CN117305473A - 一种与鸡免疫性状相关基因pla2g7的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分子标记的技术领域，具体涉及一种与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记及其应用。所述分子标记包括PLA2G7基因外显子核酸序列SEQ ID NO.1第143位碱基处G/A的碱基突变位点SNP1，第194位碱基处T/C的碱基突变位点SNP2；还包括PLA2G7基因外显子核酸序列SEQ ID NO.2第332位碱基处T/C的碱基突变位点SNP3，第427位碱基处C/T的碱基突变位点SNP4，第526位碱基处G/A的碱基突变位点SNP5。根据其基因型判断鸡体的免疫能力，为免疫性状在种质资源深度鉴评以及育种利用提供参考，加快抗病选择育种进程和提高群体对该病毒的耐受性。
Description
技术领域
本发明属于生物分子标记的技术领域，具体涉及一种与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记及其应用。
背景技术
我国在鸡肉生产和消费方面占有重要地位，家禽业正在快速增长，市场需求强大，同时也面临环境承载压力不断增加的挑战。高密度现代化鸡群饲养模式的迅速发展提高了家禽产能，但却加大了鸡类传染性疾病的爆发风险，导致巨大的经济损失和资源浪费。因此，对于培育高抗病性家禽资源的需求变得愈加紧迫。反复的生产实践已经证明，在不同的家禽品种、系谱，甚至不同个体之间，对于同一病原体往往表现出不同的敏感性或抵抗力，由此说明疾病的发生受遗传因素的影响，因此，通过从遗传角度入手，通过识别与抗病能力紧密相关的单核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，将分子育种与表型选育相结合，来筛选具有天生抗病能力的鸡个体，这对于提高选留抗病个体的育种进程具有重要意义。
PLA2G7是一个与免疫相关的基因，该基因编码的脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)主要由炎症细胞分泌，是炎症的强效激活剂。在临床研究中，PLA2G7与许多代谢、免疫功能障碍等相关疾病有关。但目前还没有建立有关PLA2G7基因作为鸡免疫性状分子标记的检测方法，同时该基因作为鸡免疫性状分子标记辅助选择也未见应用。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记及其应用。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于鸡PLA2G7基因的外显子上；
所述SNP分子标记包括PLA2G7基因外显子核酸序列SEQ ID NO.1第143位碱基处G/A的碱基突变位点SNP1，第194位碱基处T/C的碱基突变位点SNP2；
所述SNP分子标记还包括PLA2G7基因外显子核酸序列SEQ ID NO.2第332位碱基处T/C的碱基突变位点SNP3，第427位碱基处C/T的碱基突变位点SNP4，第526位碱基处G/A的碱基突变位点SNP5。
所述SNP1基因型为AA时，F2群体的禽白血病(ALV)病毒抗体水平较高，SNP1基因型为GG时，F2群体的禽白血病(ALV)病毒抗体水平较低；
所述SNP2基因型为TT时，F2群体的禽流感(AI)病毒抗体水平较高，SNP2基因型为CC时，F2群体的禽流感(AI)病毒抗体水平较低；
所述SNP3基因型为CC或SNP5基因型为AA时，F2群体的鸡传染性支气管炎(IBV)病毒抗体水平较高，SNP3基因型为TT或SNP5基因型为GG时，F2群体的鸡传染性支气管炎(IBV)病毒抗体水平较低；
当SNP4基因型为TT时，F2群体的新城疫病(NDV)病毒抗体水平较高，SNP4基因型为CC时，F2群体的新城疫病(NDV)病毒抗体水平较低；
可见，所述分子标记的基因型会影响鸡群体的ALV/AI/IBV/NDV的耐受性(抗体水平提高)或易感性(抗体水平降低)比例。
本发明还提供了上述鸡免疫性状相关基因PLA2G7的引物对，包括扩增PLA2G7基因外显子DNA序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对1和引物对2；
所述引物对1的正反引物的核酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
所述引物对2的正反引物的核酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种上述SNP分子标记或引物对在制备检测鸡免疫性状试剂盒的应用。
本发明还提供了一种检测鸡免疫性状的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对。
本发明还提供了上述SNP分子标记或引物对或试剂盒在鸡遗传选育的应用。
本发明还提供了检测鸡免疫性状相关基因PLA2G7分子标记的方法，包括如下步骤：
1)以鸡血液DNA为模板，进行PCR扩增；
所述PCR扩增的体系：总体积为25μL的PCR反应体系中加入鸡血液DNA模板1μL，2×PCR反应预混液(含高保真DNA聚合酶)12.5μL，10mM正反引物各1μL，双蒸水9.5μL；
扩增反应为：98℃变性10s，58.6℃退火5s，72℃延伸5s，共34个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
2)对扩增产物进行SNP筛选，按照上述分子标记的基因型对鸡的免疫性状进行判断。
本发明的有益效果如下：
本发明的与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记，根据其基因型判断鸡体的免疫能力，判断不同类型鸡对体内ALV、AI、IBV、NDV这四种病毒抗体水平，为免疫性状在种质资源深度鉴评以及育种利用提供参考，加快抗病选择育种进程和提高群体对该病毒的耐受性。
附图说明
图1为本发明实施例1中F2群体的PCR琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
所采用的试剂以及设备如下：
DNA分子标准量Marker购自广州东盛生物科技有限公司；
高保真DNA聚合酶购自AG公司；
饱和苯酚购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
DNA提取液二合一、DNA提取液三合一购自Solarbio公司；
BioChek病毒抗体检测试剂盒购自天之泰公司；
恒温水浴锅、恒温摇床、低温高速离心机、PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、自动洗板机、恒温培养箱、酶联免疫检测仪为常规设备。
实施例1
鸡免疫性状PLA2G7基因分子检测方法的建立
1)材料准备
采用广东省农业科学院动物科学研究所的土鸡专门化品系H(即Huiyang Bearedchicken，参Sheng Z,Pettersson M E,Hu X,etal.Genetic dissection of growthtraits in a Chinese indigenous×commercial broiler chicken cross[J].BmcGenomics,2013,14.或Wang Y,Guo F,Qu H,et al.Associations between variants ofbone morphogenetic protein 7gene and growth traits in chickens[J].Br Poult,2018:00071668.2018.1454586.)和快大型专门化品系A(即High Quality Chicken LineA，参Sheng Z,Pettersson M E,Hu X,etal.Genetic dissection of growth traits in aChinese indigenous×commercial broiler chicken cross[J].Bmc Genomics,2013,14.或Wang Y,Guo F,Qu H,et al.Associations between variants of bone morphogeneticprotein 7gene and growth traits in chickens[J].Br Poult,2018:00071668.2018.1454586.)，按公母比例1：4，进行正反杂交产生F1代，F1代群体内避免半同胞横交，同时产生F2资源群体。随机选取F2同批次群体601羽，公母鸡分别是322羽和279羽。每个个体标记唯一的翅号身份标识，在相同饲养条件下饲养。12周龄时，每个个体利用ETDA抗凝真空采血管通过翅下静脉采集1mL全血并记录，保存于-20℃冰箱，用于后续的DNA提取。13周龄时，每个个体利用促凝真空采血管通过翅下静脉采集2mL全血，室温静置自然析出血清，即取上清液(血清)于1.5mL离心管-80℃冰箱保存，用于后续的ELISA病毒抗体测定。
2)DNA提取
所有个体的DNA提取操作均按照饱和苯酚-氯仿传统提取法进行，提取血液样品的基因组DNA后，检测DNA样本OD值和浓度，将DNA浓度大于500ng/μL、OD260/OD280之比值在1.8-2.0之间的样品，于-20℃冰箱中保存，用于后续的PCR扩增。
引物根据Ensembl数据库提供的鸡(Red Jungle fowl)PLA2G7基因组序列(ENSGALG00000016713)为模板，使用Primer Premier 5.0软件进行引物设计两对引物，分别为：
PLA2G7-5F/PLA2G7-5R，核酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，进行PCR扩增得到如序列SEQ ID NO.1所示的DNA序列，该序列全长为736bp；
PLA2G7-13F/PLA2G7-13R，核酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，进行PCR扩增得到如序列SEQ ID NO.2所示的DNA序列，该序列全长为783bp；
所述引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增信息如表1：
表1 PLA2G7基因的PCR扩增
PCR扩增条件：
总体积为25μL的PCR反应体系中加入鸡血液DNA模板1μL，2×PCR反应预混液(含高保真DNA聚合酶)12.5μL，10mM正反引物各1μL，双蒸水9.5μL。
PCR反应条件为：98℃变性10s，58.6℃退火5s，72℃延伸5s，共34个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
3)寻找分子标记：
PCR扩增产物直接测序，运用DNA STAR软件分析序列，筛选SNP位点，在SEQ IDNO.1所示的DNA序列寻找到第143位碱基处G/A的碱基突变，第194位碱基处T/C的碱基突变；在SEQ ID NO.2所示的DNA序列寻找到第332位碱基处T/C的碱基突变，第427位碱基处C/T的碱基突变，第526位碱基处G/A的碱基突变，共5个碱基突变。
4)基于SNP分子标记检测进行抗体水平分析
采用酶联免疫吸附法分别检测多个血清病毒抗体水平并计算抗体滴度。利用SPSS23.0软件进行SNPs与ALV、AI、IBV、NDV等抗体水平的免疫性状进行关联分析。
5)实验步骤与结果：
取F2群体DNA为模板，进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段的完整性(图1)，PCR产物直接送广州天一辉远基因科技有限公司正或反向Sanger测序。
利用DNASTAR软件将所获序列峰图与PLA2G7基因外显子的DNA序列对比分析，筛选SNPs位点结果见表2，找到SNP1～SNP5的5个碱基突变对应PLA2G7基因外显子5和外显子13上发生，SNP1发生(苏氨酸T)-(苏氨酸T)的同义突变，SNP2发生(天冬酰胺N)-(天冬酰胺N)的同义突变，SNP3-5不在编码区内。
表2鸡PLA2G7基因SNPs位点的基因频率统计表
采用酶联免疫吸附法分别检测多个血清病毒抗体水平，每羽血清样品按照1:500稀释。按天之泰BioChek病毒抗体检测试剂盒说明书操作，并计算每羽体内抗体滴度。
利用SPSS23.0软件进行分析，得到SNPs位点与ALV、AI、IBV、NDV等抗体滴度平均值和标准误，根据F2群体个体基因分型数据，结合该群体的病毒抗体水平数据记录，利用SPSS23.0软件进行基因型与免疫性状关联分析，结果见表3。该软件利用广义线性模型分析检验不同基因型个体间免疫性状差异显著性，同列肩标字母相隔表示差异显著(p<0.01)，字母相邻表示差异显著(p<0.05)，字母相同或无标注者表示差异不显著(p＞0.05)。
表3PLA2G7基因分子标记SNP1-5抗体滴度结果
注：同列肩标字母相隔表示差异显著(p<0.01)，字母相邻表示差异显著(p<0.05)，字母相同或无标注者表示差异不显著(p>0.05)。
由表3可见，当PLA2G7基因的SNP1基因型为AA时，F2群体的禽白血病(ALV)病毒抗体水平最高，即提高了群体ALV耐受性比例；当SNP2基因型为TT时，F2群体的禽流感(AI)病毒抗体水平最高，即提高了群体AI耐受性比例；当SNP3基因型为CC或SNP5基因型为AA时，F2群体的鸡传染性支气管炎(IBV)病毒抗体水平较高，即提高了群体IBV耐受性比例；当SNP4基因型为TT时，F2群体的新城疫病(NDV)病毒抗体水平最高，即提高了群体NDV耐受性比例。
综上可见，通过分子标记检测PLA2G7基因的基因型，能实现对鸡群的抗病耐受性的判断。
Claims (10)
1.一种与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于鸡PLA2G7基因的外显子上，包括核酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列上。
2.根据权利要求1所述与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记包括PLA2G7基因外显子核酸序列SEQ ID NO.1第143位碱基处G/A的碱基突变位点SNP1，第194位碱基处T/C的碱基突变位点SNP2。
3.根据权利要求1所述与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记还包括PLA2G7基因外显子核酸序列SEQ ID NO.2第332位碱基处T/C的碱基突变位点SNP3，第427位碱基处C/T的碱基突变位点SNP4，第526位碱基处G/A的碱基突变位点SNP5。
4.根据权利要求2所述与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP1基因型为AA时，F2群体的禽白血病(ALV)病毒抗体水平较高，SNP1基因型为GG时，F2群体的禽白血病(ALV)病毒抗体水平较低。
5.根据权利要求2所述与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP2基因型为TT时，F2群体的禽流感(AI)病毒抗体水平较高，SNP2基因型为CC时，F2群体的禽流感(AI)病毒抗体水平较低。
6.根据权利要求3所述与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP3基因型为CC或SNP5基因型为AA时，F2群体的鸡传染性支气管炎(IBV)病毒抗体水平较高，SNP3基因型为TT或SNP5基因型为GG时，F2群体的鸡传染性支气管炎(IBV)病毒抗体水平较低。
7.根据权利要求3所述的与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记，其特征在于，当SNP4基因型为TT时，F2群体的新城疫病(NDV)病毒抗体水平较高，SNP4基因型为CC时，F2群体的新城疫病(NDV)病毒抗体水平较低。
8.一种权利要求1-7任一项所述的与鸡免疫性状相关基因PLA2G7的SNP分子标记的引物对，其特征在于，包括扩增pla2g7基因外显子DNA序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对1和引物对2；
所述引物对1的正反引物的核酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
所述引物对2的正反引物的核酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
9.一种检测鸡免疫性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求8所述引物对和PCR反应体系。
10.一种权利要求1所述SNP分子标记或权利要求8引物对或权利要求9所述试剂盒在鸡遗传选育的应用。
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