的BtgZ1酶切位点来确定的，以利于随后的体外DNA片段连接。

通过3个片段成功克隆到pBR322载体，得到了全基因组表达载体pBR322-DHN3，通过Sac1酶切作初步鉴定，正确的酶切产物应是1个8482bp,1个7065bp,1个3132bp,1个908bp,和1个32bp的片段。结果如图6，显示该酶切产物与序列推断的结果一致。

本发明通过上述的设计，解决了大基因组不易人工合成的难题。

附图说明

图1为本发明的实施例一的pBR322-Base载体的结构图示。

图2为本发明的实施例一的pBR322-PNP质粒的结构图示；

图3为本发明的实施例一的pBR322-PDP质粒的结构图示；

图4为本发明的实施例一的pBR322-LPD3质粒的结构图示；

图5为本发明的实施例一的菌落A的质粒A1-A3PCR鉴定的电泳图；

图6为本发明的实施例一的质粒A酶切鉴定的电泳图；

图7为本发明的实施例一的pBR322-DHN3的质粒的结构图示；

图8为本发明的实施例一的pBR322-DHN3的质粒的结构图示；

图9为本发明的实施例一的引物PXJ40-F/P-L1-R鉴定质粒PXJ40-L的PCR产物的电泳图；

图10为本发明的实施例一的引物P-L3-F/P-L3-R扩增出出正确的PCR产物的电泳图；

图11为本发明的实施例一的质粒pXJ40-L的酶切鉴定电泳图。

图12为本发明NDV感染BHK-21细胞，细胞病变示意图。

图13为本发明的测序结果与已发表的所有NDV序列比对的图。

图14为本发明的实施例一的pBR322质粒片段的质粒的结构图示；

图15为本发明的实施例一的pXJ40-New质粒的质粒的结构图示。

具体实施方式

下面结合具体实施方式说明本发明：但是可以理解这些具体的实施方式只是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。本领域的技术人员完全可以在本发明的启示下，对本发明的的具体实施方式或者技术特征进行改进，但这些经过改进或替换的技术方案，仍属于本发明的保护范围。

实施例一

一、仪器和试剂

在描述本发明的方法前，对本发明主要仪器及试剂试剂的来源进行具体描述：

主要仪器及试剂

THZ-100型电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

A17105653型洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司。

DK-8D型三孔电热恒温水槽购自上海一恒科学仪器有限公司。

THZ-100型恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

BCD-579WE型海尔冰箱购自海尔。

5424R型离心机；EppendorfPCR仪；Thermo1300SERIESA2生物安全柜，均购自Eppendorf。

DNA/RNA共提试剂盒(AP-MN-BF-VNA-250G)购自AXYGEN；

TIANprepMiniPlasmidKit(DP103-03)均购自天根有限公司；

GelExtractionKit(D2500-02)购自OMEGA；

M-MLVRT(2641A)购自TAKARA；

RRI(2313A)购自TAKARA；

Random 6primer(3801)购自TAKARA；

Agarose(E0301)购自TSINGK；

0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)，DMEMbasic(C11995500BT)购自Gibco；

LipofectamineLTXandPlusReagent(15338-100)购自Invitrogen；

FBS(10099-141C)购自Gibco；

Premix-Taq(RR902)购自TAKARA；

PenStreppenicillinStreptomycin(15140-122)购自Gibco；

PrimerstarGXL(R050)购自TAKARA；

BtgZ1(R0703S)，T4DNALigase(M0202M)购自NEB；

其它限制性内切酶，链接酶均购自TAKARA.；

ClonExpressMultisOneStepCloningKit(C113)；购自诺维赞。

BL21(DE)购自Merck公司；

载体pMD19购自Takara，pBR322购自NEB。

二、病毒分离，纯化，测序和分析归类

(a)为了开发一株针对目前流行的NDV重组疫苗，我们首先从养鸡场采集病料NDV(QTCF1)，病料中添加适量生理盐水后碾磨充分，离心12000rpm 10分钟，然后取上清通过0.4μm滤器过滤，将滤液中添加1％SP双抗后不经稀释，直接接种到鸡胚绒膜尿囊腔中，添加量为100μl/枚；

后进一步在SPF鸡胚的绒膜尿囊腔接种繁殖，待鸡胚死后收集尿囊液。

(b)将此尿囊液所含病毒在BHK-21细胞上进行噬斑纯化，纯化后的病毒命名为DHN3。具体操作如下：

使用双蒸水配置3％琼脂糖溶液，高压后置4℃备用。使用前用微波炉加热2～3分钟融化并按3％琼脂糖2ml+2％FBS DMEM 24ml配制成琼脂糖液，将其置40℃干浴待用。

配置2％FBS+DMEM+1％SP抗生素培养液备用。

将从尿囊液回收到的DHN3病毒用DMEM培养液按1：10稀释成6个梯度，制得感染液10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6备用。

将BHK-21细胞置6孔培养皿中培养，待细胞长至90％满后分别加入上述感染液200μl，另补DMEM培养液800μl，使每孔终体积为1ml。轻轻摇匀后置37℃孵育2h。弃去孵育液，再用PBS洗2遍。每孔加入琼脂糖液2.5ml.4-6天后观察噬斑。

挑选1个大小适中噬斑分别感染BHK-21细胞，待细胞病变明显(NDV感染的BHK-21细胞会发生明显的细胞融合现象时(如图12)提取细胞总RNA。

以这个总RNA为模板，用非特异性引物(Random 6primer(3801))作逆转录，获得第一条cDNA。

再分以此cDNA为模板用特异性引物和ExTaq酶作PCR(其中特异性引物如下附表1中的各质粒对应的引物，PCR的反应条件见表2、表3和表4)；

分别将这些PCR产物纯化后克隆进pMD19载体，再用pMD19载体两端的引物(M13-F，M13-R)分别测序。总共10个质粒覆盖DHN3全基因组，详细见附表1。

表1用于检测DHN3序列的质粒表

引物L1-F见SEQ ID NO：2；引物L1-R见SEQ ID NO：3；引物L2-F见SEQ ID NO：4；引物L2-R见SEQ ID NO：5；引物L3-F见SEQ ID NO：6；引物L3-R见SEQ ID NO：7；引物L4-F见SEQID NO：8；引物L4-R见SEQ ID NO：11；引物PD1-F见SEQ ID NO：9；引物PD1-R见SEQ ID NO：10；引物PD2-F见SEQ ID NO：12；引物PD2-R见SEQ ID NO：13；引物PD3-F见SEQ ID NO：14；引物PD3-R见SEQ ID NO：15；引物MINI-F见SEQ ID NO：16；引物mini-r见SEQ ID NO：17；引物P-F见SEQ ID NO：18；引物P-R见SEQ ID NO：19；引物NDV-ST-W R见SEQ ID NO：20；引物NP-LB-R见SEQ ID NO：21；引物M13-F见SEQ ID NO：22；引物M13-R见SEQ ID NO：23。

表2 PCR的反应条件

表3 PCR的反应条件中的扩增引物表

表4 PCR的反应条件中不同酶的应用配方表

备注：

1.R050PCR反应程序

2.RR902 PCR反应程序

3.本发明中所涉及到的PCR反应体系的配制及反应程序的设定均按照上述方法进行。

在PCR过程中只有退火温度和延伸时间会根据具体引物和片段不同进行调整，其他均不发生变化。下面将不再详述PCR反应的过程。

通过NCBI Blast软件将测序结果与已发表的所有NDV序列比对，其结果显示如图13。结论是此DHN3新城疫病毒全基因组全长15192nt,属II类VII型NDV。

为了保证序列准确无误，上述实验从病毒感染到测序结果分析反复重做了3次。其测序结果均相同，证实由这个噬斑获得的是一株纯化的DHN3病毒株。

DHN3全基因组的序列见序列表SEQ ID NO：1。

三、全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备

下面具体描述本发明的方法：一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，

包括如下步骤：

步骤1：为获得重组病毒，首先需建立1个能获得全基因组单股负链RNA的基础质粒pBR322-Base。

为了获得较高的转录水平且保证由此转录的RNA不含任何外源核糖核酸，在pBR322载体上分别引入1个T7启动子，1个T7终止子以及1个HDVRibozyme，使之最终能在外源的T7RNA聚合酶的作用下准确合成DHN3全基因组负链全长RNA。

为了方便将DHN3全基因组通过同源重组的方法整合到pBR322载体上，在T7启动子下游引入DHN3的3’末端的HC1；在HDV Ribozyme的上游引入DHN3的5’末端部分碱基HC2；碱基HC1在DHN3全基因组序列中的位置顺序为15192-15159nt；碱基HC2在DHN3全基因组序列中的位置顺序为141-1nt。

含T7终止子、HDVRibozyme、HC2、HC1、T7启动子的DNA片段通过人工合成，并通过同源重组的方式组合到pBR322载体上获得pBR322-T7Pro-HDV_Ter，即基础质粒pBR322-Base(质粒示意图1)。

步骤2：建立3个亚基因组过渡载体：DHN3全基因组共15192nt，如将全长cDNA一次性通过RT-PCR获得，一是困难，(一般市场可买到的DNA聚合酶很难合成大过10k的DNA片段)，二是容易在PCR过程中引入随机突变。因此将DHN3全基因组分成3个片段，将其分别克隆到pBR322载体。片段的大小是基于它所持有的BtgZ1酶切位点来确定的，以利于随后的体外DNA片段连接。

具体构建方法如下：

A.制备质粒片段：将pBR322载体用Hind3和Nhe1作双酶切，然后经胶回收备用。

B.制备目的基因片段：分别用带同源臂的引物和相应的模板(见下表5)在高保真DNA聚合酶的作用下扩增带同源臂的DNA片段，经跑DNA胶验证后回收备用。

将目的片段和pBR322载体片段用重组酶链接，参考表6。经细菌转化，单菌落PCR初选，扩增质粒DNA，酶切质粒DNA后跑DNA胶复选，最后测序验证。

用于构建pBR322-PNP质粒的目的片段包括NP,MINI和P。

用于构建pBR322-PDP质粒的目的片段包括P，PD1和PD2，PD3。

用于构建pBR322-LPD3质粒的目的片段包括L1，L2，L3,L4和PD3。

以上3个中间质粒分别图2-4所示，其中，图2为：pBR322-PNP质粒示意图；图3为：pBR322-PDP质粒示意图；图4为pBR322-LPD3质粒示意图。

表5目的片段所涉及的模板和引物表

引物C-Sac11BtNhe-ST-R见SEQ ID NO：24；引物C-NP-F见SEQ ID NO：25；引物C-Mini-R见SEQ ID NO：26；引物C-Mini-F见SEQ ID NO：27；引物C-P-R见SEQ ID NO：28；引物C-HindBt-P-F见SEQ ID NO：29；引物C-BtNhe-P-R见SEQ ID NO：30；引物C-P-F见SEQ IDNO：31；引物C-PD1-R见SEQ ID NO：32；引物C-PD1-F见SEQ ID NO：33；引物C-PD2-R见SEQ IDNO：34；引物C-PD2-F见SEQ ID NO：35；引物C-PD3-R见SEQ ID NO：36；引物C-HindBtg-PD3-F见SEQ ID NO：37；引物C-BtNhe-PD3-R见SEQ ID NO：38；引物C-PD3-F见SEQ ID NO：39；引物C-L1-R见SEQ ID NO：40；引物P-L2-R:见SEQ ID NO：41；引物P-L3-F见SEQ ID NO：42；引物C-HindBtNot-L4-F见SEQ ID NO：43；

表6各质粒的构建配方表

备注：

1.在分别扩增完构建PBR322-PNP质粒,PBR322-PDP质粒,PBR322-LPD3质粒所需要的目的片段后，根据上表6中的重组体系进行混合，之后按照同源重组的步骤进行操作，构建相应质粒。

2.由PBR322-DHN3质粒构建策略可知，病毒基因组中包含两个BtgZⅠ酶切位点，根据这两个酶切位点将病毒全基因组分成3个大片段，此即我们构建PBR322-PNP,PBR322-PDP,PBR322-LPD3三个质粒中所包含的三个大片段。同时在对病毒基因组进行基础测序时有将病毒全基因组分成10个小片段(NP,P,PD1,PD2,PD3,L1,L2,L3,L4),BtgZⅠ酶切位点刚好处于P片段和PD3片段上，故在构建PBR322-PNP,PBR322-PDP,PBR322-LPD3质粒时扩增P片段和PD3时以P左，P右，PD3左，PD3右来代称。

3.由于L蛋白是NDV病毒的核衣壳蛋白，所以在完成质粒PMD19-L1,PMD19-L2,PMD19-L3,PMD19-L4后首先构建了质粒PXJ40-L，用作拯救病毒的辅助性蛋白。故而在构建PBR322-LPD3质粒时使用的模板之一是PXJ40-L，此质粒已经包括了L基因的全部序列。

在构建PBR322-LPD3过程中将L基因分作2段扩增，称之为L1-2,L3-4,(其中，L1-2是指小片段L1和L2的连续的序列，其由引物C-L1-R、P-L2-R，模板pXJ40-L构建得到，L3-4是指小片段L3和L4的连续序列，其由引物P-L3-F、C-HindBtNot-L4-F，模板pXJ40-L构建得到)；并且需要指出的是在扩增L3-4的引物C-HindBtNot-L4-F中包含构建PBR322-DHN3质粒时所需的同源区以及一个BtgZⅠ酶切序列，这样便可以使BtgZⅠ将PBR322-LPD3中的病毒基因组序列完整切下，并且切下的片段直接用于PBR322-DHN3质粒的构建。

4.上表6中PBR322-PNP质粒,PBR322-PDP质粒,PBR322-LPD3质粒的构建过程中所涉及到的PCR扩增反应使用到的酶全部为PrimeSTARGXLDNAPolymerase(R050,TAKARA),反应体系参考前面所述。根据此酶R050的特性，在扩增反应中预变性温度和时间均为95℃，3min,变性温度和时间为98℃，10s,退火温度和时间使用的均为60℃，15s,延伸的温度均为68℃延伸时间则根据片段大小按照1000bp延伸60s的比例适当选择。反应体系均为30μl。

5.本发明中涉及到使用同源重组方法的实验中，使用的试剂盒均为ClonExpressMultisOneStepCloningKit(C113，诺维赞)，将不再赘述。

上表中，模板质粒pXJ40-L的构建方法为：

通过设计4对带同源重组序列的特异性引物(具体见表7)，分别以pMD9-L1，pMD9-L2，pMD9-L3和pMD9-L4为模板，扩增出能用于将L完整序列克隆进pXJ40载体的片段L1，L2,L3和L4。

L1的5’末端同时带有与pXJ40BamH1端同源的同源臂，L4的3’末端则带有与pXJ40Pst1端同源的同源臂。

将载体pXJ40用BamH1和Pst1双酶切，再通过胶纯化回收。将上述4个片段L1，L2,L3和L4和BamH1和Pst1双酶切后的pXJ40加在一起，在重组酶(ClonExpressMultisOneStepCloningKit)的作用下作同源重组。将重组产物转化进DH5α细胞，经单菌落PCR筛选。用引物PXJ40-F(pXJ40-F:gcaacgtgctggttattgtg，见SEQ ID NO：44)/P-L1-R(P-L1-R:ggacagttgactcattgctaacata，见SEQ ID NO：46)扩增出正确的PCR产物为2110bp，参考图9；用引物P-L3-F/P-L3-R扩增出正确的PCR产物为2027bp，参考图10。

图9-10显示证明检测8个菌落，8个阳性菌均产生了正确分子量的PCR产物。

进一步将其中一株菌培养扩增，提取质粒DNA。再经BamH1和Pst1双酶切，正确的酶切产物应为6230bp和5081bp。实验结果如下图11所示，证实该质粒含正确分子量的DNA片段。

表7用于建立pXJ40-L的PCR引物

引物P-L1-BamH1-F见序列表SEQ ID NO：45；引物P-L1-R见序列表SEQ ID NO：46；引物P-L2-F见序列表SEQ ID NO：47；引物P-L2-R见序列表SEQ ID NO：48；引物P-L3-F见序列表SEQ ID NO：49；引物P-L3-R见序列表SEQ ID NO：50；引物P-L4-F见序列表SEQ ID NO：51；引物P-L4-Pst1-R见序列表SEQ ID NO：52；

表8质粒pXJ40-L构建配方表

备注：1.构建PXJ40-L质粒时扩增各片段时使用的是R050高保真酶，其退火温度均为60℃，延伸时间计算方法及扩增体系均按照前面R050酶的说明计算。

2.鉴定质粒PXJ40-L时，使用引物PXJ40-F和P-L1-R鉴定，使用的是RR902酶。配制反应液体系反应程序及延伸时间计算均按照前面所述，此对引物的退火温度为57℃。

3.本发明所用的载体质粒pXJ40来源于华南农业大学的群体微生物中心刘定祥教授实验室，其质粒的结构示意图如图15，图15所示的pXJ40-NEW即为pXJ40；其序列见序列表SEQ ID NO：60；本领域普通技术人员可根据该序列表通过人工序列合成方法得到。华南农业大学的群体微生物中心刘定祥教授实验室可提供如图15所示的质粒的结构图示的载体质粒。

同时，载体质粒pXJ40也可以通过本领域其他商业化的质粒转换得到，具体来说，采用商品质粒pXJ40-flag可以制备得到本实施例所用的pXJ40，其改建原理为：为了避免Flag对病毒蛋白功能的影响；我们从商品化的质粒pXJ40-Flag经过改建去除Flag获得pXJ40-New。

pXJ40-flag的来源渠道有至少以下两种；

渠道一、实验室保存；pXJ40-flag保存于华南农业大学的群体微生物中心刘定祥教授实验室，华南农业大学的群体微生物中心刘定祥教授实验室可提供pXJ40-flag质粒；pXJ40-flag在刘定祥教授发表的文献中有记载，具体记载为“pXJ40F(with a Flag tag)”，该文献出处为：Journal of virology,Dec.2009,p.12462-12472，《Inhibition ofProtein Kinase R Activation and Upregulation of GADD34Expression Play aSynergistic Role in Facilitating Coronavirus Replication by Maintaining DeNovo Protein Synthesis in Virus-Infected Cells》作者廖瑛、王晓星、刘定祥。

渠道二、从普如汀生物技术(北京)有限公司购买，货号为pXJ40-flag。

具体制备步骤为:

S11：制备质粒片段：2ug pXJ40Flag+1ul EcoR1+1ul Bsa1+5ulBuffer加水至50ul，37℃孵育2小时；胶回收2998bp片段备用；

S12：PCR扩增无Flag片段：以2ng pXJ40Flag为模板，用引物dFlagF:actatagggcgaattcggatccaagcttctcg(见序列表SEQ ID NO：53)/Bsa1R:tgagcgtgggtctcgcggt(见序列表SEQ ID NO：54)，高保真DNA聚合酶(TAKARA公司R050)通过PCR扩增1322bp片段(退火温度60度，延伸时间1分30秒)，胶回收备用。

S13：通过同源重组的方法用ClonExpress Multis One Step Cloning Kit(诺维赞C113)，上述步骤1得到的2998bp片段50ng,上述步骤2得到的1322bp片段22ng,buffer4ul,酶2ul，加水至20ul；37℃孵育30分钟。

S14：将上述重组产物转化进DH5α(常规方法，TAKARA)，氨苄青霉素培养筛选。常规制备质粒后用引物pXJ40R:agcggaagagtctagagtcg(见序列表SEQ ID NO：55)进行测序验证。含正确序列(无Flag序列)者为pXJ40-New质粒，其质粒的结构图示如图15。

步骤3：从pBR322-PNP质粒、pBR322-PDP质粒、pBR322-LPD3质粒上酶切回收片段PNP、片段PDP，以及片段LPD3；并将片段PNP、片段PDP，以及片段LPD3连接得到全长DHN3-A备用；

具体来说，参考表9，pBR322-PNP质粒用BtgZ1和Hind3双酶切后回收片段PNP；

从pBR322-PDP质粒回收片段PDP的方法为：pBR322-PDP质粒用BtgZ1单酶切后回收片段PDP；

从pBR322-LPD3质粒回收片段LPD3的方法为：pBR322-LPD3质粒用BtgZ1单酶切后回收片段LPD3；

表9各质粒片段的回收配方和工艺参数表

备注：

1.片段PNP,片段PDP,片段LPD3的制备按照上表中的酶切体系及时间操作；酶切结束后，可取少量作凝胶电泳观察酶切是否完全，如不完全，需适当多加一点酶或延长孵育时间，或二者兼备；

2.片段PNP的制备需要Hind3和BtgZⅠ两个酶的切割。需要指出的是这两个酶切反应是分别进行的，不是同时进行。即先使用Hind3酶切，琼脂糖电泳胶回收到目的产物后再使用BtgZⅠ酶切。所以上表中的PBR322-PNP’指的是Hind3酶切后的产物。

3.制备含0.03％全式金染色液的0.6％琼脂(TsingKe,TSJ001)凝胶。取0.6微克琼脂加100毫升TAE缓冲液置微波炉加热1-2分钟至琼脂完全融化，待冷却至50℃左右加全式金染色液(按1：3000倍稀释)混匀后铺胶。注意染色剂加多了可能抑制DNA片段的链接。将上述的酶切产物全部经上述的凝胶电泳分离。将凝胶置一清洁的玻璃平板上，用一次性不锈钢刀片将正确的目的片段切下回收。用GelExtractionKit(D2500-02，OMEGA)按试剂盒提供的方法进行纯化。

所述片段PNP、片段PDP、片段LPD3通过高浓度T4链接酶作体外连接，获得全长DHN3-A。具体参数参考表10。

表10 PBR322-DHN3质粒的连接配方表

备注：

1.片段PNP,片段PNP,片段LPD3按照上表的量计算使用，并连接。

2.将连接产物直接进行试剂盒(MiniBESTDNAfragmentpurificationkitVersion4.0，TAKARA，9761)纯化，纯化后的产物跑琼脂糖电泳胶看是否连接完全。

步骤4：用上述pBR322-Base质粒为模板，使含同源臂配对碱基的特殊引物(A2-F:atcggtagaaggttccctcaggttc(见序列表SEQ ID NO：56)；A2-R:ggtcctatagtgagtcgtattaatg(见序列表SEQ ID NO：57))，用PrimerstarGXL试剂盒提供的材料并按照试剂盒提供的方法进行PCR扩增。

用上述纯化试剂盒(MiniBESTDNAfragmentpurificationkitVersion4.0，TAKARA，9761)，按试剂盒提供的方法进行对本步骤的PCR扩增产物进行纯化，制得带同源臂的质粒片段。

步骤5：将步骤4得到的质粒片段pBR322-Base与DHN3-A进行同源重组得到全基因组表达载体pBR322-DHN3。

具体来说，通过使用购自诺维赞重组试剂盒(ClonExpressMultisOneStepCloningKit，C113)来进行。取上述带同源臂的质粒片段、上述DHN3全基因组DNA片段(即上述体外连接产物，DHN3-A)按诺维赞重组试剂盒提供的方法进行同源重组，具体配方参数可参考表11。

表11质粒片段与DHN3-A同源重组的配方表

试剂	用量
		DHN3-A	200ng
pBR322-Base	91.02ng
		5×CE MultiS Buffet	4μl
Exnase MultiS	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	up to 20μl

步骤6：将重组产物转化入DH5a感受态细胞，用特异性引物(C-pBR322-R：gaaattgcatcaacgcatatagcgc(见序列表SEQ ID NO：58)；C-NP-F：catctggttgcccttgcggcttgttc(见序列表SEQ ID NO：59))作单菌落PCR，获得3个阳性菌落A1-A3，参考图5，图5为菌落A1的质粒A1-A3的电泳图。

将菌落A1用Sac1酶切作初步鉴定，正确的酶切产物应是1个8482bp,1个7065bp,1个3132bp,1个908bp,和1个32bp的片段；结果如图6，图6为质粒A1的电泳图,显示该酶切产物与序列推断的结果一致。32bp片段太小无法在琼脂电泳胶中显示。命名该质粒为pBR322-DHN3。

将此质粒再次测序，验证无误后扩增备用。

pBR322-DHN3的质粒的结构图示如图7所示；

pBR322-DHN3的质粒的结构图示如图8所示。

通过上述描述可以得知，本发明解决了大基因组不易人工合成的难题，避免了随机突变发生。

引用文献：

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Eun-Kyoung Lee et al.Molecular epidemiological investigation ofNewcastle disease virus from domestic ducks in Korea.Veterinary Microbiology134(2009)241–248。

序列表

<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120> 一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15192

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

accaaacaga gaatccgtga ggtacgataa aaggcgaaga agcaatcgag atcgtacggg 60

tagaaggtgt gaaccccgaa cgcgagatcg aagcttgaac ctgagggaac cttctaccga 120

tatgtcgtct gtttttgacg aatacgagca gctccttgct gcccagaccc gccctaacgg 180

agcccatgga gggggagaga aagggagcac cttaaaagtt gaggtcccag tatttaccct 240

aaacagtgat gatccagagg atagatggaa ctttgcggta ttctgtcttc ggattgccgt 300

tagtgaggat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctt atatccctct tatgctccca 360

ttctcaggtg atgagaaacc atgttgccct tgcaggaaaa cagaacgagg ccacactagc 420

tgttcttgag atcgatggtt ttgctaataa tgtgccccag ttcaacaata ggagtggagt 480

gtccgaggag agagcacaga gattcatggt aattgcaggg tctctccctc gggcatgcag 540

caacggtact ccgtttgtca cggctggggt tgaagatgat gcaccagaag atatcactga 600

cactctggaa aggatcctat ctgtccaagt ccaagtatgg gtcacggtag caaaggccat 660

gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga ataaataagt atatgcagca 720

gggtagagtc cagaagaagt acatccttca tcctgtatgc aggagtgcaa ttcaactcat 780

aatcagacat tctctggcag tccgtatttt cctggttagt gagctcaaga ggggccgtaa 840

tacagcaggt gggagctcta catattacaa tttggtcggg gatgtagact catacatcag 900

aaataccggg cttactgcgt ttttcctaac actcaaatat ggaatcaata ccaagacgtc 960

agctctcgca ctcagcagcc tcacaggtga tatccaaaaa atgaaacagc tcatgcgttt 1020

atatcggatg aaaggtgaaa atgcaccata catgacattg ttaggtgaca gtgaccagat 1080

gagctttgcg ccagccgaat atgcacaact ttattctttt gccatgggca tggcatcagt 1140

cttagataag ggaactggca agtaccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200

gcgacttgga gtagagtatg ctcaggctca gggaagtagt atcaatgaag acatggctgc 1260

tgagttaaaa ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aacgagtatc 1320

tgaagaaatc ggcagcatgg acattcctac tcaacaagca ggagtcctca ccgggctcag 1380

tgacgaaggc ccccgaactc cacagggtgg atcgaacaag ccgcaagggc aaccagatgc 1440

tggggatggg gagacccaat tcctggattt tatgagaaca gtggcgaaca gcatgcggga 1500

atcgcctaat cctgcacaga gcaccactca tctagagcct cccccgaccc ctggggcatc 1560

ccaagacaac gacactgact gggggtactg atcgactact cccagcctgc ctccatagga 1620

ccacaccaaa cccctccccc aaaacccccc cacacccccc gacccacaac cccgcacgac 1680

ccccccaaca aaagctcccc cccaccctct cccccacccc cagccacacg accccatcca 1740

cccgggacaa cacaggcaca gctcggccag tcaacaatcc tcccagagtc caaggtatta 1800

gaaaaaaata cgggtagaag agagacatcc agagaccagg acgggtcacc aagctctctg 1860

ttctcccttc tacccggtga gttagggtga agatggctac ctttacagat gcggagatag 1920

atgacatact tgagaccagt gggactgtca ttgatagcat aattacggcc cagggcaaat 1980

cagccgagac cgtcggaaga agtgcgatcc cgcagggcaa gaccaaagct ccaagcacag 2040

cacgggagaa gcacgggagt gcccagccac acgccagtca ggacgtcccc gaccaacaag 2100

acagaacaga aaaacagcca tccacacctg agcaggcaac cccacacaac aacccaccga 2160

ccacacccac cgaaccgccc tccacccagg ccgcaagcga gaccagcgac acacagctca 2220

aaaccggagc aagcaactcc cttctgtcca tgctcgacaa attaagcaat aaatcgtcta 2280

atgctaaaaa gggcccatgg tcgggtcccc aagaagggca tcaccaatct ccggcccaac 2340

aacacgggaa ccagtcgagc catggaagca accagggaag accacagcac caggtcaagg 2400

ccgtctctgg aaaccggggc atagacgaga acacagcata tcatggacaa cggaaggagt 2460

cacaaccatc agctggtgca acccctcatg cgccccagtc agggcagagc caagacaata 2520

ttcctgtacc tgtggatcgt gtccagctac ctgccgactt tgcgcaggcg atgatgtcta 2580

tgatggaggc attatctcag aaggtaagta aagttgatca tcagctggat ctggtcttga 2640

aacagacatc ctctattcct atgatacgat ctgaaatcca acagctcaag acatctgttg 2700

cgatcatgga agctaactta ggtatgatga aaattctgga ccctggttgt gccaacattt 2760

catctttaag tgatctccgg gcagtagccc gatcccaccc agtcctagtt tcgggccccg 2820

gagacccatc tccttacgtg acacaagagg gtgaaatgac gctcaataaa ctctcacaac 2880

cagtgcagca cccttctgaa ttgattaagt ctgccaccgc aagcgggcct gacatgggag 2940

tggagaagga cactgtccgc gcattaatca cctcacgccc gatgcatcca agctcctcgg 3000

ctaagctcct gagcaagcta gatgcagcca agtcaattga agagatcagg aagatcaagc 3060

gccttgcgct gaatggttga tggccgtcac aactcatagc aggctcctgt cgcttcagca 3120

tcacacggaa tcccccggga gccccccctt gcgaatccat gcttcaacac cccagacaac 3180

agccctctct caccatcccc aatccctcgc atgatcgcac aactgcaacc aatctagcag 3240

cattagagat taagaaaaaa cacgggtaga atcaaagtgc ctcgattgaa ccaaaatgga 3300

ctcatccagg acaatcgggc tgtactttga ttctgccctt ccttccagta gcctattagc 3360

atttccgatt atcttacaag atacaggaga cgggaagaaa caaatcactc cacaatacag 3420

gatccagcat cttgattcgt ggacagacag taaggaagac tcggtattta tcaccaccta 3480

cgggttcatc tttcaagttg ggaatgaagg agccactgtc ggtgtgatca atgacaatcc 3540

caggcatgag ctactctctt ccgcaatgct ctgcttaggg agtgtcccga acaacggaga 3600

tcttgttgag ctggcgagag cctgcctcac tatggtggta acctgcaaga agagtgcaac 3660

taacactgag agaatagtct tctcagtagt gcaggcacct cgagtgctgc aaaattgtat 3720

ggttgtgtca aatcggtact catcagtgaa tgcagtgaag catgtgaagg cgcccgaaaa 3780

gatccctggg agcggaaccc tagagtataa agtgaatttt gtctccttga ctgtggtgcc 3840

gagaagggat gtctacagga tcccaactac agtattgaaa gtgtctggct cgagcctgta 3900

caatcttgcg ctcaatgtca ctattgatgt ggacgtggat ccgaagagcc cgttagtcaa 3960

atccctttct aagtccgata gcgggtacta tgcgaatctt tttctgcata tcggacttat 4020

gtccactgta gataagagag gaaagaaagt gacatttgac aagatagagg aaaagataag 4080

gagactcaat ctatctgttg ggctcagtga tgtgctcgga ccctctgtgc ttgtgaaggc 4140

gagaggtgca cggactaagc tacttgctcc tttcttctct agcagtggga cagcctgcta 4200

tcctatagca aatgcctctc cccaggttgc caagatactc tggagccaga ccgcgcacct 4260

gcggagcgtg aaagtcatca ttcaagccgg cactcagcgt gctgttgcag tgaccgccga 4320

tcatgaggta acctccacta agatagagaa gaagcatgcc attgctaaat acaatccttt 4380

cagaaaatag gttacatccc taagactgca gttcacctgc tttcccgaat catcatgaca 4440

ccagataatg atccatctcg actgcttgta gttagttcac ctgtccagca aattagaaaa 4500

aacacgggta gaagagtctg gaccccgacc ggcacactca ggacacagca tgggctccaa 4560

accttctacc aggatcccag cacctctaat gctaatcact cgaattatgc tgatattgaa 4620

ctgcatccgt ctgacaagtt ctcttgacgg caggcccctt gcagctgcag gaattgtaat 4680

aacaggagat aaggcagtca atgtatatac ctcgtctcag acagggtcaa tcatagtcaa 4740

gttgctcccg aatatgccca gagataagga ggcatgtgca agagccccat tggaggcata 4800

taacagaaca ctgactactc tgctcactcc tcttggcgac tccattcgca agatccaagg 4860

gtctgtatcc acgtccggag gaaggagaca aaaacgcttt ataggtgctg ttattggcag 4920

tgtagctctc ggggttgcaa cagcggcaca gataacagca gctgcggccc taatacaagc 4980

caaacagaat gctgccaaca tcctccggct taaggagagc attgctgcga ccaatgaagc 5040

tgtgcatgaa gtcaccgacg gattatcaca attatcagtg gcagttggga agatgcaaca 5100

gtttgtcaat gaccagttta ataacacggc gcgagaatta gactgcataa aaatcacaca 5160

acaggtcggt gtagaactca acctatacct aactgagcta actacagtat tcgggccaca 5220

gatcacctcc cctgcattaa ctcagctaac catccaggcg ctctataatt tagctggtgg 5280

caatatggac tacttattaa ctaagttagg tataggaaac aatcaactca gctcattaat 5340

tggtagcggc ctgatcactg gttaccctat actgtatgac tcacatactc aactcttggg 5400

catacaagtt aatctgccct cagtcgggaa cttaaataat atgcgtgcca cctatctgga 5460

gaccttatct gtaagtacaa ccaaaggata tgcctcagca ctggtcccga aagtagtgac 5520

acaagtcggt tctgtgatag aagagcttga cacctcatac tgtatagagt ccgatctgga 5580

tttatattgt actagaatag tgacattccc catgtctcca ggtatttatt cctgtttaag 5640

tggcaacaca tcagcctgca tgtattcaaa gactgaaggc gcactcacta cgccgtatat 5700

ggcccttagg ggctcagtta ttgctaattg taagataaca acatgcagat gtacagaccc 5760

tcctggcatc atatcgcaaa attatggaga agctgtatcc ctgatagata gacactcgtg 5820

caatgtctta tcattagacg gcataactct gaggctcagt ggggaatttg atgcaactta 5880

tcaaaagaac atctcaatat tagattctca ggtcatcgtg acaggcaatc ttgatatatc 5940

aactgaactt ggaaacgtca ataattcgat cagcaatgcc ttggacaagt tggcagaaag 6000

caacagcaaa ctagaaaaag tcaacgtcag actaactagc acatccgctc tcattaccta 6060

tattgttcta actgtcattt ccctaatttt cggtgcactt agtctggttt tagcgtgtta 6120

cctgatgtac aagcagaagg cacaacaaaa gaccctgtta tggcttggga acaataccct 6180

cgatcagatg agagccacca tgagagcatg aatgcaaata ggaagtggac ggacacccaa 6240

cggcagcccg tgtgtcaatt ccgataacct gtcaagtagg agacttaaga aaaaattact 6300

gggaacaagc aaccaaagag caatacacgg gtagaacggt cagaggagcc acccttcaat 6360

tgaaaattag gcttcacaac atccgttcta ccacaccacc aacaacaaga gtcaatcatg 6420

gaccgcgtgg ttaacagagt catgctggag aatgaagaaa gagaagcaaa gaacacatgg 6480

cgcttagttt tccggatcgc agtcttattt ttaatggtaa tgattctagc tatctctgcg 6540

gctgccctgg catacagcat ggaggccagt acgccacacg acctcgcagg catatcgact 6600

gtgatctcca agacagaaga taaggttacg tctttactca gttcaagcca agatgtgata 6660

gataagatat acaagcaggt agctcttgaa tccccgctgg cactattaaa caccgaatct 6720

gtaattatga atgcaataac ctctctttct tatcaaatta acggggctga gaacagtagc 6780

ggatgcggtg cgcccgttca tgacccagat tatatcgggg ggataggcaa agaactcata 6840

gtggacgaca ttagtaatgt cgcatcattt tatccttctg catatcaaga acacttgaat 6900

ttcatcccgg cacctactac aggatctggt tgcactcgga taccctcatt tgacatgggc 6960

accacccatt attgttatac tcacaatgtg atactatctg gttgcagaga tcactcacac 7020

tcacatcaat acctagcact tggtgtgctt cggacatctg caacagggag ggtattcttt 7080

tctactctgc gctccatcaa tttagatgac actcaaaatc ggaagtcttg cagtgtgagt 7140

gcaacccctt taggttgtga tatgctgtgc tctaaggtca cagggactga agaggaggat 7200

tacaagtcag ttgcccccac atcaatggtg cacggaaggc taggatttga cggtcaatac 7260

catgagaaag acttagacac cacggtctta tttaaggatt gggtggcaaa ttacccgggg 7320

gtgggaggag ggtcttttat tgacggccgt gtatggttcc cagtttacgg agggctcaaa 7380

cctaattcac ccagtgacat cgcacaagaa gggaaatatg taatatacaa gcgccataat 7440

aacacatgcc ccgataaaca agattaccaa attcggatgg ctaagtcctc atataaacct 7500

gggcgatttg gtggaaagcg cgtacagcaa gctatcctat ctatcaaagt gtcaacatcc 7560

ctgggtaagg acccggtgct gactattcca cctaatacaa tcacactcat gggagccgaa 7620

ggcagaatcc tcacagtagg gacatctcac ttcttgtatc aacgagggtc ttcatatttc 7680

tcccctgcct tattgtatcc catgacagta agtaacaaaa cggctacact ccatagtcct 7740

tacatgttta atgctttcac tcggccaggt agtgtccctt gccaggcatc agcaaggtgc 7800

cccaactcat gcatcactgg ggtctatacc gatccatatc ccttaatctt ctataggaat 7860

catactctac gaggggtctt cgggacgatg cttgatgatg aacaagcgag gcttaacccc 7920

gtatctgcag tatttgacaa catatctcgc agtcgtgtca cccgggtgag ttcaagcaac 7980

accaaggcag catacacgac atcgacatgt tttaaagttg tcaagactaa taaagtttat 8040

tgtcttagta tcgcagaaat atccaatacc ctattcgggg aatttaggat cgttcccttg 8100

ctagttgaga tcctcaaaga tgatagagtt taagaagcta gacttggccg attgagccaa 8160

tcataggatg gttgggagga cgacattgcg ccaatcatct cccataatgc ttagagtcaa 8220

gctgaacatt agcataaatc aggatcccgt gttgttgggc aaccgcaatc cgacaatgct 8280

gacatgattg ttctgagtct cgctcactgt cactttatta agaaaaaaca caagaagcat 8340

tgacatataa gggaaaataa ccaacaagag agaacacggg taggacatgg cgggctccgg 8400

tcctgagagg gcagagcacc agatcatcct accagagtca catttatcct ctccattggt 8460

caagcacaaa ttgttatact actggaaatt aaccgggcta ccgcttcctg atgaatgcga 8520

ctttgatcat ctcattatca gcaggcaatg gaagagaata ctggagtcag ccactcctga 8580

cacagagaga atgataaaac ttgggcgggc ggtgcaccag actctcaacc acaattccaa 8640

gatgactgga gtgctccatc ccaggtgttt agaagaactg gctagtattg aggtccctga 8700

ttcaactaac aaattccgga agattgaaaa gaagatccag attcacaaca caagatatgg 8760

agacctgttc acaaagctgt gcgtgcaagt tgagaagaaa ttgctagggt catctctgtc 8820

taataatgtc ccacgatcag aggaattcaa cagcatccgt acagatccgg cattctggtt 8880

tcactcaaaa tggtccagag ccaagttcgc gtggctccat ataaaacaag tccaaaggca 8940

tctgattgta gcagcaagga caaggtctgc agtcaacaag ttagtaacat taaatcataa 9000

gataggccat gtctttatta ctcctgagct tgtcattgtg acacacacag acgagaacaa 9060

gttcacatgt ctcacccagg aacttgtatt gatgtatgcg gatatgatgg aaggcaggga 9120

catggtcaat ataatatctt ctacagcagc acatctcagg aacctatccg agaaaattga 9180

tgatattctg cggttagtag atgctctggc aaaggactta ggtaatcaag tctatgatgt 9240

tgtagcatta atggagggat ttgcatacgg tgccgttcag ctgcttgagc catcaggtac 9300

atttgcagga gatttctttg catttaacct acaggagctc aaaaacacgt taatcgaact 9360

tctccccaat aatatagcgg aagcagtaac tcacgctatt gccactgtat tctctggatt 9420

agaacagaac caagcagctg agatgttgtg cttgctgcgt ttgtggggtc atccattgct 9480

tgagtctcgt agtgcagcaa gagcagtcag gagccagatg tgcgcaccaa agatggtaga 9540

ctttgatatg atcctccagg tattatcttt ctttaaagga acaatcatca atggatacag 9600

aaaaaagaac tcaggtgtgt ggccacgcgt caaagtagat acaatatatg gaaatatcat 9660

tgggcagcta catgctgatt cagcagagat ctcacatgat gtcatgttga gggagtacaa 9720

gagtttatcc gctcttgaat ttgagccatg tatagattat gaccctgtta ccaatctaag 9780

catgttccta aaagacaagg caatcgcaca tcctagtgat aactggctcg cctcatttag 9840

gcggaaccta ctctctgagg accagaagaa acagataaag gaggcaactt caactaaccg 9900

cctcctgata gagttcttag aatcaaatga ttttgatcca tataaagaaa tggaatacct 9960

gacaaccctc gagtacctaa gagatgacag tgtggcagta tcgtactcac tcaaagagaa 10020

agaggtgaaa gtgaatggac ggatttttgc taaattaaca aagaaactaa ggaattgcca 10080

ggtaatggca gaaggaattc tagctgacca gattgcacct ttcttccagg gaaatggggt 10140

cattcaagat agcatatcct tgacaaagag tatgttagca atgagtcaac tgtcctttaa 10200

cagcaataag aaacgtatcg ctgactgcaa agagagggtt tcctcaaacc gcaatcatga 10260

tcccaagagc aagaatcgta gaagagttgc cacctttatc acgactgacc tacaaaagta 10320

ttgtcttaac tggagatatc agacagtcaa actattcgcc catgccatca atcagctgat 10380

gggcctacct catttctttg agtggattca tcttaggctg atggacacta caatgtttgt 10440

aggggatcct ttcaatcctc caagtgaccc gaccgactgt gatctatcaa gagtcccaaa 10500

tgatgatata tatattgtca gtgctagagg gggcattgag ggactctgtc agaagctatg 10560

gacgatgatc tcaattgctg caatccaact tgccgcagca agatctcatt gtcgagttgc 10620

ctgcatggta caaggtgaca atcaagtaat agctgtaacg agagaggtga gatcagatga 10680

ttccccggat atggtattga cgcagttgca tcaggctagt gataatttct tcaaggaatt 10740

gattcatgtc aatcatctga ttggccataa cctgaaggat cgtgaaacca ttagatcaga 10800

cacattcttc atatacagca aacgaatatt caaagatgga gcaatactca gtcaggtcct 10860

caaaaattca tctaaattgg tgctaatatc aggtgacctt agcgaaaaca ctgtaatgtc 10920

ctgtgccaac attgcatcca ctgtagcacg actatgtgag aatgggcttc ctaaggactt 10980

ctgttactat ttgaactacc taatgagttg cgtgcagaca tattttgatt cagagttttc 11040

tattactcac agctcacagt cagattccaa ccagtcctgg attgaggata tctctttcgt 11100

acactcatac gtgttaaccc ctgcccaact ggggggactg agtaaccttc aatactcaag 11160

gctctacaca aggaatattg gcgacccagg gaccactgcc tttgcagagg tcaagcgact 11220

agaagcagtg gggttgttga gtcccagcat catgactaac atcttaacca ggccacctgg 11280

caatggagat tgggccagcc tatgcaacga cccatactct tttaattttg agactgttgc 11340

aagcccaaat attgtcctca agaaacatac acagaaagtc ctatttgaga catgttcaaa 11400

ccctttatta tccggggtac atacagagga caatgaggca gaagagaaag cattggctga 11460

attcttactc aatcaagaag tgattcaccc acgtgtcgca catgctatca tggaagcaag 11520

ctctgtgggt aggagaaagc aaattcaagg gcttgttgac acaacgaaca ctgtgattaa 11580

gattgcactg actaggaggc ccctcggtat caaaagactg atgcggataa tcaattactc 11640

aagcatgcat gcaatgttgt tcagggatga tattttctta tccactagat ccaaccaccc 11700

attagtttct tctaatatgt gctcgctgac gctagcagat tatgctcgga acagaagctg 11760

gtcacccctg acagggggca ggaaaatact gggtgtatcc aaccccgata ccatagaact 11820

tgtggaggga gagattctca gcgtcagtgg agggtgcaca aaatgtgaca gcggagatga 11880

gcagtttact tggttccatc ttccaagcaa tatagagttg actgatgaca ccagcaaaaa 11940

tcccccgatg agagtgccat atctcgggtc gaagactcaa gagagaagag ccgcctcact 12000

tgcgaaaata gcccatatgt caccacatgt gaaagcagca ctaagggcat catccgtgtt 12060

aatctgggct tatggggaca atgaagtgaa ctggactgct gctcttaata ttgcaaggtc 12120

tcgatgcaac ataagctcag agtatcttcg gctattgtca cccctgccca cagctgggaa 12180

tctccaacat agattggatg atggcataac ccagatgaca tttacccctg catctctcta 12240

cagagtgtcg ccttacattc acatatccaa tgattctcaa aggctgttca ccgaagaagg 12300

ggtcaaagag ggaaacgtgg tttaccagca aattatgctc ttgggtttat ctctaattga 12360

gtcactcttc ccaatgacaa caaccagaac atacgatgag atcacattac acctccacag 12420

taaatttagc tgctgtatcc gagaagcgcc tgtcgcagtt cctttcgagc tcctcggact 12480

ggtaccggaa ttaaggatgg taacctcaaa taagttcatg tatgatccta gccctatatc 12540

agagagggat tttgcgagac ttgacttagc tatattcaag agttatgagc ttaacttgga 12600

atcatatccc acgctggagc taatgaacat tctttcgata tctagcggga aattgattgg 12660

ccaatctgtg gtttcttatg atgaagatac ttctataaag aatgatgcta taatagtgta 12720

tgacaacaca cggaattgga ttagtgaggc acagaactca gatgtggtcc gcctgtttga 12780

gtatgcagca ctcgaagtgc tcctcgactg tgcttatcaa ctctactatc tgagggtaag 12840

gggtctaaac aacatcgtcc tatacatgaa tgacttatat aagaacatgc cagggatcct 12900

actctccaat attgcagcca cgatatccca ccccctcatt cactcaaggt tgaatgcagt 12960

aggtctaatt aatcatgacg ggtcacacca gcttgcagat atagactttg tcgaggtgtc 13020

tgcgaaattg ttagtctcct gcactcgacg cgtggtctca ggtttatatg cagggagtaa 13080

gtatgatctg ctgtttccat ctgtcttaga tgataacctg aatgagaaga tgcttcaact 13140

aatttcccgg ttatgctgct tgtacacagt gctctttgct acaacaagag aaatcccaaa 13200

aataaggggc ctatcagcag aagagaaatg ctcaatactc actgagtatc tattgtcgga 13260

tgctgtaaaa ccgttgctta ggtccgaaca attgagttct atcatgtctc ccaacataat 13320

cacgttccca gccaatctat actacatgtc taggaagagc cttaatttga tcagagaacg 13380

agaggacaga gatactatct tgtcgttgtt gttccctcag gagtcactgc ttgagcttcg 13440

cccagtacgg gacattggtg ctcgagtgaa agacccgttt acccgacaac ccgcatcttt 13500

catacaagag ctggatctga gtgccccagc aaggtacgac gcgtttacac tgagtaagat 13560

ttgcttcgag cacacactac cgaacccaag ggaagattac ctagtacgat acttgttcag 13620

aggagtaggg actgcttcat cttcttggta taaggcgtct catcttctat ccatatctga 13680

ggttaggtgt gcaagacatg ggaactcttt atacttagcg gaaggaagcg gagccatcat 13740

gagtcttctt gaattgcata taccacatga gaccatctat tacaatacac ttttctcgaa 13800

tgagatgaac cctccacagc ggcatttcgg acctacacca acacagtttc taaactcggt 13860

cgtttatagg aatctacaag cggaagtgcc atgtaaagat ggatatgtcc aggagttcta 13920

tccattatgg agagagaatg cagaagaaag tgatctgacc tcagataagg cagttggata 13980

tatcacatct gtagtaccct acaggtctgt atcattacta cattgtgaca ttgagattcc 14040

tccagggtcc agtcaaagct tattagatca actggctact aatttatccc tgattgccat 14100

gcattctgtg agagagggcg gggtagtgat catcaaggta ctgtatgcaa tggggtacta 14160

cttccactta ctcatgaatt tattcactcc atgttccacg aaaggataca tactttccaa 14220

tggctacgcc tgtagagggg atatggagtg ttacctgata ttcgttatgg gctgcttagg 14280

cgggcccact ttcgtgcacg aagtggtaag gatggcaaaa gctctaatac aacgacacgg 14340

tacacttcta tctaaatcag atgaaatcac attgactaag ctatttacct cacagcagcg 14400

tcgtgtaaca gatctcctat ccagcccttt accgaagcta atgaggctct taagtgaaaa 14460

cattgatgct gcactaattg aagccggggg acagcccgtc cgtccatttt gtgcagaaag 14520

tttggtgagc acactaacaa atacgaccca gacaactctg atcattgcca gccacattga 14580

cacagtcatc cggtccgtga tttacatgga ggctgagggt gacctcgccg acacagtgtt 14640

cttattaact ccttacaatc tatccacaga cggtaaaaag agaacatcac ttaagcagtg 14700

caccaaacag atcttggaag tcacaatatt gggtctcaga gccaaagaca tcaataaaat 14760

aggtgatgta atcagcttag tactcagagg tgcgatttcc ctagaggacc tcatcccatt 14820

aaggacatac ctgaagcaca gtacctgtcc taaatacctg aaagcggtcc taggtattac 14880

taagctcaaa gaaatgttca caggtacttc gttattgtac ttgactcgcg ctcaacaaaa 14940

attctacatg aaaactatag gtaatgctgc caagggatat tacagtaata atgactctta 15000

aaggcaatcg tacaccaatc agttatcttc ttaactgatg actccctcat tgacttgatt 15060

ataccagatt agaaaaaagt taaattctga ctctttggaa ctcgtattcg gattcagtta 15120

gttaacttta agcaaaaatg cgcaaagtcg tctctaatca cagctatgtc attcaccaaa 15180

tctctgtttg gt 15192

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ggatggttgg gaggacgac 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gcaactgcgt caacaccat 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gttagcaatg agtcaactgt cc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cttcttcggt gaacagcctt tg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ctacagagtg tcgccttac 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ggtaaagggc tggataggag a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tctccaatgg ctatgcctgt a 21

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gcgcaccaaa cagagatttg gtgaatgac 29

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tgggagtgga gaaggac 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gttatctgtg ccgctgt 17

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gactccattc gcaaga 16

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

cattctccag cacgac 16

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ccgataacct gtcaagtag 19

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

gtcagcattg tcggatt 17

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

gaacaagccg caaggg 16

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

catctgcaga cagtcccact ggtctcaagt at 32

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

catacttgag accagtggga ctgtc 25

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

caggagcctg ctatgagt 18

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

accaaacaga gaatccgtga ggta 24

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

tcagtacccc cagtcag 17

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

caggaaacag ctatgac 17

<210> 24

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

attgcatcaa cgcatatagc gctagcgcga tgtaccgcgg atcgttacca aacagagaat 60

ccgtgaggta c 71

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

catctggttg cccttgcggc ttgttc 26

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

gaacaagccg caagggcaac cagatg 26

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

gacagtccca ctggtctcaa gtatg 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

catacttgag accagtggga ctgtc 25

<210> 29

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

tgtttgacag cttatcatcg ataagcttcc tccatcatag acatcatcgc ct 52

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

attgcatcaa cgcatatagc gctagcaggc gatgatgtct atgatggagg 50

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

gacagtgtcc ttctccactc ccatg 25

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

catgggagtg gagaaggaca ctgtc 25

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

gacccttgga tcttgcgaat ggagtc 26

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

gactccattc gcaagatcca agggtc 26

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

gtctcctact tgacaggtta tcgg 24

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

ccgataacct gtcaagtagg agac 24

<210> 37

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

tgtttgacag cttatcatcg ataagcttgt gcgatgtcac tgggtgaatt agg 53

<210> 38

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

attgcatcaa cgcatatagc gctagcccta attcacccag tgacatcgca c 51

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

cgcaatgtcg tcctcccaac catcc 25

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

ggatggttgg gaggacgaca ttgcg 25

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

gtgaatgtaa ggcgacactc tgtag 25

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

ctacagagtg tcgccttaca ttcac 25

<210> 43

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

ttgacagctt atcatcgata agcttgcgat gagcggccgc tccattaata cgactcacta 60

taggaccaaa cagagatttg gtgaatgac 89

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

gcaacgtgct ggttattgtg 20

<210> 45

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

actcactata gggcgaattc ggatccggat ggttgggagg acgacattg 49

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

ggacagttga ctcattgcta acata 25

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

tatgttagca atgagtcaac tgtcc 25

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

gtgaatgtaa ggcgacactc tgtag 25

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

ctacagagtg tcgccttaca ttcac 25

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

cgaatatcag gtaacactcc atatc 25

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

gatatggagt gttacctgat attcg 25

<210> 52

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 52

taagatctgg taccgagctc ctgcaggcgc accaaacaga gatttggt 48

<210> 53

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 53

actatagggc gaattcggat ccaagcttct cg 32

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 54

tgagcgtggg tctcgcggt 19

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 55

agcggaagag tctagagtcg 20

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 56

atcggtagaa ggttccctca ggttc 25

<210> 57

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 57

ggtcctatag tgagtcgtat taatg 25

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 58

gaaattgcat caacgcatat agcgc 25

<210> 59

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 59

catctggttg cccttgcggc ttgttc 26

<210> 60

<211> 4306

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 60

gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60

ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120

ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 180

cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 240

atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 300

tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 360

ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 420

cttattggta gaaacaacta catcctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 480

tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 540

aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg 600

ctgtctcatc attttggcaa agaattgtaa tacgactcac tatagggcga attcggatcc 660

aagcttctcg aggcggccgc cccgggctgc aggagctcgg taccagatct tattaaagca 720

gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 780

aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 840

ttatcatgtc tggtcgactc tagactcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 900

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 960

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1020

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1080

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1140

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1200

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1260

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1320

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1380

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1440

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1500

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 1560

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 1620

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 1680

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 1740

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 1800

tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 1860

atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 1920

tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 1980

aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 2040

catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 2100

gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 2160

ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 2220

aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 2280

atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 2340

cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 2400

gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 2460

agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 2520

gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 2580

caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 2640

ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 2700

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 2760

aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat 2820

catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg 2880

tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 2940

agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 3000

gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg 3060

tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggaaattgt aagcgttaat 3120

attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc 3180

gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt 3240

ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 3300

accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 3360

tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga 3420

cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 3480

agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat 3540

gcgccgctac agggcgcgtc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat 3600

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tagagtccgt tacataactt acggtaaatg 3660

gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 3720

ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 3780

ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 3840

atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 3900

cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 3960

acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 4020

acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 4080

actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 4140

gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc 4200

atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggaacggacc 4260

cctaggcttt tgcaaaaagc tccggatcga tcctgagaac ttcagg 4306

Claims (6)

1.一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：建立pBR322-Base载体，在pBR322载体上引入能够与DHN3全基因组进行同源重组的片段；所述片段上具有与DHN3全基因组的3’末端和5’末端对应的同源臂；

步骤2：构建过渡载体；所述过渡载体为质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3；所述质粒pBR322-PNP的目的片段包括NP、MINI和P基因；所述质粒pBR322-PDP的目标片段包括P，PD1和PD2,PD3基因；所述质粒pBR322-LPD3的目标片段包括PD3和L1,L2,L3,L4基因；

步骤3：构建DHN3全基因组DHN3-A；将质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3进行酶切得到基因片段PNP、PDP和LPD3，将基因片段PNP、PDP和LPD3通过T4链接酶连接得到DHN3全基因组DHN3-A；

步骤4：构建带同源臂的质粒片段；将步骤1中的pBR322-Base载体为模板进行PCR扩增得到带同源臂的质粒片段；

步骤5：构建全基因组表达载体pBR322-DHN3；将步骤4中的质粒片段和步骤3中的DHN3全基因组DHN3-A进行同源重组得到具有DHN3全基因组DHN3-A的质粒pBR322-DHN3；

DHN3全基因组DHN3-A的序列如序列表SEQ ID NO：1；

MINI基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1414-1949nt；PD1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为2935-4956nt；PD2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为4838-6454nt；PD3基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为6261-8283nt；L1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-10709nt；L2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为10174-12299nt；L3基因在序列表SEQ IDNO：1中位置为12238-14433nt；L4基因在序列表SEQ ID NO：1中位置14214-15192nt。

2.根据权利要求1所述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，其特征在于：所述步骤2中pBR322-PNP质粒构建的具体方法为：

步骤211：将pBR322载体用Hind3和Nhe1作双酶切，然后经胶回收pBR322载体片段备用；

步骤212：分别用带同源臂的引物和相应的模板在高保真DNA聚合酶的作用下扩增带同源臂的DNA片段，经跑DNA胶验证后回收备用；

其中，模板为质粒pMD19-NP、质粒pMD19-MINI、质粒pMD19-P；

质粒pMD19-NP对应的引物为C-Sac11BtNhe-ST-R和C-NP-F；

质粒pMD19-MINI对应的引物为C-Mini-R和C-Mini-F；

质粒pMD19-P对应的引物为C-P-R和C-HindBt-P-F；

其中，质粒pMD19-NP为NP基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pMD19--MINI为MINI基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pMD19-P为P基因克隆进pMD19载体中的产物；引物C-Sac11BtNhe-ST-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-NP-F如序列表SEQ ID NO：1；引物为C-Mini-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-Mini-F如序列表SEQ ID NO：1；引物C-P-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-HindBt-P-F如序列表SEQ ID NO：1；

步骤213：将步骤212所获得的DNA片段和步骤211所获得的pBR322载体片段用重组酶链接，得到pBR322-PNP质粒。

3.根据权利要求1所述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，其特征在于：所述步骤2中pBR322-PDP质粒构建的具体方法为：

步骤221：将pBR322载体用Hind3和Nhe1作双酶切,然后经胶回收pBR322载体片段备用；

步骤222：分别用带同源臂的引物和相应的模板在高保真DNA聚合酶的作用下扩增带同源臂的DNA片段，经跑DNA胶验证后回收备用；

其中，模板为质粒pMD19-P、质粒pMD19-PD1、质粒pMD19-PD2、pMD19-PD3；

质粒pMD19-P对应的引物为C-BtNhe-P-R和C-P-F；

质粒pMD19-PD1对应的引物为C-PD1-R和C-PD1-F；

质粒pMD19-PD2对应的引物为C-PD2-R和C-PD2-F；

质粒pMD19-PD3对应的引物为C-PD3-R和C-HindBtg-PD3-F；

质粒pMD19-PD1为PD1基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pMD19-PD2为PD2基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pMD19-PD3为PD3基因克隆进pMD19载体中的产物；引物C-BtNhe-P-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-P-F如序列表SEQ ID NO：1；引物为C-PD1-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD1-F如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD2-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD2-F如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD3-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-HindBtg-PD3-F如序列表SEQ ID NO：1；

步骤223：将步骤222所获得的DNA片段和步骤221所获得的pBR322载体片段用重组酶链接，得到pBR322-PDP质粒。

4.根据权利要求1所述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，其特征在于：所述步骤2中pBR322-LPD3质粒构建的具体方法为：

步骤231：将pBR322载体用Hind3和Nhe1作双酶切，然后经胶回收pBR322载体片段备用；

步骤232：分别用带同源臂的引物和相应的模板在高保真DNA聚合酶的作用下扩增带同源臂的DNA片段，经跑DNA胶验证后回收备用；

其中，模板为质粒PMD19-PD3、质粒pXJ40-L；

质粒PMD19-PD3，对应的引物为C-BtNhe-PD3-R和C-PD3-F；

质粒pXJ40-L，对应的引物为C-L1-R、P-L2-R、P-L3-F、C-HindBtNot-L4-F；

质粒PMD19-PD3为PD3基因克隆进pMD19载体中的产物；质粒pXJ40-L为L基因克隆进pXJ40载体中的产物；引物C-BtNhe-PD3-R如序列表SEQ ID NO：1；引物C-PD3-F如序列表SEQID NO：1；引物C-L1-R如序列表SEQ ID NO：1；引物P-L2-R如序列表SEQ ID NO：1；引物P-L3-F如序列表SEQ ID NO：1；引物C-HindBtNot-L4-F如序列表SEQ ID NO：1；

步骤233：将步骤232所获得的DNA片段和步骤231所获得的pBR322载体片段用重组酶链接，得到pBR322-PDP质粒。

5.根据权利要求1所述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，其特征在于：所述步骤3中，从pBR322-PNP质粒回收片段PNP的方法为：pBR322-PNP质粒用BtgZ1和Hind3双酶切后回收片段PNP；

从pBR322-PDP质粒回收片段PDP的方法为：pBR322-PDP质粒用BtgZ1单酶切后回收片段PDP；

从pBR322-LPD3质粒回收片段LPD3的方法为：pBR322-LPD3质粒用BtgZ1单酶切后回收片段LPD3；

所述片段PNP、片段PDP、片段LPD3通过高浓度T4链接酶作体外连接，获得全长DHN3-A。

6.根据权利要求1所述全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，其特征在于：所述步骤1具体为：

在pBR322质粒上分别引入1个T7启动子，1个T7终止子以及1个HDV Ribozyme；T7启动子下游引入DHN3的3’末端的部分碱基HC1；在HDV Ribozyme的上游引入DHN3的5’末端部分碱基HC2；其中，碱基HC1在DHN3全基因组序列中的位置顺序为15192-15159nt；

碱基HC2在DHN3全基因组序列中的位置顺序为141-1nt。