CN107267637B - 一种鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记及其应用。所述的鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记为以ACVR2B基因的第一个碱基为第1位点，第86033位点的A/T碱基突变、第86034位点的G/C碱基突变、第86035位点的A/T碱基突变、第86036位点的C/G碱基突变、第86037位点的A/T碱基突变、第86046位点的A/T碱基突变或第86156位点的T/C碱基突变。本发明还提供了用于鉴定上述分子标记的引物，通过上述分子标记及鉴定引物，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡肌间脂肪宽度性状遗传改良中，从而提高鸡肌间脂肪宽度，进而改善鸡肉的肉质及风味。

Description

一种鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记及其应用。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)是指由于单个核苷酸发生变异而引起的基因组水平上DNA序列的多态性，其形式包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失。目前，SNP作为第三代的分子标记，在基因组上分布非常广泛，早已成为分子生物学的研究热点。SNP位点丰富，大约1000bp就会出现一个；其遗传稳定性高，一般只有2种等位型的碱基组成，具有二态性。在检测时只需要通过一个简单的“+/-”方式即可进行基因分型。这使得检测和分析易于实现自动化。因此，SNP应用于畜禽育种领域非常广泛。
肌肉脂肪是近年来比较受关注的指标，肌肉脂肪对于肉品质的作用主要为三个方面：1)一定的脂肪含量可以增加肉的嫩度，鸡肉脂肪中含饱和脂肪酸比较多，其熔点较高，可口性较好。有报道证明，肌肉脂肪含量的多少与肌肉嫩度呈正相关。2)肌肉脂肪含量的多少与肉品的多汁性有关，高品质肉块比低品质肉块更多汁的原因是肌肉脂肪含量高。3)肌肉脂肪含量与肉品的风味有关，脂类和一些脂溶性物质是一些风味物质的前体物，脂肪含量越高肉块越香。
近几十年来，人们大力追求家畜家禽的肌肉产量和生长速度，取得了巨大的成就。然而，在改善肉质方面却进步缓慢，改良品种的肉质与国内一些地方品种相比，甚至还有退步。好在，肉质问题逐渐被育种人员慢慢重视起来，期望培育出兼具高产肉量与肉质优良的畜禽。
发明内容
为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记，该分子标记可作为选育优质肉鸡的分子标记，有助于培育出肉质、风味良好的优质文昌鸡。
本发明的另一目的在于提供上述鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记，位于ACVR2B基因第八内含子上，以ACVR2B基因(NCBI Reference Sequence NC_006089.4)的第一个碱基为第1位点，第86033位点的A/T碱基突变、第86034位点的G/C碱基突变、第86035位点的A/T碱基突变、第86036位点的C/G碱基突变、第86037位点的A/T碱基突变、第86046位点的A/T碱基突变或第86156位点的T/C碱基突变；
所述的鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记在鸡肌间脂肪宽度性状研究和/或鸡育种中的应用；
所述的鸡肌间脂肪宽度性状研究优选包括利用上述分子标记鉴定鸡肌间脂肪宽度性状；
所述的鸡肌间脂肪宽度性状研究优选还包括利用上述分子标记调节鸡肌间脂肪宽度性状；
一种用于鉴定上述鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记的引物，包括引物ACVR2B-F和引物ACVR2B-R，其核酸序列如下所示：
引物ACVR2B-F：5'-CTCACTGACCATCCATCT-3'；
引物ACVR2B-R：5'-GACAGGGAACAAAAACAA-3'；
一种检测鸡肌间脂肪宽度性状的方法，包含如下步骤：
检测鸡ACVR2B基因(NCBI Reference Sequence NC_006089.4)，以第一个碱基为第1位点起，第86033位点是A碱基还是T碱基、第86034位点的G碱基还是C碱基、第86035位点的A碱基还是T碱基、第86036位点的C碱基还是G碱基、第86037位点的A碱基还是T碱基、第86046位点的A碱基还是T碱基或第86156位点的T碱基还是C碱基；
所述的鸡优选为文昌鸡；
一种选育肉质优良的文昌鸡的方法，包含如下步骤：
检测文昌鸡的ACVR2B基因，被测定的文昌鸡的ACVR2B基因以第一个碱基为起点的第86033位点，第86034位点，第86035位点，第86036位点，第86037位点，第86046位点，第86156位点；当第86033位点，第86034位点，第86035位点，第86036位点，第86037位点，第86046位点，第86156位点分别为AA、GC、AA、GG、AA、AT、CC基因型时，表明被测文昌鸡的肌间脂宽性状具有优势，否则不具有优势；优势个体保留，不具优势个体淘汰；
所述的检测方法优选为：设计引物ACVR2B-F和ACVR2B-R，对被测鸡DNA进行PCR反应及测序；
所述PCR反应的程序优选为94℃预变性3min；98℃变性10s；53℃退火30s；72℃延伸50s；38个循环；72℃后延伸5min；
所述PCR反应的体系优选为：
Figure BDA0001360146500000031
本发明的原理：
人工选择旨在针对特定经济性状进行育种，使目标性状的表现逐渐强化，而不需要的性状则可能逐渐退化。SNP是在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。
本发明提供的SNP位于ACVR2B基因第八内含子上，为ACVR2B基因以第一个碱基为起点的第86033位点的A/T碱基突变，第86034位点的G/C碱基突变，第86035位点的A/T碱基突变，第86036位点的C/G碱基突变，第86037位点的A/T碱基突变，第86046位点的A/T碱基突变，第86156位点的T/C碱基突变。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明研究并确定鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记，使用该分子标记进行标记辅助选择，能够极大地加快文昌鸡肌间脂肪宽度提高进程。
(2)本发明提供的鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记各SNP位点的优势基因型频率较高，容易收集大量的该基因型的父母代进行大规模育种。
(3)本发明提供的鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记各优势基因型与劣势基因型对比，该两种基因型个体的肌间脂宽差异显著，通过人工选育，容易获得较大育种成效。
(4)本发明通过上述鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记及鉴定该分子标记的引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡肌间脂肪宽度性状遗传改良中，从而提高鸡肌间脂肪宽度，进而改善鸡肉的肉质及风味，降低企业生产成本，提高企业利润，增加核心竞争力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中120只文昌鸡(120日龄)，购自海南省龙泉文昌鸡实业有限公司；
实施例中DNA抽提采用Hipure AS Blood DNA Mini Kits(购自MAGEN公司)，PCR反应中所用的2×Taq Master Mix(Dye Plus)购自Vazyme公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成。
实施例1
(1)肌间脂肪宽度测定：掀开鸡胸部皮肤，用游标卡尺测量胸肌边缘脂肪带中下段、胸骨剑突末端处的宽度。测定数据如表1所示。
表1文昌鸡肌间脂肪宽度测定数据
Figure BDA0001360146500000041
(2)DNA获取：对鸡进行翅下静脉采血，使用DNA抽提试剂盒抽提DNA，操作方法参照说明书。
(3)引物合成：根据NCBI数据库公布的ACVR2B基因的序列(NCBI ReferenceSequence NC_006089.4)为模板，使用primer orimer5.0软件对ACVR2A基因第八内含子设计引物，引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。引物序列如表2所示。ACVR2B基因序列(960bp)如下所示：
TGAACAAGTCCAGCTCCCCCAGCCTGTATTCGTAGGGGAGGTGCTCCAGCCCTATCTGTGCTTAGCAGAGGCATTTGGATTATGCTCTTAGTGGTGTTTTAACTTTGGGTGAGTCCCAAGCAGTCTGAAAGTTGGAGTTGGTAGTCTTTTTAGGTCCCTTTCAATGGGCTATGTATTCATCCCACTTGGAGTGGAATGGGATGAATATATAGGCCTTTCTTTTTTAGCATGTGCTTCTTTTGCTACCTTTTAGAGGGGCCGGGAGGGATACAGAGTTAGCCAGTAGTGTGAAGTCCTACGCAGAGTGCAGGTGAGAAAAAAAACAACTCACTGACCATCCATCTTGTTGTCTGTATCTTATTTTGAGAGTAATTTACCCAGGACTGTTGCTGTCTCCTTGTCCCTCCCAAGGCTGTGCTTTCTCTCCCTCCTTTGCCCTTTTGCCATCCCTGTGCCTTGTTCTTCCCTGGGCTGAGAGAGGGGCAGCTCAACAGGGTTGGAATGCATTCCTCTGGTAGGCAGGGCTTTAGGATGCCTGGAGTTATGTGCCCGAAGTGCAGTGTGAGCTCCTGCAGAGAGCAGGAGCACAGACCTTCACATCACACATGGGTCCTAACCCAGCAGCACAGTGCTGTCCACTTGCATCTTACAGACACCAACAGCGGGGAGCAGCTGGGGAAGGAAGGAAGGAGCAGATCCACCCAGGGCTGCTAGACCTAGAGATTACAGCATGGTGCACTGCACTCTGATTCAGCCTTGTGCCATAATAAACCCTCCTAAACTTGCTTCTTATCTCTCTGTAGGGACTTCAAGAGTAAAAACGTCTTGCTGAAGAACGACTTAACGGCGGTGCTAGCCGATTTTGGTCTTGCTGTACGGTTTGAACCTGGAAAACCTCCAGGGGACACCCATGGACAGGTAATCATTATCTTTCAAAATAGCATTGTAAGAAGTCAGGCC
表2引物信息表
Figure BDA0001360146500000051
(4)PCR反应及测序：反应程序为94℃预变性3min；98℃变性10s，53℃退火30s，72℃延伸50s，38个循环；72℃后延伸5min；4℃保存。反应体系如表3所示，对PCR产物进行质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带符合要求的送上海生工生物科技公司测序。
表3PCR反应体系(50μL)
Figure BDA0001360146500000061
(5)SNP筛查：根据测序结果，比对峰图，找出有突变的碱基位点，进行基因分型。
(6)SNP关联分析：根据分型结果以及对文昌鸡屠体测定的数据，进行SNP与各屠体性状的关联分析。利用SAS 9.2软件进行多态位点与性状的关联分析，统计模型如下：Y＝μ+G+H+F+e；其中Y代表性状表型，μ代表均值，G代表基因型效应，H代表批次效应，F代表家系效应，e代表残差。对不同基因型的个体平均值进行t检验。当P>0.05时表示差异不显著，当P<0.05或P<0.01时表示差异显著或极显著。统计结果如表4所示。
根据表4可知，分子标记的SNP位于ACVR2B基因以第一个碱基为起点的第86033位点的A/T碱基突变，第86034位点的G/C碱基突变，第86035位点的A/T碱基突变，第86036位点的C/G碱基突变，第86037位点的A/T碱基突变，第86046位点的A/T碱基突变与肌间脂肪宽度性状显著相关(P<0.05)，第86156位点的T/C碱基突变与肌间脂肪宽度性状极显著相关(P<0.01)，说明上述分子标记显著影响鸡的肌间脂肪宽度性状，可以通过对鸡的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体肌间脂肪宽度，进而加快育种进程。另外根据表4还可知，第86033位点，第86034位点，第86035位点，第86036位点，第86037位点，第86046位点，第86156位点分别为AA、GC、AA、GG、AA、AT、CC基因型时，比其他基因型的平均肌间脂肪宽度高，说明上述基因型对平均肌间脂肪宽度性状是最有利的。肌间脂肪宽度性状是生长性状的重要指标，因此，我们在进行育种的过程中需要保留第86033位点，第86034位点，第86035位点，第86036位点，第86037位点，第86046位点，第86156位点分别为AA、GC、AA、GG、AA、AT、CC基因型的种鸡，淘汰其他基因型的种鸡。
表4SNP关联结果
Figure BDA0001360146500000071
实施例2
一种选育肉质优良的文昌鸡的方法，包含如下步骤：
(1)采集选育群体内每个个体的血样，抽提DNA；
(2)根据鸡ACVR2B基因(NCBI Reference Sequence NC_006089.4)，合成引物ACVR2B-F和引物ACVR2B-R(表2)；
(3)以DNA为模板，PCR扩增上述SNP所在的序列片段，PCR扩增体系参照表3，PCR扩增程序为94℃预变性3min；98℃变性10s，53℃退火30s，72℃延伸50s，38个循环；72℃后延伸5min；4℃保存；
(4)对PCR产物进行测序，对比测序结果，如果第86033位点，第86034位点，第86035位点，第86036位点，第86037位点，第86046位点，第86156位点分别为AA、GC、AA、GG、AA、AT、CC基因型时，表明被测文昌鸡的肌间脂宽性状具有优势，否则不具有优势；优势个体应当保留，不具优势个体应当淘汰。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记及其应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物ACVR2B-F
<400> 1
ctcactgacc atccatct 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物ACVR2B-R
<400> 2
gacagggaac aaaaacaa 18
<210> 3
<211> 960
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ACVR2B基因序列
<400> 3
tgaacaagtc cagctccccc agcctgtatt cgtaggggag gtgctccagc cctatctgtg 60
cttagcagag gcatttggat tatgctctta gtggtgtttt aactttgggt gagtcccaag 120
cagtctgaaa gttggagttg gtagtctttt taggtccctt tcaatgggct atgtattcat 180
cccacttgga gtggaatggg atgaatatat aggcctttct tttttagcat gtgcttcttt 240
tgctaccttt tagaggggcc gggagggata cagagttagc cagtagtgtg aagtcctacg 300
cagagtgcag gtgagaaaaa aaacaactca ctgaccatcc atcttgttgt ctgtatctta 360
ttttgagagt aatttaccca ggactgttgc tgtctccttg tccctcccaa ggctgtgctt 420
tctctccctc ctttgccctt ttgccatccc tgtgccttgt tcttccctgg gctgagagag 480
gggcagctca acagggttgg aatgcattcc tctggtaggc agggctttag gatgcctgga 540
gttatgtgcc cgaagtgcag tgtgagctcc tgcagagagc aggagcacag accttcacat 600
cacacatggg tcctaaccca gcagcacagt gctgtccact tgcatcttac agacaccaac 660
agcggggagc agctggggaa ggaaggaagg agcagatcca cccagggctg ctagacctag 720
agattacagc atggtgcact gcactctgat tcagccttgt gccataataa accctcctaa 780
acttgcttct tatctctctg tagggacttc aagagtaaaa acgtcttgct gaagaacgac 840
ttaacggcgg tgctagccga ttttggtctt gctgtacggt ttgaacctgg aaaacctcca 900
ggggacaccc atggacaggt aatcattatc tttcaaaata gcattgtaag aagtcaggcc 960

Claims (1)

1.一种用于鉴定鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记的引物在文昌鸡肌间脂肪宽度性状育种中的应用，其特征在于：包括引物ACVR2B-F和引物ACVR2B-R，其核酸序列如下所示：
引物ACVR2B-F：5'-CTCACTGACCATCCATCT-3'；
引物ACVR2B-R：5'-GACAGGGAACAAAAACAA-3'。
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