CN114540424A - Igfbp7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法 - Google Patents

Igfbp7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114540424A
CN114540424A CN202210171076.5A CN202210171076A CN114540424A CN 114540424 A CN114540424 A CN 114540424A CN 202210171076 A CN202210171076 A CN 202210171076A CN 114540424 A CN114540424 A CN 114540424A
Authority
CN
China
Prior art keywords
igfbp7
mouse
gene
muscle tissue
exon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210171076.5A
Other languages
English (en)
Inventor
方美英
雒亚彪
产舒恒
薛明明
肖莲梅
白莹
许桥
汤启国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202210171076.5A priority Critical patent/CN114540424A/zh
Publication of CN114540424A publication Critical patent/CN114540424A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法。采用本发明所述方法构建得到的小鼠模型用于探究IGFBP7基因在小鼠肌肉发育中的重要功能和分子机制。所述小鼠模型敲除了IGFBP7基因中第三外显子，先后通过打靶载体的构建和ES打靶，构建F0嵌合体小鼠，F0嵌合体小鼠与组织特异性Cre工具鼠杂交获得F1代敲除杂合子，最终F1代杂合子近交获得IGFBP7基因敲除纯合子小鼠。本发明对于IGFBP7基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础，对完善肌肉发育调控网络具有重大意义。

Description

IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法
技术领域
本发明涉及遗传学和生物技术领域，涉及IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型，以及该基因敲除小鼠模型的构建方法。
背景技术
肌肉的生长和发育直接影响着机体的生命活动，此外，其与畜禽生产中的产肉性状直接相关。因此，阐明肌肉生长发育关键候选基因作用分子机制，丰富肌肉生长发育的分子调控网络，一方面可以为人类肌肉生长发育疾病提供重要的治疗靶点，另一方面可加快畜禽分子育种的进展。
胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP7)又称mac25和IGFPB-rP1，是IGFBP家族的分泌蛋白。自从发现IGFBP7在正常柔脑膜细胞和脑膜瘤中的表达差异后，IGFBP7在各种癌症中的潜在作用得到了广泛的研究。目前已经证实，IGFBP7在癌细胞中的表达经常由于该基因的DNA甲基化而下调，当其高水平表达时，会抑制肿瘤的生长。然而，IGFBP7在正常组织发育中的作用知之甚少。IGFBP7可以绑定胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)，可阻止受体与胰岛素样生长因子1(IGF-1)的结合和阻断IGF信号通路的激活。然而，人们对IGFBP7在肌肉生物学中的作用知之甚少。
发明内容
本发明采用TurboKnockout技术通过构建带有loxP位点的小鼠，在与肌肉组织特异性Cre工具鼠杂交后特异性敲除IGFBP7基因第3号外显子，从而实现IGFBP7肌肉组织特异性敲除，用于研究IGFBP7基因在肌肉生长发育中的重要作用和分子机制。
本发明的第一方面提供IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建打靶载体，在小鼠IGFBP7基因第3号外显子两侧插入两个同向的loxP位点，敲除小鼠IGFBP7基因的第3号外显子；
具体地，打靶载体包括：loxP序列、SDA自删除位点、Neo正筛选标记、DTA负筛选标记、靶向IGFBP7第二内含子的左同源臂、靶向IGFBP7第三内含子的右同源臂和IGFBP7第3号外显子条件性敲除区域；在IGFBP7基因内含子2和内含子3各取一段序列作为5’同源臂和3’同源臂，两臂之间插入正筛选标记、自删除位点和cKO区域，同时在5’同源臂5’端连接负筛选标记表达元件。
IGFBP7基因(NCBI reference sequence：NC_000071.6)位于小鼠第5号染色体，总大小为58806bp，目前共鉴定出6个外显子，2个转录本，分别为NM_008048.3(编码282个氨基酸)和NM_001159518.1(编码313个氨基酸)。
打靶载体的构建包括以下步骤：
①分别获取C57BL/6N小鼠IGFBP7基因序列的第二内含子、第三内含子序列，将第二内含子上的一段1983bp序列作为左同源臂，将第三内含子上的一段序列作为右2060bp序列作为右同源臂，以BAC clone RP23-392E和RP23-473O24为模板使用高保真酶通过PCR获得；
②获取C57BL/6N小鼠IGFBP7基因序列第3号外显子，通过PCR扩增IGFBP7基因第3号外显子，在其两侧连接两个同向的loxP位点，并与左同源臂相连；
③通过PCR扩增Neo筛选标记和SDA自删除点，将Neo筛选标记连接到两个自删除位点间，5’端与右loxP位点相连，3’端与右同源臂相连；正筛选标记表达元件长度为3794bp；
④通过PCR扩增DTA负筛选标记，连接到5’同源臂5’端。
(2)打靶载体电转至ES细胞，通过正负筛选挑选和鉴定阳性ES细胞；用于电转的ES细胞来源于C57BL/6N系小鼠；
具体地，通过NotI酶切IGFBP7基因敲除打靶载体，然后回收线性化载体，按照标准电转染程序将线性化载体电转至C57BL/6N胚胎干细胞；转染后的胚胎干细胞在电转24小时后进行G418药物筛选，药物筛选所用的浓度为200ug/ml；通过PCR对阳性克隆进行鉴定，进一步通过Southern blot鉴定PCR鉴定筛选到的阳性克隆；Southern杂交所用的限制性内切酶为MfeI和EcoNI，条带大小分别为7.6kb和10.4kb。
(3)显微注射和胚胎移植获得IGFBP7基因编辑小鼠；
具体地，将鉴定阳性的胚胎干细胞克隆注射到C57BL/6N胚胎中，再植入假孕雌性体内，繁育获得F0代小鼠；提取F0代小鼠尾部DNA，根据本发明第一个方面所述方法中的鉴定引物进行PCR鉴定，鉴定是否为基因编辑杂合小鼠；
阳性ES细胞鉴定所用引物序列和产物大小为：
①鉴定3’同源臂的引物:
F1:5’-GGCTGGTAAGGGATATTTGCCTG-3’(SEQ ID NO.1)，R1:5’-TTCAGGTTTGTCCCACGTCTC-3’(SEQ ID NO.2)，阳性克隆产物大小为2313bp，野生型没有条带；
②鉴定loxP位点的引物：
F2:5’-ACTGCTTTGAGCATTTGCCTTC-3(SEQ ID NO.3)，
R2:5’-GGTCAGTGCTAACAACCATTCCT-3’(SEQ ID NO.4)，阳性克隆产物大小为251bp，野生型为215bp；
③鉴定Neo筛选标记的引物：
F1:5’-GGCTGGTAAGGGATATTTGCCTG-3’，
R3:5’-TTACTTCATAGCTTCCTGCCACC-3’(SEQ ID NO.5)，阳性克隆产物大小为264bp，野生型没有条带。
(4)与肌肉组织特异性表达Cre工具鼠杂交和杂合子近交获得IGFBP7肌肉组织特异性敲除纯合小鼠；所用的组织特异性表达Cre工具鼠，重组酶Cre基因由Myf5启动子在肌肉组织中特异性启动表达；
具体地，将步骤(3)中性成熟的阳性F0代小鼠与Myf5-cre工具鼠进行杂交获得F1代小鼠，通过PCR扩增验证小鼠基因型；将F1代中鉴定得到的肌肉组织特异性敲除杂合子小鼠近交获得F2代肌肉组织特异性敲除纯合子，即为本发明构建的小鼠动物模型。
本发明所述模型小鼠通过特异性敲除IGFBP7基因第3号外显子，使小鼠IGFBP7所有亚型都失去功能，从而实现了小鼠肌肉组织中IGFBP7的功能缺失，该模型的制备有利于阐明IGFBP7基因在小鼠肌肉组织发育中的重要调控作用，此外，在本发明的基础上，通过与不同cre工具鼠的杂交，可以实现小鼠不同组织IGFBP7特异性敲除，有利于解析IGFBP7在小鼠各组织发育过程中的重要作用，具有重要的研究价值。
附图说明
图1为本发明IGFBP7基因敲除打靶载体构建策略示意图。
图2为本发明IGFBP7基因敲除打靶载体质粒图谱。
图3为本发明IGFBP7基因敲除打靶载体的酶切电泳图。
图4为本发明IGFBP7基因编辑胚胎干细胞阳性克隆Southern鉴定的酶切位点示意图。
图5为本发明IGFBP7基因编辑胚胎干细胞阳性克隆Southern鉴定结果图。
图6为本发明IGFBP7基因编辑小鼠F0代阳性鉴定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步阐述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明中第三外显子即为C57BL/6N小鼠IGFBP7基因的第3号外显子。
本发明IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型的构建方法，按照以下步骤具体实施：
1、基因敲除小鼠打靶载体的设计，具体步骤如下：
根据NCBI公布的C57BL/6N小鼠IGFBP7基因(NCBI reference sequence：NC_000071.6)信息，该基因共有6个外显子，其中ATG起始密码子位于外显子1，TAA终止密码子位于外显子6。选择NM_008048.3(编码282个氨基酸)和NM_001159518.1(编码313个氨基酸)两个转录本共有的第3号外显子为靶点进行敲除，该区域的缺失会导致小鼠IGFBP7基因功能的丧失。以NM_001159518.1为例，敲除的片段大小约为610bp，敲除前后其编码蛋白序列如下：
敲除前(SEQ ID NO.6)：
MMERPPRALLLGAGLLLLLLPLSSSSSSDACGPCVPASCPALPRLGCPLGETRDACGCCPVCARGEGEPCGGGAAGRGHCAPGMECVKSRKRRKGKAGAAAGGPATLAVCVCKSRYPVCGSNGITYPSGCQLRAASLRAESRGEKAITQVSKGTCEQGSLIWDTQPAQRSHNPQVENRCFRDKHSREQGPSIVTPPKDIWNVTGAKVFLSCEVIGTPVLIWNKVKRDHSGVQRTELLPGDRENLAIQTRGGPEKHEVTGWVLVSPLSKEDAGEYECHASNSQGQASAAAKITVVDALHEIPLKKGEGAQL*；
敲除后(SEQ ID NO.7)：
MMERPPRALLLGAGLLLLLLPLSSSSSSDACGPCVPASCPALPRLGCPLGETRDACGCCPVCARGEGEPCGGGAAGRGHCAPGMECVKSRKRRKGKAGAAAGGPATLAVCVCKSRYPVCGSNGITYPSGCQLRAASLRAESRGEKAITQVSKGTCEQGSLIWDTQPAQRSHNPQVENRCFRDKHSREQGKKGSLWSSADRTLAW*。
2、基因敲除打靶载体构建，具体步骤如下：
IGFBP7基因敲除打靶载体构建策略示意图如图1所示，IGFBP7基因敲除打靶载体的序列如SEQ ID NO.10所示。采用来自C57BL/6N小鼠文库BAC克隆的RP23-392E12和RP23-473O24序列，通过PCR扩增获得IGFBP7基因的同源臂和cKO(第3号外显子)(conditionalKnockout，条件性敲除)区域。采用in-fusion方法构建打靶载体，将两个loxP位点连接到cKO区域的两侧，并插入两个SDA(self-deletion anchor，自删除位点)位点和NEO正筛选标记，最后在5’同源臂5’端插入DTA负筛选标记元件，根据条件性敲除区域，构建的条件性基因打靶载体如图2所示，通过PCR测序及酶切对打靶载体进行验证，酶切结果见图3，并利用酶切将该打靶载体质粒线性化。
3、ES打靶，电转，具体步骤如下：
步骤1：获取C57BL/6N小鼠的ES细胞培养，胰酶消化，进行细胞计数，确定细胞量足够电转；
步骤2：离心收集细胞，加入电转缓冲液和线性化质粒DNA,冰浴片刻，将混合物加入电转杯进行电转；
步骤3：电转后冰浴片刻，接种与ES培养基中，培养过夜，次日加药，进行抗药性筛选；
步骤4：培养待细胞生长稳定后，挑单克隆于96孔板，将96孔板ES细胞转移至新的96孔板，传代培养，待细胞生长稳定后，96孔板细胞送检PCR,做初次打靶筛选，同时，备份板于-80℃保存。
4、ES打靶-PCR筛选，具体步骤如下：
步骤1：设计和准备引物，进行引物测试选取最佳引物；
步骤2：次日，用无水冰乙醇和氯化钠混合液沉淀基因组DNA；
步骤3：70％乙醇清洗沉淀，去除残留乙醇，加入RNAaseA和注射水混合液，封口37℃培养箱过夜，作为PCR模板；
步骤4：准备96孔PCR板，进行PCR扩增及电泳检测，记录检测结果。
5、ES打靶-细胞复苏传代，具体步骤如下：
步骤1：取出-80℃冻存的备份板，将PCR阳性克隆从96孔板传代至12孔板，12孔板细胞生长稳定后，传至6cm培养皿，再将6cm培养皿细胞传至10cm培养皿；
步骤2：待细胞生长稳定后，消化，离心收集细胞，一部分冻存；一部分送检Southern Blot。
6、ES打靶-Southern Blot，具体步骤如下：
步骤1：设计酶切方案和探针，酶切位点示意图见图4，准备所需试剂及物品，PCR法制备地高辛标记探针；
步骤2：ES细胞基因组DNA的抽提，基因组DNA酶切，酶切产物进行电泳分离；
步骤3：电泳凝胶转膜，将凝胶上的DNA转移至尼龙膜，紫外交联固定尼龙膜；
步骤4：DNA预杂交，预杂交完成后，进行杂交过夜；
步骤5：杂交后，进行洗膜和阻断，加入抗体孵育，洗涤缓冲液洗涤后，加入检测缓冲液平衡，将膜放入底物显色液中，避光显色，显色完成，洗膜缓冲液洗涤，鉴定结果见图5。
7、囊胚注射，具体步骤如下：
步骤1：从交配后3.5天的供体母鼠子宫内获取囊胚，挑选形态良好、发育状态适中的囊胚，转移至注射皿的培养基内
步骤2：将待注射ES转移至注射皿的细胞培养基内，使其均匀排列，密度适中，将ES细胞吸入注射针，将其逐个注射入囊胚腔，注射完成后，可在囊胚腔内看到ES细胞。
8、代孕鼠制备及胚胎移植，具体步骤如下：
步骤1：选取适龄的母鼠与结扎公鼠合笼，获取代孕母鼠；
步骤2：将注射ES细胞的囊胚移植入代孕母鼠的子宫内；
步骤3：将代孕母鼠放在干净的笼盒中，并保温待其清醒后放回笼架饲养，囊胚移植完成，待嵌合体小鼠出生嵌合体出生1周后编号，3周后进行分笼。
9、F0小鼠鉴定是否为嵌合体，具体步骤如下：
步骤1：提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物鉴定；
用于F0代小鼠IGFBP7基因PCR鉴定的特异性引物如下：
(1)用于检测loxP位点的引物序列如下：
P3:ACTGCTTTGAGCATTTGCCTTC；
P4:GGTCAGTGCTAACAACCATTCCT；野生型条带大小为215bp，cKO条带大小为251bp；
(2)用于检测自删除位点的引物序列如下：
P6:AAGGTTACCCGACAGAAACTTTCAA(SEQ ID NO.8)；
P7:TGTCTGGCTTTGCTGTTTTATTAGC(SEQ ID NO.9)；野生型条带大小为187bp，cKO条带大小为305bp；PCR反应体系及反应程序，见表1和表2。
表1PCR体系、：
Figure BDA0003517649470000081
表2PCR反应程序
Figure BDA0003517649470000082
PCR扩增产物电泳鉴定结果如图6所示，从图中可以看出，1、4、5、7、10、11、12号为IGFBP7基因敲除小鼠在有特异性扩增产物，WT小鼠PCR产物没有这个条带。
10、F1小鼠繁殖与鉴定，具体步骤如下：
步骤1：雄性嵌合体出生满8周，与8周龄母鼠Myf5-Cre工具鼠合笼；
步骤2：出生小仔放入新的笼盒，并进行编号，待1周龄左右剪小鼠脚趾送检PCR，进行一次鉴定；
步骤3：保留一次鉴定阳性小鼠，待2周龄左右剪鼠尾送检PCR,进行二次鉴定，经2次PCR鉴定阳性的小鼠，为正确打靶的杂合子小鼠，此部分鉴定引物及程序同第9步。
步骤4：F1代杂合子小鼠近交获得F2代肌肉组织特异性基因敲除纯合子小鼠，此部分鉴定引物及程序同第9步。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法
<130> KHP201118477.1
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctggtaag ggatatttgc ctg 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcaggtttg tcccacgtct c 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actgctttga gcatttgcct tc 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtcagtgct aacaaccatt cct 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttacttcata gcttcctgcc acc 23
<210> 6
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Met Glu Arg Pro Pro Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ala Cys Gly
20 25 30
Pro Cys Val Pro Ala Ser Cys Pro Ala Leu Pro Arg Leu Gly Cys Pro
35 40 45
Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Pro Val Cys Ala Arg
50 55 60
Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Arg Gly His Cys
65 70 75 80
Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys
85 90 95
Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro Ala Thr Leu Ala Val Cys Val Cys
100 105 110
Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser
115 120 125
Gly Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Leu Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu
130 135 140
Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Ser Leu
145 150 155 160
Ile Trp Asp Thr Gln Pro Ala Gln Arg Ser His Asn Pro Gln Val Glu
165 170 175
Asn Arg Cys Phe Arg Asp Lys His Ser Arg Glu Gln Gly Pro Ser Ile
180 185 190
Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Lys Val Phe
195 200 205
Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val
210 215 220
Lys Arg Asp His Ser Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp
225 230 235 240
Arg Glu Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His Glu
245 250 255
Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp Ala Gly
260 265 270
Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ala
275 280 285
Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Leu Lys Lys
290 295 300
Gly Glu Gly Ala Gln Leu
305 310
<210> 7
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Met Glu Arg Pro Pro Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ala Cys Gly
20 25 30
Pro Cys Val Pro Ala Ser Cys Pro Ala Leu Pro Arg Leu Gly Cys Pro
35 40 45
Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Pro Val Cys Ala Arg
50 55 60
Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Arg Gly His Cys
65 70 75 80
Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys
85 90 95
Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro Ala Thr Leu Ala Val Cys Val Cys
100 105 110
Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser
115 120 125
Gly Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Leu Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu
130 135 140
Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Ser Leu
145 150 155 160
Ile Trp Asp Thr Gln Pro Ala Gln Arg Ser His Asn Pro Gln Val Glu
165 170 175
Asn Arg Cys Phe Arg Asp Lys His Ser Arg Glu Gln Gly Lys Lys Gly
180 185 190
Ser Leu Trp Ser Ser Ala Asp Arg Thr Leu Ala Trp
195 200
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaggttaccc gacagaaact ttcaa 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtctggctt tgctgtttta ttagc 25
<210> 10
<211> 13422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcttacaat ttccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 60
ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 120
ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata 180
cgactcacta tagggcgaat tggagctcca ccgcccgggc tggttctttc cgcctcagaa 240
gccatagagc ccaccgcatc cccagcatgc ctgctattgt cttcccaatc ctcccccttg 300
ctgtcctgcc ccaccccacc ccccagaata gaatgacacc tactcagaca atgcgatgca 360
atttcctcat tttattagga aaggacagtg ggagtggcac cttccagggt caaggaaggc 420
acgggggagg ggcaaacaac agatggctgg caactagaag gcacagtcga ggctgatcag 480
cgagctctag gatctgcatt ccaccactgc tcccattcat cagttccata ggttggaatc 540
taaaatacac aaacaattag aatcagtagt ttaacacatt atacacttaa aaattttata 600
tttaccttag agctttaaat ctctgtaggt agtttgtcca attatgtcac accacagaag 660
taaggttcct tcacaaagag atcgcctgac acgatttcct gcacaggctt gagccatata 720
ctcatacatc gcatcttggc cacgttttcc acgggtttca aaattaatct caagttctac 780
gcttaacgct ttcgcctgtt cccagttatt aatatattca acgctagaac tcccctcagc 840
gaagggaagg ctgagcacta cacgcgaagc accatcaccg aaccttttga taaactcttc 900
cgttccgact tgctccatca acggttcagt gagacttaaa cctaactctt tcttaatagt 960
ttcggcatta tccactttta gtgcgagaac cttcgtcagt cctggatacg tcactttgac 1020
cacgcctcca gcttttccag agagcgggtt ttcattatct acagagtatc ccgcagcgtc 1080
gtatttattg tcggtactat aaaacccttt ccaatcatcg tcataatttc cttgtgtacc 1140
agattttggc ttttgtatac ctttttgaat ggaatctaca taaccaggtt tagtcccgtg 1200
gtacgaagaa aagttttcca tcacaaaaga tttagaagaa tcaacaacat catcaggatc 1260
catggcacgc gcttctacaa ggcgctggcc gaagaggtgc gggagtttca cgccaccaag 1320
atctgcggca cgctgttgac gctgttaagc gggtcgctgc agggtcgctc ggtgttcgag 1380
gccacacgcg tcaccttaat atgcgaagtg gacctcggac cgcgccgccc cgactgcatc 1440
tgcgtgttcg aattcgccaa tgacaagacg ctgggcgggg tttgctcgac attgggtgga 1500
aacattccag gcctgggtgg agaggctttt tgcttcctct tgcaaaacca cactgctcga 1560
cattgggtgg aaacattcca ggcctgggtg gagaggcttt ttgcttcctc ttgaaaacca 1620
cactgctcga tttgttagca gcctcgaatc aacccgggcg atcctaggcg atgagatcta 1680
gctgtcgcga agagtggcgc gcctccttga gatgagtggg agaacgttgc atagtggggt 1740
catttccttg ccgtctccag acgttagtac gcactgaaaa tagatgttgg gaggggaaga 1800
ctccgtggcc tgtgaatacg gattgtgcaa gaaagttttc caggccaaga ggggaaggtt 1860
gggcctttcc caggcccccg gtacaagatg accctgtggt tggatattta actaggcttg 1920
aagaccccag acagagggaa taattaactt actcattcca gaatcggggc aaagcatccc 1980
ggagggcgga gtctagggca aagcaccccg gagggcggag tctagggcaa agcacccccg 2040
gagggcggag tctagctctt cagctgctca gtctctctgt gggaacccag gctcccaggt 2100
ctatctcccc tccgaggtac actgtcccaa gtctctctgg agggcccagg gggctgaaac 2160
ctggcattcc aaattagtag atggaaaata gtaattgctc cactaaaaaa gaggggtgtg 2220
tgggctggag agatggctcc gtggttaatt gagttgagtt gagacctctg ccacccacat 2280
acaagccggt gtgatggaat gcagctgttg gcgtaacacc agccggtctc agcgcctcgg 2340
agatcaaggg caaacaagtg agcttccagt tcaccaagag aacctctctc aaaaaaaagg 2400
tggagagcaa tagagaatga tactcaaaat ccatctctac ctgtatgagc acgtgtactg 2460
actccagccg catatgtagc agaggatggc cttgtcagac atcagtggga gaagaggccc 2520
ttggtcctgg gaaggctaga tgccccagtg taggggaatg cctgggccgg gatgggtagg 2580
tgagtgggtg ggtgggagag ctagggggtt cccagagggg taaccaggaa aggggataac 2640
atttgaaata tagataaata aaatatccaa taaaaaagaa aaaggaaaaa aaagaactac 2700
aaaaaaagag gaaataaatg taatttttaa aattagtatt ttagagcaac ttaattaatg 2760
aaaggtaatt aacatccagg caatgttggt cgatgctgca gtgcaaacag ggccatgact 2820
ctttccatat ctgttgatgt gagaagtggg agtttcaggg ccaaagcaga aatcacctgc 2880
tgactttgct catccgggct caagagaaac tgagcaggct tgtagttctg agtctttctc 2940
ctggtccttg cttacacatt agtctctttc ttctgtggat taaagctgga atcagccatt 3000
tccttctgtg aaggcccaga tctacaatat ttaggtcaca cagtctggaa tacaaaccac 3060
gtggtcccac cagggtgaca gagacactct gtgaacgcgt gaatgaagct gttccactga 3120
catttatgga cagtaaatga gaatatcttc tagttctcac atgccacaaa ataatagtat 3180
tctcttaatt ttccccaaac atttgaactg actgatcttt ggaggccata cagacataac 3240
taggaaggca aatttgggtc acagtccatg gtttaccaac tccaggaaca gagagccaaa 3300
gaagcttaca gcaaaaggga tgcccactac gggtggatct gagtaataat agcattttta 3360
ctcacaggag gaagggaaat tactgggttc cagaacacca agaatgggga ggtatcttct 3420
ggcctctctt ggcttcctca gatctgctca cagtcccttt aaccaatgct cactgctggg 3480
aacccagcca ccgaggaccc tgaaactagc cccctcctgc cctttctttg ggggcttggt 3540
cccaacagaa ggcagccact gctttgagca tttgccttct ccactagcag aaagaccctg 3600
tccccacctt cggtgacagc caggcccctt ctgtgccacc agccgatccc caggacagcc 3660
cacttgaatc ttaccccagc aagcctgtgc acataacttc gtatagcata cattatacga 3720
agttatgagt gctctcagca cacttgaaaa taacttctta gatttttttt ttcttttgtt 3780
atacaaggaa tggttgttag cactgacctc caagtgaaga tgccggtcca caaaggaagt 3840
gaaacattca gcatttcaga actgaaattt cttggcgtta atggaaaaaa agaaaaaaag 3900
aaagaaagaa atcccagcta atgcaaaaca gctggcgaaa taaacctcat ttaagctcgg 3960
ctggggaaaa gaaggcaatt ttgctagatt tttgttagat aaacagacct tttttcctac 4020
taattgcatt tgttgttgtg tttgctggtt tgcttatatc agcccttgcc ttccttagaa 4080
agattgcagt atcacgctgg cgacaggaag aggcctgtct gtctggcctt tgagatgcac 4140
gtcagataat ccacagagga gagaggctca taaacaagga tttgccttgt aagatcctga 4200
ctggtgatgg gcagctaaaa agatggactt ggctttctgg cttctcttgt aggtccttcc 4260
atagtgacgc cccccaagga catctggaac gtcactggtg ccaaggtgtt cttgagctgt 4320
gaggtcatcg ggatcccaac ccctgtcctc atctggaaca aggtcagtag tgcaggcctc 4380
gggaaagcat cgtgcaagcc ggaaatcgtt ttttgcatgg cccagggcgg tgggaatggc 4440
acagctcagt ctgcatccac tgccggctgc cccacaacca tgaagcctgt ggcagctggt 4500
atcactctac actggcacgg atctttcctg acctccatca gcccagttct gctttgggta 4560
gcagtgtcca agcagggagc ttgggaaact caaagaaccg tggtgaatat ctaaacccac 4620
tgttttcgtt gcttttggtt actgtgacca aaggttaccc gacagaaact ttcaagggag 4680
gaagaaaggt ggttcgcttt agcttccagg ttcagaggct tatagtccct tacacagcag 4740
ggaagacatg gtgctatccg cggcacttaa gtagttaact ttaaataatg ccaattattt 4800
aaagttaata ggcgatcgca ccatatgaat ctcgaggtta tgtacctgac tgatgaagtt 4860
cctatacttt ctagagaata ggaacttcga agggttccgc aagctctagt cgagccccag 4920
ctggttcttt ccgcctcaga agccatagag cccaccgcat ccccagcatg cctgctattg 4980
tcttcccaat cctccccctt gctgtcctgc cccaccccac cccccagaat agaatgacac 5040
ctactcagac aatgcgatgc aatttcctca ttttattagg aaaggacagt gggagtggca 5100
ccttccaggg tcaaggaagg cacgggggag gggcaaacaa cagatggctg gcaactagaa 5160
ggcacagtcg aggctgatca gcgagctcta gagaattgat cccctcagaa gaactcgtca 5220
agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg 5280
aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg 5340
tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca 5400
ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcatcgccg 5460
tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct 5520
tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg 5580
cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc 5640
attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc 5700
tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc 5760
acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc 5820
agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct 5880
gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg 5940
aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatggcc 6000
gatcccatgg tttagttcct caccttgtcg tattatacta tgccgatata ctatgccgat 6060
gattaattgt caacaggctg caggtcgaaa ggcccggaga tgaggaagag gagaacagcg 6120
cggcagacgt gcgcttttga agcgtgcaga atgccgggcc tccggaggac cttcgggcgc 6180
ccgccccgcc cctgagcccg cccctgagcc cgcccccgga cccacccctt cccagcctct 6240
gagcccagaa agcgaaggag caaagctgct attggccgct gccccaaagg cctacccgct 6300
tccattgctc agcggtgctg tccatctgca cgagactagt gagacgtgct acttccattt 6360
gtcacgtcct gcacgacgcg agctgcgggg cgggggggaa cttcctgact aggggaggag 6420
tagaaggtgg cgcgaagggg ccaccaaaga acggagccgg ttggcgccta ccggtggatg 6480
tggaatgtgt gcgaggccag aggccacttg tgtagcgcca agtgcccagc ggggctgcta 6540
aagcgcatgc tccagactgc cttgggaaaa gcgcctcccc tacccggtag aatttcgacg 6600
acctgcagcc aaagcgctag agccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 6660
cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 6720
atttgtaacc attataagct gcaataaaca agtttagcta tccatcagtc gagaattggc 6780
tcccacggac actccgcccc ttctgagata ccgcatcagt gtttcaggct tcttccatgt 6840
cccttcctgc ataatctcga ccatagacac ctgtttctcg gccatgtcta ttgcggcacc 6900
caccctggcg gaatggccgg tccaggtcct atacctccct ttattggggg tggcgtcccg 6960
tttgttcagc agcacccagg catcactgaa aatcttctcc atggcagggg cggtcagggg 7020
cgtggtagta atgcgggctt tgtttgaccg gtgtataggt gggaagagca cagcgtctgg 7080
atgttctcta agcccactga cgtccagcca gtcattgagc actgctgtgg ttcgccggga 7140
gagcactttg tcaaggcccg cagctgtggt gattgtctta gtgtgactga tgtgcagggt 7200
cactgtgtct cctgtctgat ccaagtcccc aaccctgatg cgtgatattt cagacattct 7260
catgagggtg ttataggcta cgaacaggaa agccctgttg cgcaggtcga ccagccgctc 7320
gctcctgctg agcagcacat ccagcagctt caggtcgtcc cagcgcaggg ggattgcctg 7380
tcctgtcctc tcaccctttt cggttgcggc ttctcttcta attcttctca tggcaagact 7440
cactgacttg tcgtcggaca agggtggcag tccgcagtgg gacagaagca tattaagcat 7500
agcatagtgc ttgtcgatgg tagtggaggc caggtctgca tcgtgcaact gaagaaagta 7560
ttcgcgtgcc atttcaggac taattggaaa ccatgcaagc tgccgagcat ggcaccatct 7620
ggcccagcta tgaaagacca acctcaaatc cctcaaagtg ttaggagcgt acgccccctg 7680
gtcattcata aacctcatga agttttcagc ggcctcctga tactctttgc cgatgtttcg 7740
caggaatcca ccagatgaac cactaataat cagctcagaa accttcctct tcttcttagg 7800
catggccgca ggaaagcaga gccctgaagc tcccatcacc ggccaataag agccaagcct 7860
gcagtgtgac ctcatagagc aatgtgccag ccagcctgac cccaagggcc ctcaggcttg 7920
ggcacactgt ctctaggacc ctgagagaaa gacataccca tttctgctta gggccctgag 7980
gatgagccca ggggtggctt ggcactgaag caaaggacac tggggctcag ctggcagcaa 8040
agtgaccagg atgctgaggc tttgacccag aagccagagg ccagaggcca ggacttctct 8100
tggtcccagt ccaccctcac tcagagcttt accaatgccc tctggatagt tgtcgggtaa 8160
cggtggacgc cactgattct ctggccagcc taggacttcg ccattccgct gattctgctc 8220
ttccagccac tggctgaccg gttggaagta ctccagcagt gccttggcat ccagggcatc 8280
tgagcctacc aggtccttca gtacctcctg ccagggcctg gagcagccag cctgcaacac 8340
ctgcctgcca agcagagtga ccactgtggg cacaggggac acagggtggg gcccacaaca 8400
gcaccattgt ccacttgtcc ctcactagta aaagaactct agggttgcgg ggggtggggg 8460
aggtctctgt gaggctggta agggatattt gcctggccca tggagctagc ttggctggac 8520
gtaaactcct cttcagacct gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaatt 8580
cgatatcaag ctaagcttga ttaactttaa ataatgccaa ttatttaaag ttagtagcgt 8640
cgcacgtgaa atcgatataa cttcgtatag catacattat acgaagttat ggtacccaat 8700
tgactcagtc tgtggtggca ggaagctatg aagtaaggaa gaatcttcaa actcgtgcta 8760
ataaaacagc aaagccagac acccctcttt agctagtttg cttcctcagc aagctcagaa 8820
atggaggata gtctcaatta ttttgtgtgc ttgttgtctg gtcagagggg agacctctgg 8880
ggctctggga gggggtttcg gccccattgt cagaagaatc ctaacagatt ccagttcata 8940
tagccgaggg gcaaaaagaa agagaaggca gttccagcgt ccgggcaccc aaatgtgatc 9000
gggactggaa ttcttgatct ctgttatcaa tctctcggcc tcactttctc cttcagaaag 9060
cttcctccgc agagggcaga attatcctca cagacctccg aagcagcaaa gctttcccag 9120
ctgccgagtg agaaacctta gtctagatca tggttcctgg cagcctctgg cgcccccgtg 9180
tggccagaag aatgcggcca ctgaggaaac tacctggctt gagtgtggtt accaggaaac 9240
gcctggacca cggtgtgggc agaggtgacc cagttctagt acagcagacc gatgacccag 9300
ttctagtaca gctatccctc gcagctgaaa ctttcgttaa agggaataat gggatgttgc 9360
ctctaaattg tgcttcggaa agagatgtgg acggggagtc aggcatgtca ataacgtggt 9420
cggctacgtg ttcatttaaa ccttccccct ggcagctgaa gttccccaat gcttatttgc 9480
ggttagtggc ttgtgaagag catggccgat agttttcaag gaaaaccggc aagaagcttt 9540
gttgcttctc aaggggtctc catggaattt acaaaatgag aagccagggt gactcgaggt 9600
acttaagttt ataagcctca ttgccgaaac ttgcagagaa taaggtctgt ggcaccccgg 9660
caaaatacac atgggtccca ggggaaatga gtcggcctcg ggaggctttg aagttatatg 9720
gcttccctta gaacaccaga caccagacac cagacagagg tggggaccta ggggcttgga 9780
gaaaggggac taaaagaaaa agctcacaac tgcctctgac tcccacccac tccaggacat 9840
ccaaagccct cttctggcct ctgagggcag acccaaactc agatatgcac attaatgagg 9900
attaacatta agtaatggtg ctaacaagaa acagcaccca gagatgtata gcattcggta 9960
gttattggcg ctttttctta tttattcctt atttacaata gcaagatttt tggaagaatc 10020
tgctgcaacc aaagtactct agagctaggc atcaggtgcc gcgtgttctg ggcaggctga 10080
gacaggatgg tgagtttgaa gccatcctga ctatatataa agagatcttg caaaaagatt 10140
aaaataaaat agctagacac ctaaacgact tcttggtctc cccttgagcc tcccccagcc 10200
ccagctggcc atttgtggat agcagggttg ggtttgcttt tttatttgtt tgttttgttt 10260
tgaagattct ttttgtcaca gggcagtggt ggttcattaa tcccagcacc tgggaggcag 10320
aggcaggtgg atttctgagt tcgaggccag ccaggtctac aaagtgagtt ccaggacagc 10380
cagggctaca cagagaaacc ctgtctcgaa ccccccctcc ccaaaaaaag atcctttttg 10440
tcagggtgtg ggggatcttc tattgctctc caccctactt tttgacctag agctcactga 10500
tttgagctag ccagctagcc tggaggatcc tcgggtctcc acctaccctg ctctgagatt 10560
acaggtgcta gtgatgtgtg ggagacttag cagagtctct agcctttgag tcaaacactc 10620
ctcccagaac attacctatt ttattaacat agacggttgc accagctgct tgggaaattc 10680
aaggaaaaaa aatgcttatt tatacacgtc ttcatagctt ccatttgaaa ccctaagtac 10740
caggtttttc tctccgaatt gggcggccgc gtaccagctt ttgttccctt tagtgagggt 10800
taatttcgag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 10860
tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 10920
gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 10980
tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 11040
ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 11100
cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 11160
gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 11220
tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 11280
agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 11340
tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 11400
cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 11460
ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 11520
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 11580
ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 11640
ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 11700
cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 11760
gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 11820
atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 11880
ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 11940
gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 12000
tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 12060
ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 12120
taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 12180
gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 12240
gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 12300
ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 12360
aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 12420
gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 12480
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 12540
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 12600
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 12660
gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 12720
ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 12780
caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 12840
tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 12900
gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 12960
cccgaaaagt gccacctgac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 13020
ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 13080
tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc 13140
ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg 13200
atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 13260
ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 13320
tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 13380
tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aa 13422

Claims (10)

1.IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括：
(1)构建打靶载体，在小鼠IGFBP7基因第3号外显子两侧插入两个同向的loxP位点；
(2)打靶载体电转至ES细胞，通过正负筛选挑选和鉴定阳性ES细胞；
(3)显微注射和胚胎移植获得IGFBP7基因编辑小鼠；
(4)与肌肉组织特异性表达Cre工具鼠杂交和杂合子近交获得IGFBP7肌肉组织特异性敲除纯合小鼠。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，敲除小鼠IGFBP7基因的第3号外显子。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述打靶载体包括：loxP序列、SDA自删除位点、Neo正筛选标记、DTA负筛选标记、靶向IGFBP7第二内含子的左同源臂、靶向IGFBP7第三内含子的右同源臂和IGFBP7第3号外显子条件性敲除区域。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，用于电转的ES细胞来源于C57BL/6N系小鼠。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，打靶载体的构建步骤包括：
(1)C57BL/6N小鼠IGFBP7基因序列的第二内含子的一段序列作为左同源臂、第三内含子序列的一段序列作为右同源臂；
(2)获取C57BL/6N小鼠IGFBP7基因序列第3号外显子，通过PCR扩增IGFBP7基因第3号外显子，在其两侧连接两个同向的loxP位点，并与左同源臂相连；
(3)通过PCR扩增Neo筛选标记和SDA自删除点，将Neo筛选标记连接到两个自删除位点间，5’端与右loxP位点相连，3’端与右同源臂相连；
(4)通过PCR扩增DTA负筛选标记，连接到5’同源臂5’端。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，阳性ES细胞鉴定所用引物序列和产物大小为：
(1)鉴定3’同源臂的引物:
F1:5’-GGCTGGTAAGGGATATTTGCCTG-3’，
R1:5’-TTCAGGTTTGTCCCACGTCTC-3’，
阳性克隆产物大小为2313bp，野生型没有条带；
(2)鉴定loxP位点的引物：
F2:5’-ACTGCTTTGAGCATTTGCCTTC-3，
R2:5’-GGTCAGTGCTAACAACCATTCCT-3’，
阳性克隆产物大小为251bp，野生型为215bp；
(3)鉴定Neo筛选标记的引物：
F1:5’-GGCTGGTAAGGGATATTTGCCTG-3’，
R3:5’-TTACTTCATAGCTTCCTGCCACC-3’，
阳性克隆产物大小为264bp，野生型没有条带。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所用的组织特异性表达Cre工具鼠，重组酶Cre基因由Myf5启动子在肌肉组织中特异性启动表达。
8.权利要求1-7任一所述的构建方法得到的IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型在研究肌肉生长发育与机体生命活动中的应用。
9.权利要求1-7任一所述的构建方法得到的IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型在制备或筛选影响IGF信号通路相关疾病的治疗药物中的应用。
10.权利要求1-7任一所述的构建方法得到的IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型在制备或筛选以IGFBP7缺失或不缺失为靶点的相关疾病治疗药物中的应用。
CN202210171076.5A 2022-02-23 2022-02-23 Igfbp7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法 Pending CN114540424A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210171076.5A CN114540424A (zh) 2022-02-23 2022-02-23 Igfbp7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210171076.5A CN114540424A (zh) 2022-02-23 2022-02-23 Igfbp7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114540424A true CN114540424A (zh) 2022-05-27

Family

ID=81677949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210171076.5A Pending CN114540424A (zh) 2022-02-23 2022-02-23 Igfbp7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114540424A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116064658A (zh) * 2022-06-13 2023-05-05 山东大学 一种多功能Stella重组基因报告小鼠的构建方法及其应用
CN116115738A (zh) * 2023-02-22 2023-05-16 重庆大学 细胞因子Igfbp7在制备治疗小鼠老年性肌肉萎缩的药物中的应用

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Mus musculus insulin-like growth factor binding protein 7 (Igfbp7), transcript variant 1, mRNA", 《GENBANK》, pages 001159518 *
"Mus musculus insulin-like growth factor binding protein 7 (Igfbp7), transcript variant 2, mRNA", 《GENBANK》, pages 008048 *
BRÜNING JC: "A muscle-specific insulin receptor knockout exhibits features of the metabolic syndrome of NIDDM without altering glucose tolerance", 《MOL CELL.》 *
BRÜNING JC: "A muscle-specific insulin receptor knockout exhibits features of the metabolic syndrome of NIDDM without altering glucose tolerance", 《MOL CELL.》, vol. 2, no. 5, 30 November 1998 (1998-11-30), pages 559 *
CHEN Z等: "Exercise protects proliferative muscle satellite cells against exhaustion via the Igfbp7-Akt-mTOR axis", 《THERANOSTICS》 *
CHEN Z等: "Exercise protects proliferative muscle satellite cells against exhaustion via the Igfbp7-Akt-mTOR axis", 《THERANOSTICS》, vol. 10, no. 14, 16 May 2020 (2020-05-16), pages 6448 - 6466, XP055960645, DOI: 10.7150/thno.43577 *
HAJEONG KIM等: "A novel crosstalk between TLR4 and NOD2-mediated signaling in the regulation of intestinal inflammation", 《SCIENTIFIC REPORTS》, vol. 5, pages 12018 *
IYER CC等: "Low levels of Survival Motor Neuron protein are sufficient for normal muscle function in the SMNΔ7 mouse model of SMA", 《HUM MOL GENET.》 *
IYER CC等: "Low levels of Survival Motor Neuron protein are sufficient for normal muscle function in the SMNΔ7 mouse model of SMA", 《HUM MOL GENET.》, vol. 24, no. 21, 1 November 2015 (2015-11-01), pages 6160, XP055347970, DOI: 10.1093/hmg/ddv332 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116064658A (zh) * 2022-06-13 2023-05-05 山东大学 一种多功能Stella重组基因报告小鼠的构建方法及其应用
CN116115738A (zh) * 2023-02-22 2023-05-16 重庆大学 细胞因子Igfbp7在制备治疗小鼠老年性肌肉萎缩的药物中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108070662B (zh) 用于确定猪肉品质性状的遗传标记及其用途
CN109957569A (zh) 基于cpf1蛋白的碱基编辑系统和方法
CN106544361B (zh) 哺乳动物细胞表达载体、表达系统、制备方法和应用
CN112481271B (zh) 一种调控脂肪细胞形成的转录因子c/ebpz及其应用
CN114540424A (zh) Igfbp7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法
CN110913886A (zh) 包含成纤维细胞生长因子21(fgf21)编码序列的病毒表达构建体
CN108913718A (zh) 一种靶向EGFR vⅢ的CAR-T细胞的制备方法及应用
CN112608940B (zh) 一种先天性白内障疾病动物模型构建方法及应用
CN106591371A (zh) Cd16a/gpc3双抗慢病毒表达载体及其构建方法和应用
CN113943737A (zh) 一种鸡ctgf基因在抑制鸡前脂肪细胞分化的应用
KR20140122729A (ko) 태그로서 리소자임의 용도
CN113025752B (zh) 用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因、试剂盒及检测方法
CN112449640A (zh) 使用编码具有增加的表达的重组fviii变体的病毒载体的a型血友病的基因疗法
KR20230017845A (ko) 중추 신경계 장애에 대한 섬유아세포 성장 인자 21(fgf21) 유전자 요법
KR101876488B1 (ko) Myh3 유전자를 포함하는 형질전환체 및 이의 이용
KR102009270B1 (ko) 구제역 O-Thi60 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스
CN106978432B (zh) 敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用
CN111100874B (zh) 打靶载体及整合外源基因至小鼠dc-sign外显子7位点构建bac克隆的方法和应用
CN109022363A (zh) 一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法
CN112626119A (zh) 一种人源cyp2d6*10转基因小鼠模型的构建方法
CN114134170A (zh) 一种ha标签融合表达载体的制备方法及其应用
CN111663187A (zh) 一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法
CN109321602B (zh) Pkd2重组过表达载体及其构建方法和用途
KR102109820B1 (ko) 비스페놀 a와의 결합력이 향상된 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질 및 이를 이용한 박테리아 균주
RU2726541C1 (ru) Рекомбинантная клеточная линия рака молочной железы человека BrCCh4e-134, экспрессирующая простат-специфический мембранный антиген человека

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220527

RJ01 Rejection of invention patent application after publication