CN108070662B - 用于确定猪肉品质性状的遗传标记及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于确定猪肉品质性状的遗传标记及其用途，具体地涉及用于确定猪肉品质性状的遗传标记，其含有由5至300个连续核苷酸组成的多核苷酸或与其互补的多核苷酸，所述连续核苷酸含有序列号1的多核苷酸中的从第1524位至第1527位的核苷酸；用于确定猪肉品质性状的组合物，其含有能够检测遗传标记的试剂；用于确定韩国本地猪的组合物；用于确定猪肉品质性状的试剂盒、微阵列、方法；以及用于确定韩国本地猪肉品质性状的方法。本发明的遗传标记是用于确定猪肉品质性状的特异性标记，因此该标记能够不仅用作客观评价不能用肉眼确定的猪肉品质性状的手段，而且用作鉴别外地猪与韩国本地猪的手段，从而能够有助于建立猪肉分销秩序。

Description

用于确定猪肉品质性状的遗传标记及其用途
技术领域
本发明涉及一种用于确定猪肉品质性状的遗传标记及其用途，具体地涉及用于确定猪肉品质性状的遗传标记，其含有由5至300个连续核苷酸组成的多核苷酸或与其互补的多核苷酸，所述连续核苷酸含有序列号1的多核苷酸中的从第1524位至第1527位的核苷酸；用于确定猪肉品质性状的组合物，其含有能够检测遗传标记的试剂；用于确定韩国本地猪的组合物；用于确定猪肉品质性状的试剂盒、微阵列、方法；以及用于确定韩国本地猪肉品质性状的方法。
背景技术
全球有大约200种猪。其中，欧洲品种约占33％，亚洲品种约占30％。这些猪品种可以根据诸如毛发颜色、大小、身体形状等的表型差异容易地区分。然而，在瘦肉、颜色、保水能力、剪切力等的情况下，它们随时间而变化，因此即使对于专家和普通人也难以通过肉眼基于猪肉来区分猪品种。近来，为提高猪肉品质做出了许多努力。目前，在某些标准或管理下使用科学系统在韩国养殖猪，而获得的韩国本地猪被品牌化，各种品牌的猪肉已经在市场上销售。
作为本研究的一部分，在发现和开发使用各种DNA分析方法鉴定猪肉品种的方向上正在进行积极的研究。例如，韩国专利申请公开号10-2004-0039059公开了一种遗传检测方法，其使用与猪的平均日增重、背部脂肪厚度和肉品质相关的特异性DNA标记来选择具有优异表型性状的猪，韩国专利申请公开号10-2007-0113336公开了一种DNA标记，其使用单核苷酸多态性(SNP)通过在已知参与猪的肌生成的肌细胞生成素基因的5'启动子区中的单个核苷酸序列的差异来检测猪肌肉细胞的数量增加。然而，还没有开发出准确确定猪肉品质性状水平的方法，此外，还没有开发出使用MYH3基因确定猪肉品质水平的方法。
在这种情况下，本发明人努力开发出通过遗传性状确定猪肉品质的方法。结果已确认：MYH3基因是能够确定猪肉品质的基因，能够使用其容易地确定遗传上确定的猪肉品质，从而完成了本发明。
发明内容
[技术问题]
本发明的目的是提供一种用于确定猪肉品质性状的遗传标记，其含有由5至300个连续核苷酸组成的多核苷酸或与其互补的多核苷酸，所述连续核苷酸含有序列号1的多核苷酸中的从第1524位至第1527位的核苷酸。
本发明的另一个目的是提供一种用于确定猪肉品质性状的组合物，其含有能够检测遗传标记的试剂。
本发明的另一个目的是提供一种用于确定猪肉品质性状的试剂盒，其含有该组合物。
本发明的另一个目的是提供一种用于确定猪肉品质性状的DNA微阵列，其含有该遗传标记。
本发明的另一个目的是提供一种用于确定猪肉品质性状的方法，包括：(a)从分离自受试者的样品的DNA扩增遗传标记；以及(b)鉴定步骤(a)的扩增产物的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种用于确定韩国本地猪的组合物，其含有能够检测遗传标记的试剂。
本发明的另一个目的是提供一种用于确定韩国本地猪肉品质性状的方法，包括：(a)从分离自受试者的样品的DNA扩增遗传标记；以及(b)确定步骤(a)的扩增产物的核苷酸序列。
[技术方案]
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供一种用于确定猪肉品质性状的遗传标记，其含有由5至300个连续核苷酸组成的多核苷酸或与其互补的多核苷酸，所述连续核苷酸含有序列号1的多核苷酸中的从第1524位至第1527位的核苷酸。
在本发明中，证实了通过MYH3基因能够确定猪肉品质性状(即肌内脂肪含量和发红度)，并且在韩国本地猪与外地猪之间存在MYH3基因的遗传变异，因此，MYH3基因的标记的检测(包括遗传变异)不仅能够确定猪肉品质性状，而且能够区分外地猪和韩国本地猪，从而完成本发明。
如本文中所用，术语“遗传标记”是指用于鉴定由遗传位点中的突变或修饰引起的遗传多样性的短DNA序列。
为了本发明的目的，遗传标记可以指在猪种之间发生核苷酸变异的基因。
如本文中所用，术语“序列号1的多核苷酸”是指MYH3基因。术语“MYH3基因”是指编码肌球蛋白重链3的基因，构成动物肌肉的肌球蛋白中含有的重链蛋白之一及其核苷酸序列能够从已知的数据库例如NCBI的GenBank(GenBank登录号KX549312)等获得。在具体实施方式中，该基因可以是源自猪的基因，但不限于此。
本发明的遗传标记可以是包含序列号1的多核苷酸中第1524位至第1527位的核苷酸的ACGT的连续核苷酸，但不限于此。
此外，遗传标记还可以包括由包括上述核苷酸的5至300个连续核苷酸、特别是5至280个连续核苷酸、更特别是5至260个连续核苷酸组成的多核苷酸，或与其互补的多核苷酸，但不限于此。
如本文中所用，术语“肉品质性状”是指表示屠宰猪状态的一类表型性状，不包括其骨骼，但可以是肌内脂肪含量、肉色、保水能力、剪切力等，更特别是肌内脂肪含量或肉色，但是表型性状并不特别限于此。肌内脂肪含量是指肌肉中含有的脂肪的量，肉色是指用肉眼识别的肉的颜色，保水能力是家畜肉保持水分的能力，剪切力是指撕开肉时的韧性。通常，当肌内脂肪含量变高、肉色变红、保水能力或剪切力变差时，将肉品质确定为优异。
在本发明中，如果在猪肉中检测到标记，则与未检测到标记时相比，可以确定给定猪肉的肌内脂肪含量高并且肉色发红度增加。
在本发明的具体实施方式中，对通过Jeju本地猪与Landrace或Duroc猪杂交获得的猪的后代进行了关于猪肉品质性状的QTL分析以及连锁和连锁不平衡(LALD)图，结果证实，与猪肉品质性状相关的基因是存在于第12染色体中的MYH3基因(图2至图4)。
此外，MYH3基因的基因型分析的结果证实，在Landrace(外地猪)以及本地猪和外地猪之间的MYH3基因(QTN：即MYH3-1805-1810delGGACTG)的核苷酸序列中存在遗传变异(图11)。此外，限制酶HpyCH4IV导致的原因性核苷酸遗传变异的切割结果证实，两种不同的猪种具有不同的基因切割模式(图12)。
这表明本发明的遗传标记不仅能够区分外地猪和本地猪，而且能够根据物种的区别来确定猪肉品质性状。因此，预期能够使用本发明的遗传标记物来准确地确定肉品质性状的水平，由本发明人首先鉴定出遗传标记。
本发明的另一方面提供一种用于确定猪肉品质性状的组合物，其含有能够检测遗传标记的试剂。
如本文中所用，术语“能够检测遗传标记的试剂”是指能够结合本发明的遗传标记并由此识别或扩增遗传标记的试剂，并且在具体实施方式中，可以指能够特异性结合遗传标记的引物或探针。
如本文中所用，术语“探针”是指能够特异性结合mRNA的核酸片段，其用对应于最短几个核苷酸至最长几百个核苷酸的RNA、DNA等标记。探针可以以寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针、RNA探针等的形式制备。
在本发明中，结合并识别遗传标记的探针包括与含有遗传标记的多核苷酸序列互补的序列，并且可以是DNA、RNA或DNA-RNA杂交体的形式，但是探针是不限于此。此外，探针可以另外用荧光标记、放射性标记等在探针的5'末端或3'末端标记，使得探针能够用肉眼识别。
如本文中所用，术语“引物”是指具有游离3'羟基的短核苷酸序列，其可以与互补模板形成碱基对，并且作为模板链复制的起始点。
在本发明中，用于扩增遗传标记的引物可以是在合适的缓冲液(例如4种不同的三磷酸核苷和诸如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等的聚合酶)和合适的DNA合成温度的适当条件下作为模板导向DNA合成的起始点的单链寡核苷酸，引物的适当长度可以根据使用目的而变化。引物序列不需要与包括遗传标记的多核苷酸或其互补多核苷酸完全互补，并且如果其足够互补以杂交则满足。
此外，在一个具体实施方式中，可以例如通过甲基化、封端、核苷酸取代或核苷酸之间的修饰，例如不带电荷的连接体(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、或带电荷的连接体(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)来修饰引物。
在本发明中，引物可以是由序列号65和66的核苷酸序列组成的多核苷酸，但不限于此。
在本发明的具体实施方式中，具有在外地猪和本地猪之间存在的核苷酸变异的核苷酸区域使用序列号65和66的引物来扩增，并且具有核苷酸变异的核苷酸序列中的“ACGT”区域通过限制酶HpyCH4IV切割，并检测所得切割模式。结果证实，能够清楚地区分出限制酶对Landrace(肉品质差的外地猪种)和Jeju本地猪(肉品质良好的韩国本地猪种)之间的切割模式的差异(图12)。
这表明本发明的用于确定猪肉品质性状的组合物不仅能够有效地用于区分外地猪和本地猪，而且还能够根据猪种的区别确定肉品质性状。
本发明的另一方面提供一种用于确定猪肉品质性状的试剂盒，其含有该组合物。
本发明的试剂盒可以通过扩增确认本发明的遗传标记或通过检测本发明的遗传标记的mRNA表达水平来确定猪肉品质性状的水平。在具体实施方式中，试剂盒可以是RT-PCR试剂盒或DNA芯片试剂盒，但不限于此。
在更具体的实施方式中，试剂盒可以是包括进行RT-PCR所必需的基本因素的试剂盒。例如，除了对遗传标记具有特异性的每个引物，RT-PCR试剂盒可以包括试管或其它合适的容器、反应缓冲液(具有各种pH值和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、脱氧核苷酸(ddNTP)、诸如Taq聚合酶和逆转录酶的酶、DNAse、RNAse抑制剂、DEPC-水、无菌水等。此外，试剂盒还可以包括对用作定量对照的基因具有特异性的引物对。
在另一个具体实施方式中，本发明的试剂盒可以是包括进行DNA芯片测定所必需的基本元件的DNA芯片试剂盒。
如本文中所用，术语“DNA芯片”是指可以确认几十万个DNA的每个核苷酸的DNA微阵列之一。通常，DNA芯片试剂盒是将核酸物质的网格阵列附着到平坦固体支撑板(通常不大于显微镜载片的玻璃表面)的DNA芯片试剂盒，并且是通过在DNA芯片的表面上不断排列核酸，以能够在DNA芯片上的核酸和DNA芯片的表面上的处理溶液中包含的互补核酸之间进行多次平行杂交反应的装置。
本发明的另一方面提供一种用于确定猪肉品质性状的微阵列，其包括遗传标记。
微阵列可以是包括DNA多核苷酸或RNA多核苷酸的微阵列。除了包括本发明的多核苷酸之外，微阵列可以制备为常规微阵列。
通过将探针多核苷酸固定在底物上来制备微阵列的方法是本领域中公知的。作为可杂交多核苷酸的探针多核苷酸是指能够与核酸的互补链进行序列特异性结合的寡核苷酸。本发明的探针是等位基因特异性探针，其中多态位点存在于衍生自相同物种的两个成员的核酸片段中，并与衍生自一个成员的DNA片段杂交，但不与衍生自另一个成员的DNA片段杂交。在这种情况下，杂交条件显示等位基因之间杂交强度的显著差异，并且必须足够严格以与仅等位基因之一杂交。通过这样做，可以诱导不同等位基因形式之间的良好杂交差异。本发明的探针能够用于通过检测等位基因等来确定猪肉品质性状。确定方法可以包括基于核酸杂交的检测方法，例如Southern印迹分析等，并且在使用DNA芯片的方法中可以提供为已经结合DNA芯片的底物的形式。杂交可以在严格条件(例如盐浓度为1M以下，温度为25℃以上)下进行。
将与确定本发明的猪肉品质性状相关的探针多核苷酸固定在底物上的过程也能够使用这种常规技术容易地进行。此外，核酸在微阵列上的杂交和杂交结果的检测是本领域中公知的。关于检测，能够检测杂交结果，例如，通过用能够产生可检测信号的标记材料(包括诸如Cy3和Cy5的荧光材料)标记核酸样品，在微阵列上杂交，并检测从标记材料产生的信号。
本发明的另一方面提供一种用于确定猪肉品质性状的方法，包括：(a)从分离自受试者的样品的DNA扩增遗传标记；以及(b)鉴定步骤(a)的扩增产物的核苷酸序列。
在本发明中，该方法可还包括当步骤(b)的扩增产物包含ACGT的连续核苷酸时，确定猪肉品质性状比外地猪肉品质性状优异。
如本文中所用，术语“受试者”是指要确认肉品质性状水平的猪，并且能够通过使用从猪获得的样品分析遗传标记中包含的基因型来确定猪肉品质性状。样品可以是毛发、尿液、血液、各种体液、分离的组织、分离的细胞或唾液等，但是没有特别限制，只要能够从样品中检测该基因即可。
本文中所用的术语“外地猪”是指从韩国以外的国家进口的猪种，概念上与韩国本地猪相反。通常，与韩国本地猪相比，已知外地猪更容易受到疾病的影响，并且关于肌肉内脂肪、汁液、肉嫩度等的肉品质特性差。在具体实施方式中，外地猪可以指Berkshire种、Yorkshire种、Duroc Jersey种、Hampshire种、Landrace种等，为了本发明的目的，外地猪可以指与外地猪杂交的所有猪种。
在本发明中，步骤(a)中的从DNA扩增本发明的遗传标记可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现。在具体实施方式中，所使用的扩增方法可以包括PCR、连接酶链反应(LCR)、转录扩增、自主序列复制、基于核酸的序列扩增(NABSA)等，但扩增方法不限于此。
此外，步骤(b)的确定扩增产物中包含的遗传标记的核苷酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。在具体实施方式中，可以通过测序、微型测序、等位基因特异性PCR、动态等位基因特异性杂交(DASH)、PCR延伸分析(例如单碱基延伸(SBE))、PCR-SSCP、PCR-RFLP分析或TaqMan技术、SNPlex平台(Applied Biosystems)、质谱(例如Sequenom的MassRay系统)、Bio-Plex系统(BioRad)、限制酶消化方法等进行确定，但是确定方法不限于此，并且可以使用能够检测扩增产物中包含的ACGT的连续核苷酸的任何方法。
在本发明的具体实施方式中，具有在外地猪和本地猪之间存在的核苷酸变异的核苷酸区域使用序列号65和66的引物扩增，并且通过限制酶HpyCH4IV切割核苷酸序列中的“ACGT”区域，并检测所得切割模式。结果证实，能够清楚地区分出限制酶对Landrace(肉品质差的外地猪种)和Jeju本地猪(肉品质良好的韩国本地猪种)之间的切割模式的区别(图12)。
这表明本发明的猪肉品质性状的确定方法不仅能够有效地用于区分外地猪和本地猪，而且能够根据猪种的区别确定肉品质性状。
本发明的另一方面提供了一种用于确定韩国本地猪的组合物，其含有能够检测遗传标记的试剂。
特别地，关于术语“能够检测遗传标记的试剂”的定义与上述相同。
如本文中所用，术语“韩国本地猪”是指在韩国传统养殖的猪种，与外地猪相对。通常，韩国本地猪比外地猪更耐疾病，诸如肌肉脂肪、汁液、嫩度等的肉品质特征优异。韩国本地猪可以是Chookjin Chamdon、Gangwon-do Sanuri韩国本地猪、Jeju本地黑猪、Jeju粪猪等，更特别是Jeju本地猪，但不限于此。在本发明中，术语韩国本地猪可与“本地猪”、“传统猪”或“韩国传统猪”互换使用。
在本发明中，当从给定猪检测到标记时，与未检测到标记的猪相比，能够将猪确定为韩国本地猪。
本发明的另一方面提供一种用于确定猪肉品质性状的方法，其包括：(a)从分离自受试者的样品的DNA扩增遗传标记；以及(b)鉴定步骤(a)的扩增产物的核苷酸序列。
在本发明中，当ACGT的连续核苷酸包含在步骤(b)的扩增产物中时，可以另外包括确定目标猪为韩国本地猪的步骤(c)。
特别地，关于“受试者”和“韩国本地猪”的定义与上述相同。
在本发明中，步骤(a)的从DNA扩增本发明的遗传标记可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。例如，扩增可以通过PCR、连接酶链反应(LCR)、转录扩增、自主序列复制、基于核酸的序列扩增(NABSA)等进行，但扩增方法不限于此。
此外，步骤(b)的确定扩增产物中包含的遗传标记的核苷酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。在具体实施方式中，可以通过测序、微型测序、等位基因特异性PCR、动态等位基因特异性杂交(DASH)、PCR延伸分析(例如单碱基延伸(SBE))、PCR-SSCP、PCR-RFLP分析或TaqMan技术、SNPlex平台(Applied Biosystems)、质谱(例如Sequenom的MassRay系统)、Bio-Plex系统(BioRad)、限制酶消化方法等进行确定，但确定方法不限于此，并且可以使用能够检测扩增产物中包含的ACGT的连续核苷酸的任何方法。
在本发明的具体实施方式中，具有在外地猪和本地猪之间存在的核苷酸变异的核苷酸区域使用序列号65和66的引物扩增，并且通过限制酶HpyCH4IV切割核苷酸序列中的“ACGT”区域，并检测所得切割模式。结果证实，能够清楚地区分出限制酶对Landrace(肉品质差的外地猪种)和Jeju本地猪(肉品质良好的韩国本地猪种)之间的切割模式的区别(图12)。
这表明本发明的猪肉品质性状的确定方法能够有效地用于区分外地猪和本地猪。
[本发明的有益效果]
本发明的遗传标记作为用于确定猪肉品质性状的特异性标记，能够不仅用于客观评价不可视觉上区分的猪肉品质性状，而且能够用作鉴别外地猪与韩国本地猪的手段。作为结果，本发明的遗传标记将有助于建立猪肉分销秩序。
附图说明
图1示出了比较Landrace(a)(引入物种)和韩国本地猪(b)(本地物种)之间的外观和外脊肉的图像。
图2示出了根据确认用于确定肉品质性状的基因的数量性状位点(QTL)区域的连锁不平衡分析(LLDA)的结果的图，其中(a)涉及通过Jeju本地猪和Landrace猪杂交获得的后代(LK群)，(b)涉及通过Jeju本地猪和Duroc猪杂交获得的后代(DK群)。
图3示出了用于确定肉品质性状的基因的QTL区域中存在的基因的LALD图的结果。
图4示出了比较QTL区域中存在的基因的mRNA表达水平的图，其中(a)涉及外脊肉(最长肌)和(b)涉及后肢肌肉(四头肌)。
图5示出了CAGGS-EGFP-Puro载体的切割图。
图6示出了重组MYH3基因的CAGGS-MYH3-Flag表达载体的切割图，以及载体内基因的序列。
图7示出了在用重组MYH3基因的载体转化的转基因小鼠中MYH3基因的活性和表达模式。在图7中，(a)示出了MYH3基因的转录活性的图像，其中P/C表示阳性对照，红色数字(21、24、26、27和28)表示显示MYH3基因的转录活性的转基因小鼠，黑色数字(19、20、22、23和25)表示不显示MYH3基因的转录活性的转基因小鼠；以及(b)示出了关于MYH3基因的蛋白质表达水平的蛋白质印迹分析的结果的图像。
图8示出了插入有猪MYH3基因的转基因小鼠的图像。
图9示出了野生型小鼠(WT)和转基因小鼠(TG)的后肢肌肉(a)和后肢肌肉组织((b)和(c))的外观的图像。图9(b)示出了后肢肌肉组织用肌球蛋白ATP酶进行组织化学染色的图像，其中红色箭头表示1型/氧化/慢纤维，是一种红色肌肉；蓝色箭头表示2a型，是一种白色肌肉；蓝色三角形表示2型/糖酵解/2b型的快纤维，是一种白色肌肉；比例尺表示50μm。图9(c)示出了用油红O染色的后肢肌肉组织的图像，其中比例尺表示100μm，并且在其下方放大和示出在矩形中存在的区域。
图10示出了确认插入有猪MYH3基因的转基因小鼠的肌肉中的基因表达模式的结果。图10(a)示出了使用四月龄野生型小鼠(n＝3)和转基因小鼠(n＝5)，关于肌纤维相关基因的mRNA和蛋白质表达的qRT-PCR和蛋白质印迹分析的结果。图10(b)示出了使用四月龄野生型小鼠(n＝3)和转基因小鼠(n＝4)，后肢肌肉的慢型(左)和快型(右)肌肉相关基因的mRNA表达水平的qRT-PCR分析的结果。在三个独立实验中得到结果，以平均值±SEM表示(*P<0.05，**P<0.01)。图10(c)示出了苏木精和曙红染色的后肢肌肉的结果，其中箭头表示肌束膜，三角形表示肌内膜。图10(d)示出了关于脂肪形成相关基因的mRNA表达水平的qRT-PCR分析的结果。
图11示出了说明猪MYH3基因的结构和数量性状核苷酸(QTN)的图像。
图12示出了通过HpyCH4IV限制酶切割的影响肉品质的原因性核苷酸变异的模式的图像，其中源自Landrace种(q/q)的“1/1”示出了未切割模式，源自Landrace猪和Jeju本地猪之间的杂交种(q/Q)的“1/2”示出了切割模式，源自Jeju本地猪(Q/Q)的“2/2”示出了切割模式。
具体实施方式
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明的目的，本发明不受这些实施例的限制。
实施例1、视觉比较猪肉品质性状
为了比较Jeju本地黑猪和Landrace猪之间的肉品质性状(肌内脂肪含量和红肉)，分析了这些猪的外脊肉形状。
如图1中所示，结果证实，作为引进物种的Landrace猪的外脊肉是白色的，但是苍白的，而Jeju本地猪的外脊肉具有黑色外层颜色和红肉，特别是具有优异的大理石花纹沉积。
从上述结果可以看出，Jeju本地猪肉品质优于Landrace猪肉品质。
实施例2、猪肉品质的数量性状位点(QTL)分析
实施例2-1、确认肉品质基因的QTL
为了确认能够确定猪肉品质性状的基因，使用通过Jeju本地猪和Landrace猪之间杂交获得的后代(LK群)以及通过Jeju本地猪和Duroc猪之间杂交获得的后代(DK群)，关于肉品质性状(发红程度(a*)和肌内脂肪含量(IMF))进行数量性状位点(QTL)分析。
如图2(a)中所示，作为结果，证实了LK组中的垂直虚线位于染色体12的661kb区域上，此外，如图2(b)中所示，证实了KD组中的垂直虚线位于染色体12的661kb区域上。
从上述结果证实，能够确定红肉(发红度)和肌内脂肪含量的基因存在于相同位置，与猪种无关，并且发现该基因存在于染色体12的661kb区域中。
实施例2-2、确认与猪肉品质性状相关的基因
由于在实施例2-1中确认了能够确定猪肉品质性状的基因存在于染色体12的661kb区域中，因此通过LALD图确认位于该区域中的基因。
如图3中所示，结果确认了在与肉品质性状相关的基因区域中共存在九个基因(MYH3、MYH1、MYH2、MYH13、ADPRM、SCO1、TMEM220、ENSSSCG00000029441和ENSSSCG00000018006)。
实施例2-3、选择与猪肉品质性状相关的基因
由于确认了能够确定猪肉品质性状的九个基因，因此进行尝试以选择与肉品质性状的确定最为密切相关的基因。
在Landrace猪和韩国本地猪(KNP)的外脊肉(最长肌)和后肢肌肉(四头肌)中分析了九个基因的相对mRNA表达水平。
具体地，从Landrace猪和韩国本地猪(KNP)收集外脊肉和后肢肌肉，并使用Trizol试剂(Ambion)从其中分离RNA。将各组织的RNA浓度调整为5μg后，使用TOPscript cDNA合成试剂盒(Enzynomics)合成cDNA(互补DNA)。然后，使用每个组织的cDNA进行qRT-PCR。在95℃20秒、60℃20秒、72℃20秒下共进行40次循环的QRT-PCR。使用QuatiTect SYBR Green PCRKit(Qiagen)进行QRT-PCR，并使用Rotor-Gene Q热循环仪(Qiagen)仪器实时分析。将用于分析总共九种基因的引物列于下表1中。
[表1]
基因 类别 方向 核苷酸序列(5′→3′)
pMYH3 序列号3 正向 AAAAGCTCAGCATGAGCTCGA
序列号4 反向 AGGGTCAGGAACCATGAAAAT
pMYH1 序列号5 正向 GTTCTGAAGAGGGTGGTAC
序列号6 反向 AGATGCGGATGCCCTCCA
pMYH2 序列号7 正向 GGGCTCAAACTGGTGAAGC
序列号8 反向 AGATGCGGATGCCCTCCA
pMYH13 序列号9 正向 CACAGGGCTCTGGCCGACAT
序列号10 反向 CGTGCGCACAGGGGTGTAGT
pADPRM 序列号11 正向 CATCCTGAGACCGTGCCTTCA
序列号12 反向 TTCCGCATTTGGGTTGTGCT
pSCO1 序列号13 正向 TCCTCACGGACTCGGGGTTT
序列号14 反向 GTGGGGTCTCTGCTGCCCTT
pTMEM220 序列号15 正向 CCCAGACGCAGAACTGTGGG
序列号16 反向 GTTGTATGCCAAGCCGGCAG
pENSSSCG00000029441 序列号17 正向 TCGTGCTGGAGCAGGAGGAG
序列号18 反向 AGGTGTCTGTGGCCTTGGGG
pENSSSCG00000018006 序列号19 正向 AGAACCAGCCCTTCGATGCC
序列号20 反向 TGGCATACACATCCTCCGGC
pGAPDH 序列号21 正向 GGGCATGAACCATGAGAAGT
序列号22 反向 GGGCATGAACCATGAGAAGT
作为结果，如图4(a)和4(b)中所示，与Landrace猪相比，韩国本地猪的外脊肉和后肢肌肉的MYH3基因的mRNA表达显著更高。
这些结果证实，MYH3基因是确定猪肉品质性状中发红程度和肌内脂肪含量的主要基因。
实施例3、制备插入有猪MYH3基因的转基因小鼠
由于实施例2中证实了MYH3基因是能够确定猪肉品质性状(特别是发红度和肌内脂肪含量)的基因，因此根据实施例3-1至3-2中描述的方法制备插入有猪MYH3基因的转基因小鼠，使用转基因小鼠确认MYH3基因的体内活性。
实施例3-1、制备转基因载体
首先，为了制备插入有猪MYH3基因的转基因小鼠，制备了插入有猪MYH3基因的重组CAGGS-MYH3-Flag表达载体。
具体地，为了制备能够过表达猪MYH3基因的载体，确认了猪MYH3基因的mRNA的全部核苷酸序列。然后，将确认的序列分为总共4个不同的片段，并人工合成了序列的每个片段。第一个片段长度为1417bp，通过在两端添加XbaI和BglII位点来人工合成。第二个片段长1745bp，两端添加BglII和SalI位点；第三片段长1777bp，两端添加SalI和SacII位点；最后第四片段长944bp，两端添加SacII和EcoRI位点。将完成的四个DNA片段通过人工添加的限制性酶切位点连接，最终完成含有MYH3基因的整个mRNA序列的基因片段。
然后，如图5中所示的CAGGS-EGFP-Puro载体用XbaI和EcoRI消化，然后将预先制备的猪MYH3基因的整个mRNA片段插入消化的CAGGS-EGFP-Puro载体中以最终制备猪MYH3转基因载体(图6)。
将载体的结构示于图6中，并且载体的核苷酸序列由序列号2表示。
实施例3-2、制备转基因小鼠
实施例3-2-1、制备转基因小鼠的方法
使用实施例3-1中制备的载体制备转基因小鼠。
具体地，获得C57BL/6n小鼠的受精卵，通过显微注射将上述制备的转化载体引入胚胎细胞核中。
作为结果，确认了共47个F0结果。
实施例3-2-2、通过mRNA表达的分析确认外源基因(MYH3)的引入
为了确认MYH3基因是否引入到实施例3-2-1中制备的转基因小鼠中，分析了MYH3基因的mRNA表达。
具体地，在95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒的条件下，共进行40次循环的PCR，使用的引物列于下表2中。
[表2]
基因 类别 方向 核苷酸序列(5′→3′)
pMYH3 序列号23 正向 CCGAGAGCTGGAGTTTGA
序列号24 反向 CTCCCATATGTCCTTCCGAGT
如图7(a)中所示，结果确认了转基因小鼠插入有MYH3基因并表达MYH3基因的mRNA(第21、24、26、27和28号)。
实施例3-2-3、通过蛋白质表达分析确认外源基因的引入
为了确认MYH3基因是否引入实施例3-2-1中制备的转基因小鼠中，分析了MYH3基因的蛋白质的表达。
具体地，收集野生型小鼠(WT)和转基因小鼠(TG)的后肢肌肉组织，并在加入蛋白酶抑制剂后通过超声波在RIPA缓冲液中将肌肉组织分解。然后，使用低温离心机从组织中分离蛋白质，从上清液中回收蛋白质。使用BSA蛋白测定试剂(Bio-rad)定量回收的蛋白质，并用4×蛋白质上样缓冲液(1×)在100℃下加热约10分钟。为了使用制备的蛋白质进行蛋白质印迹，将蛋白质在SDS-PAGE凝胶上电泳约2小时。然后将蛋白质转移至PVDF膜，并用5％脱脂乳封闭1小时，加入抗Flag M2(F1804，Sigma-Aldrich)和β-肌动蛋白(#4970，CellSignaling)，在4℃下反应过夜。第二天，用TBST溶液洗涤所得物，与第二抗体反应2小时，用ECL试剂处理，并用LAS-300发光图像分析仪(Fujifilm)检测与蛋白质结合的抗体信号。实验中使用的第二抗体根据第一抗体而变化。
如图7(b)中所示，作为结果，在转基因小鼠中转基因小鼠24号中发现MYH3基因表达的最高水平。因此，使用具有转基因和面包蛋白的最高表达水平的转基因小鼠24号进行杂交，所得小鼠的图像示于图8。
实施例3-3、确认转基因小鼠的肌肉形态
为了确认MYH3基因在确定肉品质性状中的作用，检测了实施例3-2中制备的转基因小鼠的肉品质性状。
首先，如图9(a)中所示，与野生型小鼠(左侧；WT)相比，发现转基因小鼠的后肢肌肉(右侧；TG)更红。
然后，进行ATP酶染色以进一步确认肌肉形态。收集野生型和转基因小鼠的后肢肌肉样品，并在30％蔗糖溶液中处理整夜。在-25℃下使用OCT化合物将肌肉组织切片至10μm，并用4％PEA固定1小时。组织切片用流水洗涤10分钟，再用60％异丙醇洗涤，并根据制造商手册使用组织酶反应试剂盒(Bio Optica)的ATP酶染色冻干粉末进行实验。
如图9(b)中所示，结果确认了插入有MYH3基因的转基因小鼠(右侧；TG)在后肢肌肉中比野生型小鼠分布更多的红色肌肉。
此外，进行油红O染色以确定肌肉组织中的脂肪分布。具体地，使组织切片与0.3％油红O溶液反应1小时。
如图9(c)中所示，结果发现与野生型小鼠(左侧；WT)相比，转基因小鼠(TG)的染色水平更强，因此确认了转基因小鼠的后肢肌肉与野生型小鼠相比具有较高的脂肪含量。
综上所述，确认了MYH3基因是导致红色肌肉积累以改善肉的发红和肌肉脂肪含量的积累的基因。
实施例3-4、确认转基因小鼠的肌肉内的基因表达模式
实施例3-4-1、确认白色肌肉/红色肌肉形成基因的表达模式
为了确认与确定肉品质性状有关的MYH3基因的作用，检测了实施例3-2中制备的转基因小鼠的白色肌肉/红色肌肉形成基因的表达模式。
具体地，收集野生型小鼠(WT)和转基因小鼠(TG)的后肢肌肉组织样品，并根据实施例2-3的方法进行qRT-PCR。将使用的引物列于下表3中。
[表3]
Figure BDA0001464369260000171
Figure BDA0001464369260000181
此外，根据实施例3-2-3的方法进行蛋白质印迹，其中使用的第一抗体如下：抗Flag M2(F1804，Sigma-Aldrich)、MYH7(SC-53089，Santa Cruz Biotechnology)、MYH4(H00004622-B01P，Abnova)和β-肌动蛋白(#4970，Cell Signaling)。
如图10(a)中所示，作为结果，与野生型小鼠相比，转基因小鼠中作为与红色肌肉类型相关的慢型基因的MYH7基因的mRNA和蛋白质表达迅速增加。
如图10(b)中所示，作为结果，与野生型小鼠相比，转基因小鼠中与白色肌肉类型(Aldoa、Pvalb、Tnnf3、Tnn2和Tnnc2)相关的快型基因的表达水平没有显著差异；然而，与野生型小鼠相比，与红色肌肉类型(肌红蛋白、Tnnt1、Tnn1和Tnnc1)相关的所有基因的mRNA表达水平都有所提高。
实施例3-4-2、确认相关基因的脂肪积累模式和表达模式
为了确认MYH3基因在确定肉品质性状中的作用，对实施例3-2中制备的转基因小鼠的相关基因的脂肪积累模式和表达模式进行了检查。
首先，为了确认脂肪积累模式，尝试检查组织的形态，为此目的，对组织进行苏木精和曙红(H&E)染色。将野生型小鼠(WT)和转基因小鼠(TG)的肌肉组织进行石蜡包埋，然后切成4μm的厚度。然后使用二甲苯除去石蜡，依次用100％、95％、75％和50％酒精脱水，并在流水中洗涤5分钟。然后，用Mayer's苏木精溶液处理组织1分钟，用流水洗涤20分钟，用曙红处理1分钟，然后脱水和清除，然后在显微镜下检查组织的染色状态。
为了确认转基因小鼠的肌肉组织中的脂肪积累基因的表达模式，根据实施例2-3的方法进行qRT-PCR。特别地，使用的引物列于下表4中。
[表4]
基因 类别 方向 核苷酸序列(5′→3′)
CD36 序列号53 正向 AATGGCACAGACGCAGCCT
序列号54 反向 GGTTGTCTGGATTCTGGA
LPL 序列号55 正向 GTACCTGAAGACTCGCTCTC
序列号56 反向 AGGGTGAAGGGAATGTTCTC
Fabp4 序列号57 正向 GATGCCTTTGTGGGAACCTG
序列号58 反向 TCCTGTCGTCTGCGGTGATT
Fto 序列号59 正向 GTCAGAGAGAAGGCCAATGA
序列号60 反向 TAGCAGTCTCCCTGGTGAAG
Pgc1α 序列号61 正向 CCCTGCCATTGTTAAGACC
序列号62 反向 TGCTGCTGTTCCTGTTTTC
Adiponectin 序列号63 正向 AATGGCACACCAGGCCGTGAT
序列号64 反向 TCTCCAGGCTCTCCTTTCCTG
如图10(c)和(d)中所示，结果确认了与野生型小鼠相比，转基因小鼠的肌肉细胞之间的间隔较大，脂肪沉积于该空间。此外，确认了脂肪生成基因的表达也显著增加。
从这些结果确认，MYH3基因是不仅影响红色肌肉相关基因的表达，而且也增强了肌肉内脂肪的产生的基因。
实施例4、分析MYH3基因的基因型
为了分析MYH3基因的基因型，分析了从转录起始位点(TSS)到5'-UTR的3kb核苷酸序列和从终止密码子到3'-UTR的1kb核苷酸序列。
如图11中所示，结果确认了在影响肉品质的MYH3基因中鉴定出MYH3-1805-1810delGGACTG(即QTN)(由红点表示)。此外，还确认了Landrace猪和Jeju本地猪(KNP)之间存在核苷酸变异，其位于外显子3的起始密码子(ATG)的5'-UTR处。在Jeju本地猪的情况下，确认了-1805bp至-1810bp之间的区域缺失，并且这被确认为成肌调节因子(MRF)的结合位点。
实施例5、通过基因型鉴定MYH3基因来确定猪的品种
在实施例3中确认了Landrace猪和Jeju本地猪的MYH3基因之间的核苷酸变异的存在，试图使用该核苷酸变异确定猪肉品质。
具体地，使用引物(正向：5'-TGG TCT TTC CTA ATT GGT GAC AT-3'(序列号65)，反向：5'-AGT TTT GAG CAA GGC TTT TGT T-3'(序列号66))扩增含有核苷酸变异的区域。在含有20mM dNTP、200mM正向和反向引物以及1.5单位Taq DNA聚合酶(TaKaRa，日本)的10×反应缓冲液中，使用从每只猪的血液中分离的100ng/μL DNA作为模板，然后加入无菌去离子水至终体积为25μL，从而进行PCR。使用PTC-200(MJ Research，USA)共进行30次循环的PCR扩增，引物在60℃下退火。在含有溴化乙锭(EtBr)的2％琼脂糖凝胶上对扩增产物进行电泳，并在UV下确认基因扩增的存在。
然后，使用HpyCH4IV限制酶切割原因性核苷酸变异的核苷酸序列的“A▼CGT”区域。扩增的PCR产物用限制酶(HpyCH4IV)切割。通过根据供应商的说明混合PCR扩增产物(3μL)、10×缓冲液(1μL)、限制性酶(0.3μL)和DW(5.7μL)，并在37℃下反应整夜，以进行限制酶反应。在含有溴化乙锭(EtBr)的2％琼脂糖凝胶上进行电泳，以便确认Landrace和Jeju本地猪MYH3基因的限制酶切割模式。
如图12中所示，结果确认了肉品质差的Landrace猪的MYH3基因未被切割，因此在250bp处出现一条带(1/1；非切割模式)，而Jeju本地猪(MYP)的MYH3基因被切割，因此在167bp和77bp处出现两条带(2/2；切割模式)。此外，Landrace猪和Jeju本地猪之间杂交品种的MYH3基因在250bp和167bp处出现两条带(1/2；非切割模式)。
从以上结果确认了MYH3基因变异的存在不仅能够用来区分韩国本地猪和外地猪，而且能够用来确定猪肉品质性状。
从以上所述，本发明所属领域的技术人员将能够理解，本发明可以以其它具体形式来实施，而不改变本发明的技术概念或本质特征。就这一点而言，这里公开的示例性实施方式仅用于说明的目的，而不应解释为限制本发明的范围。本发明的范围应解释为包括后面将要描述的权利要求的含义和范围以及从其等同概念导出的所有修改及修改形式，而不是以上对本发明的详细描述。
<110> 大韩民国（农村振兴厅长）
韩国生命工学研究院
济州大学校
<120> 用于确定猪肉品质性状的遗传标记及其用途
<130> OPA17121
<160> 66
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 3400
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
tggtggttat tgccgctgct tccaccctca gggttctcct ggcgagcgga gctccctgcc 60
tacctcggac cctcgttcca tggcccgggc aggcttcttc ccctcgtgcc ttccagcccc 120
tcatgtgcag aagcaggccg tcaggcagat gacccgagac ctcccagccg agcctctgtg 180
ctcgtggagg acgtgtgacg gagagaagga agacaggccg gctgacgggg gaaaagctgg 240
ggtgggaggc cgtcagcctt gagctcgcct tgggctcagg gatgcgacgt ggcttcacgc 300
ttgacaagaa gctcaaagaa atcctgtgtg gaaaacgtcc tctcggtgtc ccggaggtgg 360
gatggatgtg gttgtgcaga ggtgggtgaa ccggcgccaa ctaaaggtca aaagcaagcc 420
ggccccaacc gcggcccctg gtgtttaaga agggaccgcc agcacccttc ccctgaccac 480
ccagcacacg tcacagcctg agacgtagcc agggcccctg cactgtccct cagccccagg 540
gggcttgcta acacctctgc ttccaggtga catgcacctg tcctcaccag gcctcccagg 600
atggctggcc aatggcgcag agagtcaggc cggcgcgtcc ctgggcaggg agaccacgcc 660
ccttcaggac cggagggtcc ttgaggaggg tcgagctctc ttcttggacg aggaggattt 720
ctgggggagg gggtttcagt cccagcggcg gggggtgggc ggtggggcgt gacatgtagc 780
atggcaggtc catgcttcct gactttcctc ctgatggcca cttgcctacc tgctttgatc 840
taaaaatcac caaaatctca gacataatcg agtcaccatt tatccaagaa accatcgagg 900
gtaaagccgc agcttccatt tctttcgatt cttcttccag ggttctgcct tgggcccagc 960
atgcagtggg tgtttaatta atgcccctgc ccctcgggga ctgcagcccc actccccctg 1020
ccccaccccc agcccttaga gtggcctcct ggcccgcgct gcgtgtggct atgctgggag 1080
ggggccgttc ttattctcca gtggggacag ctgacaccag aatgaacgac aacgggttac 1140
ccacaggcca cgctcccaac ggtctgtcag ggaaaaaaag ggaaaaacag acataaagtg 1200
gaataagaat gggcaaacgc ttcagccata cccctctgtg ctcctaaggc tttatttttc 1260
taaccctgat ttagaaacag ccatgctcgt tagacgcccc ctcacccccc tttctctgca 1320
ggccctgcca tccccccacc cccgccccgg ccagcagctg gtctttccta attggtgaca 1380
tgtcttaata actacaggtc cttgagcagc tgtcactgtg gctcctggct ggtgggctac 1440
ctccctctca gtcatttact cgttggtcct actggcgctt aagacagagg tttagttaat 1500
gacgatccta atgagacagc aggacgtgtg ttccccacac aagttgtaca atcacacatt 1560
cctgccacaa ccctgtgttg taacaaaagc cttgctcaaa actccaagag ggtttaaact 1620
tttccgtcct tggcttcatc cctttgccca caggccgaga ttctaggtcc ccgctgtccc 1680
agagaccagg ctcatctcca gccgtgtggc gcctgtggga tggagcgagg gcccccggca 1740
aggctgtccc atcactgagc cgccggttca gagaaaggca tcccaaactt ccagctttct 1800
ccagctagga tcctgtcatt tctatatata cctctctctt ggcagcggca aaaaaaagcg 1860
aggaaggagc tggtcctcac ttgtggtgtc ggtcactctc tttccaaata tagagaagga 1920
atgagtggcg ggggttagca ggggctataa aagcccgcgg ggagcgcccc ttgtagctgc 1980
tctgtgggcg gaggagagtc acagtgcccc ttgtgcgggt ccttcccatc tgaggctcag 2040
aggctcgtgt ggccctgccc ggctttggta aggaccagac gtgcggctga ttctcagccc 2100
ctccccgcct ccagcatccc gcttccttca cctgttctcc cctgccctca tcctccagag 2160
ccttcccggg cagggtccct tcggatgctc tgtggaccac tgccgtcacc ccggcccatg 2220
aacgctgcca cctctctgac ttgtgcagag gccagtgggc ctggccgcct ccccacctgc 2280
gctgcgggcc tgcggtgtct gtcctctcaa ggccacgctg gctgtgcatc cgttggcttg 2340
tctgagactt cgccctgcct gcccacagaa gacagggggc ctggccctgg cttggaggca 2400
caggcttttc aaacagagct tctgtcctga ctgctcacat ctgaggagga ggcatggcag 2460
acagagggtg gtgccacccg ggcaggaggg agccaggtct ggggcggctg ggggctctcc 2520
tgccttcagg gctcacctgt gggccaggtc ccatttgctc ctccagcttg tctctgggcc 2580
aaggctcttt taaagttatt cgtcctttct cttcatttgg ttaattgatt aaggcccatt 2640
cagaactgaa ccagacactc ccacgtctcc tgaccttttg tgtatttatt gcaggtctga 2700
tttctcacgg ctgctgctgt ctgctgtcct cctgcgggtg tgactctcag gtgagaaagc 2760
aggtcaggtc ccctggctca gccatctcca gggtactggt tcccccccgg ccacggcctt 2820
gcggcgagca ggacaggtta ggctggagag gagccccagg gaaggctgcc aagcagatgc 2880
tgatgtgaga agccgcttgt ttgtagaagg gactgaagcc ggtttccagg tgggggatgg 2940
agccaccctg aatccgagcg gttccaaaac tccttagcta tttgcccttt aacacgctct 3000
ttgaagaatg tttgcttttg agagtgttta cctttacgtc ttccctcagc aacccctggc 3060
ttttacagaa gaggaaagcg gggtcccaag agctgcaccc acctctgggc gctctgcccg 3120
ccccagcccc ggctaacggg ggagcttgga ttgcgtgcat cccgtgtcct ctgcacagag 3180
gagctgctca atgaaatgca cccatttgat cccggggggc tggatggcgg cggccttgct 3240
cctgggctcc gcctggaggg cgcctgtggg gtcagggctg gagtctggcc cggggactca 3300
ctggggggtc ccttccagcc gacaccatga gcagcgacac tgaaatggaa gtgttcggca 3360
tagccgctcc cttcctccgc aagtcggaaa aggagaggat 3400
<210> 2
<211> 12238
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAGGS-MYH3-Flag载体
<400> 2
gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc 420
atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca 480
gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 540
gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 600
tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 660
gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc 720
ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 780
gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 840
ccttaaaggg ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg 900
tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 960
cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc 1020
ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1080
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc 1140
cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc 1200
gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg 1260
ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct 1320
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1380
gacttccttt gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc 1440
tagcgggcgc gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt 1500
cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg 1560
acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg 1620
gctctagagc caccatgagc agcgacactg aaatggaagt gttcggcata gccgctccct 1680
tcctccgcaa gtcggaaaag gagaggatcg aggcgcagaa ccagcccttc gatgccaaaa 1740
cctactgctt cgtggtcgac tcgaaggaag agtacgccaa ggggaaaatt aagagcaccc 1800
aggatgggaa ggtcacggtg gagaccgaag acaacaggac cctggtggtg aagccggagg 1860
atgtgtatgc catgaacccc cccaagtttg accggatcga ggacatggcc atgctgacgc 1920
acctgaacga gccggccgtg ctgtacaacc tcaaggaccg gtacacctcc tggatgatct 1980
atacctactc gggcctcttc tgtgtcaccg tcaaccccta caagtggctg ccggtgtaca 2040
accccgaggt ggtggagggc taccgaggca aaaagcgcca ggaggccccg ccccacatct 2100
tctccatctc cgacaacgcc tatcagttca tgttgacaga tcgtgaaaac cagtccattc 2160
tgatcaccgg agaatccggg gcgggaaaga ctgtgaacac caagagggtc atccagtact 2220
ttgcaacaat tgctgccact ggggacctcg ccaagaagaa ggactccaag atgaagggga 2280
ctctggagga ccagatcatc agcgccaacc cgctgctgga ggccttcggc aacgccaaga 2340
ccgtgaggaa cgacaactcg tcccgcttcg gcaagttcat ccgaatccat tttggtacca 2400
ccgggaagct ggcctccgca gacatcgaaa catatctgct cgaaaaatcg agagtgacct 2460
tccagctgaa ggctgagagg agctaccaca tcttctacca gattctctcc aacaagaagc 2520
cggagctcat agagctgctg ctcattacaa ccaacccctt cgactacccg ttcatcagcc 2580
agggcgagat cctcgtggcc agcattgatg atgccgagga gctgctagcc acggatagtg 2640
ccatcgacat cctgggcttc accccagagg agaaatctgg actctacaag ctgacgggcg 2700
ccgtgatgca ctacgggaac atgaagttca agcagaagca acgggaggag caggcagagc 2760
cggacggcac ggaagtggct gacaagacag cctacctcat gggcctgaac tcttcggacc 2820
tcctgaaggc tttgtgcttc cccagagtca aagttgggaa cgagtatgtt accaagggcc 2880
agaccgtgga tcaggtgcac cacgcggtga acgcactctc caaatccgtc tacgagaagc 2940
tcttcctgtg gatggtcacc cgcatcaacc agcagctgga caccaagctg cccaggcagc 3000
acttcatcgg cgtcttggac atcgcgggct ttgagatctt tgagtataac agcctggagc 3060
agctgtgcat caacttcacc aacgagaaac tgcaacagtt tttcaaccac cacatgttcg 3120
tgctggagca ggaggagtac aagaaggaag gcatcgagtg gacgttcatc gacttcggga 3180
tggacctggc cgcctgcatc gagctcatcg agaagcccat gggcatcttc tccatcctgg 3240
aggaggagtg catgttcccc aaggccacag acacctcctt caagaacaag ctctatgacc 3300
agcacctggg caagtctgcc aacttccaga agcccaaggt gctcaagggc agggccgagg 3360
cccacttctc cctgatccac tacgcgggca ccgtggacta cagtgtctcg ggctggctgg 3420
agaagaacaa ggaccccctg aacgagacgg tggtcgggct gtaccagaag tcctccaacc 3480
ggctcctggc gcacctctac gcgaccttcg ccacggccga cgctgacagc ggaaagaaga 3540
aagttgccaa gaaaaagggt tcttccttcc aaaccgtctc tgcccttttc agggaaaacc 3600
tgaacaagct gatgtcgaat ttaaggacga ctcaccctca ctttgtgcgc tgtatcattc 3660
ccaatgaaac caaaacccca ggggccatgg aacatagcct ggtcctgcac cagctgaggt 3720
gtaacggcgt gctggagggc atccgcatct gcaggaaggg cttccccaat cggatcctct 3780
acggggattt taaacaaaga taccgcgtgc tgaatgccag cgccatcccc gagggacagt 3840
tcatcgacag caagaaggcg tgtgaaaagc tgttggcgtc catcgatatt gaccacactc 3900
agtacaaatt cggacacacc aaggtgttct tcaaggccgg cttgctggga accctggagg 3960
aaatgcggga cgaccgcctg gccaagctca tcacccggac gcaagccgtg tgcaggggct 4020
tcctcatgcg cgtggaattc cagaagatgg tgcagagaag ggagtccatc ttctgcatcc 4080
agtacaacat ccgagccttc atgaacgtca agcactggcc ctggatgaaa ctcttcttca 4140
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agttccagaa aaccaaggag gaactcgcca agtcagaggc aaagaggaag gaactggagg 4260
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agagcacagt atcacagctt tccagaagca agcaagcgtt tacccagcaa atagaagagc 5580
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cggagagggc ccggaaactg gcagagcagg agctcctgga cgccaacgag agggtgcagc 6780
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pENSSSCG00000029441 R-引物
<400> 18
aggtgtctgt ggccttgggg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pENSSSCG00000018006 F-引物
<400> 19
agaaccagcc cttcgatgcc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pENSSSCG00000018006 R-引物
<400> 20
tggcatacac atcctccggc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGAPDH F-引物
<400> 21
gggcatgaac catgagaagt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGAPDH R-引物
<400> 22
gggcatgaac catgagaagt 20
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pMYH3 F-引物
<400> 23
ccgagagctg gagtttga 18
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pMYH3 R-引物
<400> 24
ctcccatatg tccttccgag t 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh7 F-引物
<400> 25
agtcccaggt caacaagctg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh7 R-引物
<400> 26
ttccacctaa agggctgttg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh2 F-引物
<400> 27
agtcccaggt caacaagctg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh2 R-引物
<400> 28
gcatgaccaa aggtttcaca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh1 F-引物
<400> 29
agtcccaggt caacaagctg 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh1 R-引物
<400> 30
cacattttgc tcatctcttt g 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh4 F-引物
<400> 31
agtcccaggt caacaagctg 20
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh4 R-引物
<400> 32
tttctcctgt cacctctcaa ca 22
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myoglobin F-引物
<400> 33
gcaaggccct ggagctcttc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myoglobin R-引物
<400> 34
gcttggtggg ctggacagtg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnnt1 F-引物
<400> 35
cccccgaaga ttccagaagg 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnnt1 R-引物
<400> 36
tgcggtcttt tagtgcaatg ag 22
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnni1 F-引物
<400> 37
atgccggaag ttgagaggaa a 21
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnni1 R-引物
<400> 38
tccgagaggt aacgcacctt 20
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnnc1 F-引物
<400> 39
gcggtagaac agttgacaga g 21
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnnc1 R-引物
<400> 40
ccagctcctt ggtgctgat 19
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Aldoa F-引物
<400> 41
actctctgct gaccgggctc t 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Aldoa R-引物
<400> 42
aatgcttccg gtggactcat 20
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pvalb F-引物
<400> 43
atcaagaagg cgataggagc c 21
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pvalb R-引物
<400> 44
ggccagaagc gtctttgtt 19
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnnt3 F-引物
<400> 45
ggaacgccag aacagattgg 20
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnnt3 R-引物
<400> 46
tggaggacag agcctttttc tt 22
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnni2 F-引物
<400> 47
agagtgtgat gctccagata gc 22
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnni2 R-引物
<400> 48
agcaacgtcg atcttcgca 19
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnnc2 F-引物
<400> 49
atggcagcgg tactatcgac t 21
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnnc2 R-引物
<400> 50
ccttcgcatc ctctttcatc tg 22
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH F-引物
<400> 51
gaagggcatc ttgggctaca c 21
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH R-引物
<400> 52
gcagcgaact ttattgatgg tatt 24
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD36 F-引物
<400> 53
aatggcacag acgcagcct 19
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD36 R-引物
<400> 54
ggttgtctgg attctgga 18
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LPL F-引物
<400> 55
gtacctgaag actcgctctc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LPL R-引物
<400> 56
agggtgaagg gaatgttctc 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fabp4 F-引物
<400> 57
gatgcctttg tgggaacctg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fabp4 R-引物
<400> 58
tcctgtcgtc tgcggtgatt 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fto F-引物
<400> 59
gtcagagaga aggccaatga 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fto R-引物
<400> 60
tagcagtctc cctggtgaag 20
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pgc1α F-引物
<400> 61
ccctgccatt gttaagacc 19
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pgc1α R-引物
<400> 62
tgctgctgtt cctgttttc 19
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂联素 F-引物
<400> 63
aatggcacac caggccgtga t 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂联素 R-引物
<400> 64
tctccaggct ctcctttcct g 21
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYH3变异F-引物
<400> 65
tggtctttcc taattggtga cat 23
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYH3变异R-引物
<400> 66
agttttgagc aaggcttttg tt 22

Claims (9)

1.一种由MYH3基因中-1805bp至-1810bp之间的GGACTG的核苷酸的缺失产生的用于确定猪肉品质性状的遗传标记，其包含：由序列号1的多核苷酸中的5至300个连续核苷酸组成的多核苷酸或与其互补的多核苷酸，所述连续核苷酸包含序列号1的多核苷酸中的从第1524位至第1527位的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的遗传标记，其中，所述肉品质性状是选自由肌内脂肪含量、肉色、保水能力和猪肉剪切力组成的组中的至少一种性状。
3.用于检测根据权利要求1或2所述的遗传标记的试剂在确定猪肉品质性状中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述试剂是与所述遗传标记特异性结合的引物或探针。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述引物是由序列号65和66的核苷酸序列组成的多核苷酸。
6.包含用于检测根据权利要求1或2所述的遗传标记的试剂的试剂盒在确定猪肉品质性状中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述试剂盒是RT-PCR试剂盒或DNA芯片试剂盒。
8.一种用于确定猪肉品质性状的方法，包括：
(a)从分离自受试者的样品的DNA扩增根据权利要求1所述的遗传标记；
(b)鉴定步骤(a)的扩增产物的核苷酸序列；以及
(c)当所述扩增产物包括MYH3-1805-1810delGGACTG时确定所述猪肉品质性状优异。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述肉品质性状是选自由肌内脂肪含量、肉色、保水能力和猪肉剪切力组成的组中的至少一种性状。
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