CN110079614B - 一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记、检测方法及其应用 - Google Patents

一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记、检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子标记技术领域,特别涉及一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记、检测方法及其应用。目的在于得到一种与猪的猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记,并建立一种能够在较短时间内判断猪肌纤维面积和肌内脂肪含量的方法,从而判断肉质嫩度,并辅助育种。其技术方案要点包括:本发明根据TNNC2基因在第一外显子上的INDEL突变位点设计特异性引物并进行扩增,利用限制性内切酶BsmAI对该位点进行多态性检测,根据多态性检测的结果来区分猪个体间的肌纤维面积的大小与肌内脂肪含量。

Description

一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记、检测 方法及其应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域,特别涉及一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记、检测方法及其应用。
背景技术
我国是猪肉生产和消费的大国,长期以来,猪的生长速度、瘦肉率、饲料转化效率以及出栏量等指标一直是养猪生产工作关注的重点。但对产肉量的高强度选择使得肉的品质大幅度下降。随着人们物质生活水平的提高,优质优价的猪肉逐渐成为消费者选择的重点,而肉质的嫩度则是影响消费者选择的重要因素之一,因此,对于肉质嫩度的遗传改良逐渐成为育种工作的重要研究方向。
现有研究表明,肉质的嫩度与肌纤维的面积、肌内脂肪含量存在密切关系。其中,单根肌纤维的面积越小,则其剪切力越低,表现出的嫩度特性较好。肌内脂肪含量(intramuscularfat,IMF)通常被认为与嫩度,多汁性和风味呈正相关,当猪肉中肌内脂肪含量高时,则肌肉的剪切力降低,嫩度增加。
目前,对肌纤维面积以及肌内脂肪含量的测定需要将猪屠宰后才能进行,不仅增加了人工选择的成本,也在一定程度上限制了猪的遗传研究的发展。随着分子生物学技术的发展,通过分子标记对肉质性状实施早期选择逐渐成为育种的重要手段。
近年来,关于影响脂肪沉积的分子标记研究较多,例如心脏型脂肪酸结合蛋白(Heart-type Fatty Acid-Binding Protein,H-FABP、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(Adipocyte fatty Acid-Binding Protein,A-FABP)以及脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipase,LPL)均被认为是影响猪脂肪沉积的候选基因。尽管在猪肉质性状相关候选基因的鉴定及应用方面取得了一些进展,但与肌纤维性状和肌内脂肪含量相关的候选基因研究进展缓慢。
发明内容
本发明针对现有技术的缺点提供了一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记、检测方法及其应用,目的在于得到一种与猪的猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记,并建立一种能够在较短时间内判断猪肌纤维面积和肌内脂肪含量的方法,从而判断肉质嫩度,并辅助育种。
本发明的第一目的是提供一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记,所述分子标记位于TNNC2基因中,所述分子标记序列为:
(1)如SEQ ID NO:4所示,该序列位于TNNC2基因第一外显子处,用于检测剪接供体的缺失;
(2)如SEQ ID NO:5所示,该序列位于TNNC2基因第一外显子处,用于检测片段插入突变;
上述两种突变呈完全偶联关系。
本发明的第二目的是提供利用上述的分子标记检测猪TNNC2基因突变的方法,包括以下步骤:
S1:设计引物,针对TNNC2基因在第一外显子区域检测到的剪接供体的缺失和片段插入突变,设计特异性引物:
TNNC2_M1_F:5’CCTATCGCCACCTTACTGTCAC 3’,见SEQ ID NO:6;
TNNC2_M1_R:5’CAGCTGAAGAATAATGCAATGC 3’,见SEQ ID NO:7;
S2:对猪的基因组DNA进行PCR扩增;
S3:对PCR产物酶切,并进行电泳判断基因型。
进一步地,步骤S2中,PCR反应总体系为10μL,其中包括1μL的猪基因组DNA,浓度为50ng/μL;5μL的2×Taq PCR Mix;10mM的正、反向特异性引物各0.2μL;3.6μL的无菌水;扩增条件为:95℃预变性3min;95℃变性30s;60℃退火30s;72℃延伸15s;35个循环;72℃终止延伸5min;15℃冷却2min;并回收PCR产物。
进一步地,步骤S3中,酶切反应体积是5μL,其中10×buffer 0.5μL;PCR产物1.5μL;BsmAI限制性内切酶0.1μL;无菌水2.9μL;混匀之后离心;然后37℃酶切15min;酶切产物用6%非变性胶进行电泳检测酶切结果,并判断基因型。
本发明的第三目的是提供如上所述的分子标记在猪肉质性状相关分子标记辅助育种中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
TNNC2(Troponin C2,Fast Skeletal Type,TNNC2)是编码肌钙蛋白C亚基,负责与钙离子结合而触发肌动蛋白丝的运动,在调节肌肉收缩中起关键作用。
本发明根据TNNC2基因在第一外显子上的INDEL突变位点设计特异性引物并进行扩增,利用限制性内切酶BsmAI对该位点进行多态性检测,根据多态性检测的结果来区分猪个体间的肌纤维面积的大小与肌内脂肪含量。
本发明提供的检测方法方便便捷易操作,能够在较短的时间内鉴别TNNC2基因的多态性,从而检测猪背最长肌的肌纤维面积的大小与肌内脂肪含量,且不需要昂贵的设备;
本方法特异性好。本发明针对TNNC2的基因序列设计的针对INDEL位点的特异性引物,具有较高的特异性。
本发明提供的检测方法成本低。只需要通过PCR扩增与酶切的方法即可检测,不需要进行大量的群体规模采样与测定即可进行比较不同猪只之间肌纤维面积与肌内脂肪含量的差异。
附图说明
图1是TNNC2基因第一外显子到第三外显子区域PCR产物电泳图;
图2是TNNC2第一外显子检测到的INDEL突变在高低组个体中的单克隆测序结果;
图3是TNNC2基因三种不同基因型个体的PCR产物电泳图;
图4是限制性内切酶BsmAI基因分型结果电泳图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明披露了一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记、检测方法及其应用,具体如下各实施例所示。
实施例1TNNC2基因第一外显子到第三外显子区域的核苷酸序列克隆及SNP扫描
1.引物设计
从ensembl数据库下载猪(Sscrofa11.1)的TNNC2基因序列,GenBank收录号:NC_010445.4,其中第一外显子到第三外显子区域DNA序列如下,并见SEQ ID NO:1;序列表中,横线表示后续实验酶切PCR产物扩增的序列信息,框线中的序列为后续实验检测到的剪接供体突变序列,箭头代表后续实验检测到的插入突变的插入位点。
GACACGCAACCATGGTAAGGACGAGAGGGGATTTCATCCCTTTACTCGCCGGAGCACTTCTGGGCCAGATCCGGGTGCTCTGCAGGGCAGTAACTTGGATGTCTGAAGATGGACCCAGGCGTCTGGGAGGAAGCCCCAGAAGAAGGCCTTGGACTTGTCTTGGAAGGGGAGGGCTGGGACGTTCCAGGGCTTGACTCTCAAGGCATGCCTGTTCCCTGAGATCTTCGGAGGATTCCAGCAATGTTGGTCAGAGAACTGTGGGTGGGTGTTAGCTTGTTTCCCTCTTGGGTGGAGACAGGGAGCCTGAGGGCCAGAAGGAGTCGCCCAACAAGCCAGTGAGTGGCTGCGGTGGGCTGGAAGCCTTGCCCAACCCTCCTCCTGCCGGTGAGAGAAGGAAGACTCCTTTGAAAGACGGGAGGCCTGCAAGGGCTGGAACCAGCTGAGGGTTCAAGAGCTCCAAGCTCGGAATTCCCACTGTGGCACAGCAGAAACAAATGCGACTAGGATCTGTGAGGACGCAGCTTCGATTCCTAGCCTTGCTTAGTGGGTTAAGGATCCAAGCGTTGCTGTGAGCTGTGATGTAGGTCGCAGATGCGGCTCAGATCTGGTGTGGCTGTGGCTGTGGTGTAGGCTGGCAGCTGCAGCTCCGATTTGACCCCTAGCCCGGGAACCTCCATGTGCTGTGGGTGCGGCCCTAAAAAGATGAGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAGCTCCAAGCTCTCCAACCCAAGAGCTCCGAGGGGCCGAGAAGGGGCAGAAGAAGAGAGACCAGGGTTAGAGGGACGCCAGCCTCCCAGAAAGGCTGTCCTTTTCCTGGGAGGTTCCCCCTCCCCACTTCAAGGAGTAACTAGACCCAGAGGACAGCTGCTGTTACCCATTCCTGACTAAAAATAGCCTGCCCTTCTGGCACAGGCAAGGAAGAGGGGAGGAGGGGAGAGGAGGGGGACGAGGAGCAGGGACAGCAGCCAAACAGTTAATGATCTCCTTGGAAGTCTCAGCCCTTCCTTGTCGCCAGACTCAGTCCAACGCCCCTAGTTAGAGAGCTTGGCTTGCAGTGTGGCCAGAATTCCCTATCGCCACCTTA
Figure BDA0002070123430000041
ACATCTACTGAGCGCCTGTTAAAGTACCAGGCACGAGGGGAGTTCCCGCCGTGGCACAGGCGGCTAATGATCTGGTTTGTCTCTGTGGTGCTGCTGGTTCAATCAGTGCGTTAGGGATTGGGCATAACTGCAGCTGTGGTGTAGGTCACAGCTGCAACTCGGATTCAGTCCCTGGCCCGGGGAACTTCCATATGCCATGGGTACAGTGGAAAAAGGAAAAAAAGGGACCAGGCACTGCGAGGAGATGCGGAAAATTGGAAAATTATGCTGGAATGGTACTGGCACTTTACAAAGCCTTCTCACACCTCTGATCTCATCTCATCCCTGAGAAGTGGCTGAGAAGAGGGCACGAGGGCACATATAGTGACTTGCCCAAGGTTACTGGTGGGTTCCTGACTTGGCCTCCGACAAGGAAGAAGGCAATAATCCCTAATTCTTCAAAACTGGGGTTGAGGCTGTGGGAGTGTGTGGCAAGTCTGGAGTTGTTTCTCTGGGGGACTGAGGTTTACTTACAGAAATGGGGGTGCAGGAGAATCGGGTTAAGGCGGGAAAGCGCTCCCAGGCTGCCCCTTCTGCTCTTTGATGGCCTGTGTCTGTGTCTTCTGCAGACGGACCAGCAGGCTGAAGCCCGGTCCTACCTCAGCGAGGAGATGATCGCTGGTGAGTGGGGGTGGGCAGGCTGGCTGGTGGGTGGCTGCGGTGCTGGCGAATGTCTGGTGTCTGGGAGGGGGGGAGGGGGGATGTGAGGCTGACAGTCCGGCCAAGTTCACCTCCGCCCTCTGCCCTCCTTCTCCTGGCAGAGTTCAAGGCCGCCTTCGACATGTTTGACGCTG
设计克隆TNNC2基因的启动子的引物DNA序列如下:
正向引物:5'GACACGCAACCATGGTAAGGA 3',见SEQ ID NO:2;
反向引物:5'CTGCGTCAAACATGTCGAAG 3',见SEQ ID NO:3。
2.针对TNNC2基因表达量极端个体的选择
针对前期eQTL分析的结果,在已进行RNA-seq测序的189个体中,发现针对TNNC2基因的表达量(FPKM值)在个体间的存在极显著的差异。挑选TNNC2表达量在极端高组、极端低组中的代表性个体进行SNP多态性检测,每组3个,其中高组个体分别用H1,H2,H3来表示,低组个体用L1,L2,L3来表示。
3.PCR产物的扩增、纯化与克隆
10μL的PCR反应体系中含有1μL的猪的DNA模板,DNA浓度为50ng/μL,PhantaMaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 0.2μL,2×Phanta Max Buffer 5μL,dNTP Mix 0.2μL,10mM的正、反向引物各0.2μL以及无菌水3.2μL。扩增条件为:95℃预变性3min,95℃变性15s,60℃退火15s,72℃延伸70s,35个循环,72℃终止延伸5min,15℃冷却2min。其中,本实施例中采用苯酚-氯仿法抽提猪的基因组DNA,Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase购买自南京诺唯赞生物科技有限公司。
PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图1所示。扩增产物大小为2062bp,经琼脂糖电泳检测表明,PCR产物大小符合预期。M泳道为super DNA marker,第1泳道至第9泳道为PCR产物,第10泳道为阴性对照。
PCR产物的纯化:在紫外仪下从琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶并放入1.5mL的离心管中,然后用购买自北京天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化,所有操作均按照试剂盒说明书进行。
连接反应:借助Takara的pMD18T vector试剂盒进行连接操作,取回收的PCR产物4μL与1μL pMD18-Tvector混合,并加入试剂盒中的Solution I 5μL,置16℃金属浴1h,得到连接产物。
转化:无菌状态下取购自北京全式金公司的Trans-5α化学感受态细胞25μL,置于灭菌的1.5mL离心管中,加入5μL的连接产物并轻柔混匀,冰上静置30min,42℃热激90s,随后冰浴1-2min。加入400μL无抗生素的LB液体培养基,37℃振荡培养1h。低速离心后去除200μL的上清液,然后悬浮沉淀并将其涂布于含有氨苄青霉素50μg/mL的LB固体培养基上,37℃平放1h后倒置培养。
阳性单菌落检测:挑取平板上的单菌落,接种于1mL LB液体培养基中,37℃,300r/min培养6-8h。以菌液为模板,按照第3步中的PCR扩增体系进行PCR扩增,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,挑选阳性的单克隆。
4.测序
将上述阳性单克隆菌液送至武汉擎科伟业生物科技技术有限公司进行测序,利用DNAStar软件的SeqMan程序对测序结果进行拼接和序列比对,寻找其中的SNP位点。
5.TNNC2基因的SNP扫描
通过对该基因表达水平高低组个体扩增产物的测序结果分析发现,以在GeneBank下载到的TNNC2基因的序列为参考基因组序列,位于TNNC2基因第一外显子区域处存在一个11bp剪接供体(splicing donor)缺失的突变,剪接供体序列见SEQ ID NO:4,同第1步引物设计的序列表中框线内序列。在高组个体中存在两种单倍型,第一种单倍型的序列信息与参考基因组序列一致,另外一种单倍型的序列为在TNNC2基因第一外显子的剪接供体位置发生缺失突变,且在其前面37bp处存在17bp的插入突变,插入片段序列为5’GCATGAGTGGTATGTCC 3’,见SEQ ID NO:5,插入位点见第1步引物设计的序列表中箭头指示位置。在低组个体中,仅存在一种单倍型:序列中均存在剪接供体的缺失与17bp片段的插入。本实施例中将与参考基因组序列相同的序列命名为A等位基因,将存在剪接供体的缺失与片段插入的序列命名为B等位基因。测序部分结果如图2所示。
为了检测这种变异在拥有RNA-seq测序数据的189个个体中的存在情况,对189个个体进行PCR扩增,采用双向测序的方法对PCR产物进行测序检测。测序结果显示,剪接供体的缺失与前面17bp的片段插入是完全偶联的,两个偶联的位点命名为11bpDel-17bpIns,属于插入缺失(Insertion/Deletion,INDEL)突变INDEL。
实施例2TNNC2基因INDEL突变的检测方法
S1:引物设计。针对TNNC2基因在第一外显子处存在的INDEL突变设计特异性引物如下:
TNNC2_M1_F:5’CCTATCGCCACCTTACTGTCAC 3’,见SEQ ID NO:6;
TNNC2_M1_R:5’CAGCTGAAGAATAATGCAATGC 3’,见SEQ ID NO:7。
S2:PCR扩增,PCR反应总体系为10μL,其中包括1μL的猪基因组DNA,浓度为50ng/μL;5μL的2×Taq PCR Mix;10mM的正、反向特异性引物各0.2μL;3.6μL的无菌水;扩增条件为:95℃预变性3min;95℃变性30s;60℃退火30s;72℃延伸15s;35个循环;72℃终止延伸5min;15℃冷却2min。其中2×Taq PCR Mix购买自北京艾德莱生物科技有限公司。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。利用引物TNNC2_M1_F与TNNC2_M1_R进行扩增,获得扩增产物大小为135bp,如图3所示,序列如实施例1中第1步所给出的第一外显子到第三外显子区域DNA序列中的横线部分。
之后,在紫外仪下从琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶并放入1.5mL的离心管中,然后用购买自北京天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化,所有操作均按照试剂盒说明书进行。
S3:酶切并判断基因型,酶切反应体积是5μL,其中10×buffer 0.5μL;PCR产物1.5μL;BsmAI限制性内切酶0.1μL;无菌水2.9μL;混匀之后离心;然后37℃酶切15min;酶切产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测酶切结果,并判断基因型。
酶切结果如图4所示,当TNNC2的剪接供体发生缺失时,则会产生一个可被限制性内切酶BsmAI所识别的酶切位点,序列为5’GTCTCˇ3’。PCR产物的长为135bp,若个体样品的酶切产物有三条带,即产物长度分别为135bp,110bp和31bp,则该个体的基因型为AB型;若个体的酶切产物有两条带,即产物长度分别为110bp和31bp,则该个体的基因型为BB纯合型;若个体的酶切产物有一条带,即产物长度为135bp,则该个体的基因型为AA纯合型。酶切结果显示,TNNC2基因上的INDEL突变共存在三种基因型,根据基因型可判断猪个体间的肌纤维面积的大小与肌内脂肪含量。
实施例3遗传多样性检测及与性状的关联分析
1.利用实施例2中建立的针对TNNC2基因INDEL突变的检测方法,在“壮乡黑猪”群体(Group 1)的三个杂交组合(DLC,DDLC,DLLC)以及瘦肉型商业杂交群体中(Group 2)的三个杂交组合(PLY,DLY,PDLY)中进行多态性检测。结果如表1所示。
表1 TNNC2基因的INDEL突变在不同群体中的等位基因频率
Figure BDA0002070123430000071
结果显示,在“壮乡黑猪”群体中(Group 1),BB和AB基因型的个体占优势,AA基因型个体较少;在瘦肉型商业杂交群体中(Group 2),AA和AB基因型的个体占优势,BB基因型个体较少。
2.为了检测TNNC2基因的INDEL突变在不同纯种个体中的存在情况,收集了长白(Landrace)、大白(Yorkshire)、杜洛克(Duroc)、皮特兰(Pietrain)、陆川(Luchuan)和通城(Tongcheng)六个纯种猪个体的DNA,并进行多态性检测。结果如下表2所示。
表2 TNNC2基因在不同猪品种中的等位基因频率和基因型频率
Figure BDA0002070123430000081
结果表明,A等位基因是瘦型猪品种的主要等位基因,包括长白(Landrace)、大白(Yorkshire)、杜洛克(Duroc)、皮特兰(Pietrain),而B等位基因在中国地方猪品种陆川(Luchuan)和通城(Tongcheng)占优势。
3.性状表型值与标记多态性的关联分析
根据前期对“壮乡黑猪”的三个杂交组合以及瘦肉型商业杂交群体共计1648个个体进行了肉质性状的测定工作,将肉质性状测定的结果与TNNC2基因在群体中的基因型检测结果进行性状关联分析,并建立了如下线性模型:
Yijkl=μ+Gi+Bj+Sk+Flijkl
其中Y代表性状观察值,G代表基因型效应,B代表屠宰的批次效应,S代表性别效应,F代表公猪的效应,εijkl为随机误差。
表3“壮乡黑猪”群体中猪TNNC2基因INDEL位点的多态性与肉质性状关联分析结果
Figure BDA0002070123430000082
Figure BDA0002070123430000091
注:*表示显著关联(0.01<P≤0.05),**表示极显著关联(P≤0.01)。
表4瘦肉型商业杂交群体中猪TNNC2基因INDEL位点的多态性与肉质性状关联分析结果
Figure BDA0002070123430000092
注:*表示显著关联(0.01<P≤0.05),**表示极显著关联(P≤0.01)。
具体性状观察值的简单均数和标准差的分析结果总结如表3、表4所示。在“壮乡黑猪”以及3个瘦肉型猪商业杂交组合的实验群体对TNNC2基因第一外显子INDEL多态性位点与肉质性状进行了关联分析。分析结果显示,在“壮乡黑猪”实验群体中,INDEL位点的多态性与平均背膘厚极显著关联(p<0.01),与屠宰后24小时pH值、滴水损失、IMF含量和单根肌纤维的横截面积显著关联。其中BB型个体具有相对较小的肌纤维面积与较高的肌内脂肪含量。在瘦肉型商业杂交群体中(Group 2),INDEL位点的多态性与屠宰后45分钟pH值、肌内脂肪含量以及水分含量均关联极显著(p<0.01),其中BB型个体具有相对较高的肌内脂肪含量。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记、检测方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2062
<212> DNA
<213> TNNC2(TNNC2)
<400> 1
gacacgcaac catggtaagg acgagagggg atttcatccc tttactcgcc ggagcacttc 60
tgggccagat ccgggtgctc tgcagggcag taacttggat gtctgaagat ggacccaggc 120
gtctgggagg aagccccaga agaaggcctt ggacttgtct tggaagggga gggctgggac 180
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ttagtgggtt aaggatccaa gcgttgctgt gagctgtgat gtaggtcgca gatgcggctc 600
agatctggtg tggctgtggc tgtggtgtag gctggcagct gcagctccga tttgacccct 660
agcccgggaa cctccatgtg ctgtgggtgc ggccctaaaa agatgagaca aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aggagctcca agctctccaa cccaagagct ccgaggggcc gagaaggggc 780
agaagaagag agaccagggt tagagggacg ccagcctccc agaaaggctg tccttttcct 840
gggaggttcc ccctccccac ttcaaggagt aactagaccc agaggacagc tgctgttacc 900
cattcctgac taaaaatagc ctgcccttct ggcacaggca aggaagaggg gaggagggga 960
gaggaggggg acgaggagca gggacagcag ccaaacagtt aatgatctcc ttggaagtct 1020
cagcccttcc ttgtcgccag actcagtcca acgcccctag ttagagagct tggcttgcag 1080
tgtggccaga attccctatc gccaccttac tgtcaccccc gcaaggcccc atcacactct 1140
gcctccaatg actgattcat cagaaggaag cttacgatct ctgtcttggc aagttctcag 1200
taactttgca ttgcattatt cttcagctga catctactga gcgcctgtta aagtaccagg 1260
cacgagggga gttcccgccg tggcacaggc ggctaatgat ctggtttgtc tctgtggtgc 1320
tgctggttca atcagtgcgt tagggattgg gcataactgc agctgtggtg taggtcacag 1380
ctgcaactcg gattcagtcc ctggcccggg gaacttccat atgccatggg tacagtggaa 1440
aaaggaaaaa aagggaccag gcactgcgag gagatgcgga aaattggaaa attatgctgg 1500
aatggtactg gcactttaca aagccttctc acacctctga tctcatctca tccctgagaa 1560
gtggctgaga agagggcacg agggcacata tagtgacttg cccaaggtta ctggtgggtt 1620
cctgacttgg cctccgacaa ggaagaaggc aataatccct aattcttcaa aactggggtt 1680
gaggctgtgg gagtgtgtgg caagtctgga gttgtttctc tgggggactg aggtttactt 1740
acagaaatgg gggtgcagga gaatcgggtt aaggcgggaa agcgctccca ggctgcccct 1800
tctgctcttt gatggcctgt gtctgtgtct tctgcagacg gaccagcagg ctgaagcccg 1860
gtcctacctc agcgaggaga tgatcgctgg tgagtggggg tgggcaggct ggctggtggg 1920
tggctgcggt gctggcgaat gtctggtgtc tgggaggggg ggagggggga tgtgaggctg 1980
acagtccggc caagttcacc tccgccctct gccctccttc tcctggcaga gttcaaggcc 2040
gccttcgaca tgtttgacgc tg 2062
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Forward primer)
<400> 2
gacacgcaac catggtaagg a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Reverse primer)
<400> 3
ctgcgtcaaa catgtcgaag 20
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 剪接供体(splicing donor)
<400> 4
tcttggcaag t 11
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 插入片段(INDEL)
<400> 5
gcatgagtgg tatgtcc 17
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(TNNC2_M1_F)
<400> 6
cctatcgcca ccttactgtc ac 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(TNNC2_M1_R)
<400> 7
cagctgaaga ataatgcaat gc 22

Claims (2)

1.一种与猪肌纤维面积和肌内脂肪含量相关的分子标记,其特征在于: 所述分子标记位于TNNC2基因中,所述分子标记序列分别为:
(1)如SEQ ID NO:4所示,该序列位于TNNC2基因第一外显子处,用于检测剪接供体的缺失突变;
(2)如SEQ ID NO:5所示,该序列位于TNNC2基因第一外显子处,用于检测片段插入突变;
上述两种突变呈完全偶联关系。
2.如权利要求1所述的分子标记在猪肉质性状相关分子标记辅助育种中的应用,所述猪肉质性状为肌内脂肪含量;利用所述分子标记对猪肉肌内脂肪含量进行检测的方法包括:S1:设计引物,针对所述分子标记设计特异性引物:
TNNC2_M1_F: 5’ CCTATCGCCACCTTACTGTCAC 3’,见SEQ ID NO:6;
TNNC2_M1_R: 5’ CAGCTGAAGAATAATGCAATGC 3’,见SEQ ID NO:7;
S2:对猪的基因组DNA进行PCR扩增;
S3:对PCR产物用限制性内切酶BsmAI酶切,并进行电泳判断基因型;若个体样品的酶切产物有三条带,即产物长度分别为135bp,110bp和31bp,则该个体的基因型为AB型;若个体的酶切产物有两条带,即产物长度分别为110bp和31bp,则该个体的基因型为BB纯合型;若个体的酶切产物有一条带,即产物长度为135bp,则该个体的基因型为AA纯合型;其中,BB型个体具有较高的肌内脂肪含量。
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