CN115807101A - 一种与鸡免疫性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与鸡免疫性状相关的分子标记及其应用，涉及动物分子生物技术领域，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第421位的碱基为T或G，第402位的碱基为A或G，第398位的碱基为T或C，第290位的碱基为G或C，第239位的碱基为C或T。本发明公开的SNP位点可用于对鸡传染性法氏囊病(IBD)、新城疫病毒(NDV)的病毒抗体水平进行选择，加快抗病选择育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及动物分子生物技术领域，尤其涉及一种与鸡免疫性状相关的分子标记及其应用。
背景技术
鸡作为中国国内畜牧业重要的经济家禽之一，风味佳营养价值高，且我国地方品种资源丰富，优质鸡配套系繁多，是较佳的育种素材。但良种繁育体系不够健全，致使鸡群体型均匀度差，市场混乱，而且对生长的遗传规律及机制不深入等因素极大地影响优良品种的资源利用及其商品的经济效益。
pIgR是一种单跨膜膜蛋白，其结构可分为胞外结构域、跨膜结构域和胞浆内结构域。其主要功能是协同IgA的转运，使IgA发挥黏膜免疫的重要作用。已有实验证实，pIgR不仅参与先天性免疫，而且参与IgA介导的获得性免疫。
鸡免疫性状受多基因共同协调控制，遗传规律及机制十分复杂。经研究发现，pIGR基因作为多聚体免疫球蛋白的受体对鸡的免疫性能起调节作用。但目前从遗传的角度来说，还没有建立有关pIGR基因作为鸡免疫性状分子标记的检测方法，同时该基因作为鸡免疫性状分子标记辅助选择也未见应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种与鸡免疫性状相关的分子标记及其应用，其可为免疫性状在种质资源深度鉴评以及育种利用提供参考。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种与鸡免疫性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第421位的碱基为T或G(SNP1)，第402位的碱基为A或G(SNP2)，第398位的碱基为T或C(SNP3)，第290位的碱基为G或C(SNP4)，第239位的碱基为C或T(SNP5)。
相应的，本发明还公开了一种用于检测上述的与鸡免疫性状相关的分子标记的引物组合，其包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
相应的，本发明还公开了一种试剂盒或PCR反应体系，其包括上述的引物组合。
相应的，本发明还公开了上述的分子标记在(1)或(2)中的应用：
(1)检测鸡免疫性状；
(2)鸡分子育种。
相应的，本发明还公开了上述的引物组合在(1)或(2)中的应用：
(1)检测鸡免疫性状；
(2)鸡分子育种。
相应的，本发明还公开了上述的试剂盒或PCR反应体系在(1)或(2)中的应用：
(1)检测鸡免疫性状；
(2)鸡分子育种。
作为上述技术方案的改进，所述检测鸡免疫性状为对鸡传染性法式囊病和/或鸡新城疫病毒的耐受性和/或易感性
相应的，本发明还公开了一种检测鸡免疫性状的方法，其采用如权利要求2所述的正向引物、反向引物扩增待测鸡的DNA，检测扩增产物，对其进行SNP筛选、基因分型。
具体的，当SNP1为G，SNP2为A，SNP3为C，SNP4为C，SNP5为C时为单倍型H1，待测鸡对鸡传染性法氏囊病(IBD)的抗体水平最高，即提高了群体IBD耐受性比例。
当SNP1为T，SNP2为A，SNP3为C，SNP4为C，SNP5为C时为单倍型H6，待测鸡新城疫病毒(NDV)的抗体水平较高，即提高了群体NDV耐受性比例。
当SNP1为G，SNP2为G，SNP3为C，SNP4为G，SNP5为T时为单倍型H3，待测鸡的NDV病毒的抗体水平最低，即提高了群体NDV易感性比例。
作为上述技术方案的改进，扩增反应条件为：
95℃预变形5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环，最后72℃延伸7min。
相应的，本发明还公开了一种鸡分子育种方法，其包括采用上述的分子标记进行鸡辅助育种的步骤。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明基于对鸡免疫性状相关基因pIGR的深度分析，建立了与鸡免疫性状相关的分子标记，其为不同类型鸡对体内IBD和NDV这两种病毒抗体水平进行选择，加快抗病选择育种进程和提高群体对该病毒的耐受性。
附图说明
图1是本发明实施例1中F2群体的PCR琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
发明下述实施例中，涉及的设备及试剂包括：
DNA分子标准量Marker购自广州东盛生物科技有限公司；DNA聚合酶购自AG公司；饱和苯酚购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA提取液二合一、DNA提取液三合一购自Solarbio公司；BioChek病毒抗体检测试剂盒购自天之泰公司。恒温水浴锅、恒温摇床、低温高速离心机、PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、自动洗板机、恒温培养箱、酶联免疫检测仪为常规设备。
实施例1鸡免疫性状pIGR基因分子检测方法的建立
(一)实验材料
广东省农业科学院动物科学研究所原种保育鸡场的F2资源群体由广东省农业科学院动物科学研究所家禽育种与生产研究室团队建立。利用土鸡专门化品系H和快大型专门化品系A，按公母比例1：4，进行正反杂交产生F1代，F1代群体内避免半同胞横交，同时产生F2资源群体，分别在3日龄和8日龄完成NDV和IBD疫苗接种。随机选取F2同批次群体645羽，公母鸡分别是330羽和315羽。每个个体标记唯一的翅号身份标识，在相同饲养条件下饲养。12周龄时，每个个体利用ETDA抗凝真空采血管通过翅下静脉采集1mL全血并记录，保存于-20℃冰箱，用于后续的DNA提取。13周龄时，每个个体利用促凝真空采血管通过翅下静脉采集2ml全血，室温静置自然析出血清，即取上清液(血清)于1.5mL离心管-80℃冰箱保存，用于后续的ELISA病毒抗体测定。
(二)DNA提取
所有个体的DNA提取操作均按照饱和苯酚-氯仿传统提取法进行，提取血液样品的基因组DNA后，检测DNA样本浓度和OD值，将DNA浓度大于500ng/μL、OD260/OD280之比值在1.8～2.0之间的样品，保存于20℃冰箱，用于后续的PCR扩增。
(三)引物
根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)官网所提供的鸡(Gallus gallus)pIGR基因编码区的DNA序列(NCBI登录号为：NC_052557.1)为模板，使用NCBI的Primer BLAST工具进行引物设计一对引物pIGR-3F/pIGR-3R，该引物有效扩增得到如序列SEQ ID NO.1所示的DNA序列，该序列全长为535bp。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 引物表
(四)PCR扩增
总体积为25μL的PCR反应体系中加入鸡血液DNA模板1μL，2×PCR反应混合物(AG公司)12.5μL，10mM正反引物各1μL，双蒸水9.5μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
(五)寻找分子标记及抗体水平分析
PCR扩增产物直接测序，运用DNASTAR软件分析序列，筛选SNP位点，寻找到第421位碱基处T/G的碱基突变，第402位碱基处A/G的碱基突变，第398位碱基处T/C的碱基突变，第290位碱基处G/C的碱基突变，第239位碱基处C/T的碱基突变，共5个碱基突变。
采用酶联免疫吸附法分别检测多个血清病毒抗体水平并计算抗体滴度。利用SPSS23.0软件进行单倍型与IBD、NDV等抗体水平的免疫性状进行关联分析。
(六)实验结果
取F2群体DNA为模板，进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段的完整性，PCR产物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司正或反向Sanger测序。利用DNASTAR软件将所获序列峰图(图1)与pIGR基因编码区的DNA序列对比分析，筛选SNP位点结果。找到SNP1～SNP5的5个碱基突变对应pIGR基因的CDS区外显子3上发生，SNP1发生(丝氨酸S)-(异亮氨酸I)的错义突变，SNP2发生(甘氨酸G)-(精氨酸R)的错义突变，SNP3发生(甘氨酸G)-(甘氨酸G)的同义突变，SNP4发生(甘氨酸G)-(甘氨酸G)的同义突变，SNP5发生(丝氨酸S)-(丝氨酸S)的同义突变。使用Haploview4.2软件对这5个SNP构建单倍型，分别为H1、H2、H3、H4、H5、H6，结果见表2。
表2 鸡pIGR基因单倍型频率统计表
采用酶联免疫吸附法分别检测多个血清病毒抗体水平，每羽血清样品按照1:500稀释。按天之泰BioChek病毒抗体检测试剂盒说明书操作，并计算每羽体内抗体滴度。利用SPSS23.0软件进行分析，得到对应单倍型IBV和NDV抗体滴度平均值和标准误，结果见表3。
表3 鸡pIGR基因不同单倍型抗体滴度结果
根据F2群体个体单倍型分型数据，结合该群体的病毒抗体水平数据记录，利用SPSS23.0软件进行单倍型与免疫性状进行关联分析，结果见表4。该软件利用一般线性模型单因素分析检验不同单倍型组合型个体间免疫性状差异显著性，同列肩标字母相隔表示差异显著(p<0.01)，字母相邻表示差异显著(p<0.05)，字母相同或无标注者表示差异不显著(p>0.05)。Lamda法检测单倍型与免疫性状间关联性，返回的p值表示单倍型与性状间关联的显著性，单倍型效应λ值的大小表示单倍型效应的大小，且值越大，表示对免疫性状效应大(即与所对应的免疫性状关联性越高)；p值≤0.05为相关性显著，p值≤0.01为相关性极显著。
表4 不同单倍型组合与免疫性状关联分析结果
注：同列肩标字母不同表示差异显著(p<0.05)，字母相同表示差异不显著(p>0.05)。
由表3和4可知，pIGR基因的单倍型分别与IBD和NDV免疫性状的相关性达极显著水平(p＝0.000)，当所述单倍型为H1(GACCC)，F2群体的鸡传染性法氏囊病(IBD)病毒抗体水平最高，即提高了群体IBD耐受性比例；单倍型为H6(TACCC)，F2群体的鸡新城疫(NDV),病毒抗体水平较高，即提高了群体NDV耐受性比例；当单倍型为H3(GGCGT)，F2群体的NDV病毒抗体水平较低，即提高了群体NDV易感性比例。
通过以上实施例可以看出：检测pIGR基因的单倍型能有效提高鸡群的抗病耐受性。
以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种与鸡免疫性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第421位的碱基为T或G，第402位的碱基为A或G，第398位的碱基为T或C，第290位的碱基为G或C，第239位的碱基为C或T。
2.一种用于检测如权利要求1所述的与鸡免疫性状相关的分子标记的引物组合，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种试剂盒或PCR反应体系，其特征在于，包括如权利要求2的所述的引物组合。
4.如权利要求1所述的分子标记在(1)或(2)中的应用：
(1)检测鸡免疫性状；
(2)鸡分子育种。
5.如权利要求2所述的引物组合在(1)或(2)中的应用：
(1)检测鸡免疫性状；
(2)鸡分子育种。
6.如权利要求3所述的试剂盒或PCR反应体系在(1)或(2)中的应用：
(1)检测鸡免疫性状；
(2)鸡分子育种。
7.如权利要求4～6任一项所述的应用，其特征在于，所述检测鸡免疫性状为对鸡传染性法式囊病和/或鸡新城疫病毒的耐受性和/或易感性。
8.一种检测鸡免疫性状的方法，其特征在于，采用如权利要求2所述的正向引物、反向引物扩增待测鸡的DNA，检测扩增产物，对其进行SNP筛选、基因分型。
9.如权利要求1所述的检测鸡免疫性状的方法，其特征在于，扩增反应条件为：
95℃预变形5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环，最后72℃延伸7min。
10.一种鸡分子育种方法，其特征在于，包括采用如权利要求1所述的分子标记进行鸡辅助育种的步骤。
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