CN115927657A

CN115927657A - 一种与鸡羽色相关的分子标记、引物及其应用

Info

Publication number: CN115927657A
Application number: CN202211078509.9A
Authority: CN
Inventors: 黄涛; 吴艳; 潘爱銮; 申杰; 张昊; 孙静; 梁振华; 皮劲松; 付明
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-09-05
Filing date: 2022-09-05
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了一种与鸡羽色性状相关的分子标记、引物及其应用，所述分子标记的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列中第139bp处存在C/T多态性位点，所述引物序列如SEQ ID NO.3～4所示；该分子标记和引物用于鸡选育时，能够显著提高育种效率，有效缩短育种周期，且育种准确性高，其成本低廉。

Description

一种与鸡羽色相关的分子标记、引物及其应用

技术领域

本发明属于分子标记辅助选择育种技术领域，具体涉及一种与鸡羽色相关的分子标记、引物及其应用。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphsim，SN P)指基因组DNA序列中单个核苷酸的突变而引起的基因多态性。由于SNP分布的广泛性和稳定性，在动物分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)育种上发挥着重要作用，成为加快畜禽重要经济性状遗传改良的可行性技术。基于此，进一步鉴定与鸡经济性状相关的分子标记，进而借助MAS将大大提高选种效率。

羽色是鸡生产中重要的经济性状，其经济价值在地方鸡中尤为突出，直接影响产蛋后期淘汰鸡的销售价格。地方鸡羽色丰富、主要有黄、黑、白和芦花等，诸多研究表明，鸡羽色由单一基因或数个基因控制，属于质量性状。由于洛岛红、海兰褐等红羽鸡产蛋性能优异，常被用来改良地方鸡品种。在杂交育种中，地方鸡品种的产蛋性能得到提升，但是羽色加深，丧失了地方鸡品种外观特色。鉴于鸡出雏后会发生多次换羽，通过分子技术实现早选有助于加快品种培育进展。

利用全基因组混池重测序技术、分子标记辅助选择技术等，通过红黄羽色相关基因或与之连锁的分子标记进行选择，寻找鸡红黄羽性状基因座相连锁的分子标记，并将其应用于羽色性状的改良，对地方鸡资源开发与新品种培育具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一个可判断鸡红黄羽色的分子标记，通过检测该分子标记的基因型即可准确选育个体羽色，提高育种效率。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明利用江汉鸡和湖北红鸡2个纯系，在解读鸡全基因组数据信息的基础上筛选突变位点，进一步在江汉鸡和湖北红鸡杂交F2代中对SNP进行基因分型，并收集群体羽色L,a和b值，利用关联分析验证SNP与羽色的关联性。基于此，本发明确定了一个与鸡羽色性状相关的分子标记，该分子标记位于APPL1基因的编码区，且其序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示，在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列中第139bp处存在C/T多态性位点。

在上述技术方案中，第139bp处的优势等位基因型为CT。

本发明进一步提供了一种用于扩增上述与鸡羽色性状相关的分子标记的引物对，该引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明提供的与鸡羽色性状相关的分子标记，或如SEQ ID NO.3～4所示的引物对可用于在鸡的选育中。

本发明提供的与鸡羽色性状相关的分子标记还可以用于检测鸡的红黄羽色；检测方法具体可以包括以下步骤：

1)提取鸡基因组DNA作为模板；

2)针对SEQ ID NO.1或SE ID NO.2所示序列的第139位点设计引物，进行PCR扩增；

3)检测待测个体SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的第139位点的基因型。

进一步地，在上述检测方案中，扩增产物能够覆盖SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的第139位点的任何引物均可用于步骤(2)所述PCR扩增；优选使用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物进行步骤(2)中的PCR扩增。

更进一步地，根据引物序列的特征，PCR扩增体系和扩增条件分别如下：

PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，共32个循环；最后15℃结束。

PCR扩增体系为：共15μL，2×FastTaq Premix 7.5μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH₂O余量。

进一步地，在上述检测方案中，若步骤3)所述基因型为CC则鸡呈偏黄羽表型，基因型为TT则鸡呈偏红羽表型，基因型为CT则鸡呈中间型。

本发明的有益效果为：本发明提供了与鸡红黄羽色相关的分子标记，利用该分子标记进行鸡选育时具有如下优势：(1)普遍提高育种效率，有效缩短育种周期；(2)提高育种准确性；(3)实现种质资源的早期获取；(4)分子生物学实验方法简单，实施容易；(5)相比于传统选育方法，其成本低廉。

附图说明

图1为江汉鸡和湖北红鸡APPL1基因中SNP的频率差值分析图；

图2为实施例2中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图3为rs313381871多态性位点在不同基因型个体中的测序结果比较图。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本实施例利用江汉鸡和湖北红鸡两个纯系，并杂交得到F2代(样本均来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验场)，通过红黄羽鸡基因组混池重测序鉴定特异SNP，具体过程为：

(1)鸡基因组DNA的提取，本实施例采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：

①采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入加有抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用；吸取10μL抗凝血，加入500μL BB2和10μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，室温孵育10min；

②短暂离心，将全部的溶液加入离心柱中，12000g离心1min，弃流出液；

③加入500μL溶液CB3，12000g离心30s，弃流出液；

④加入500μL溶液WB3，12000g离心30s，弃流出液；

⑤重复步骤④一次；

⑥12000g离心2min，彻底去除残留的WB3；

⑦将离心柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入50～200μL预热的EB或去离子水，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃下保存备用。

(2)混池重测序与SNP筛选，具体步骤如下：

①将湖北红鸡和江汉鸡DNA分别混池，送往武汉百易汇能生物科技有限公司测序，测序深度至少30×以上；

②下机原始数据经过接头过滤、下载Galgal6参考基因组比对、GATK call SNPs等操作，获得vcf文件；

③计算各SNP位点测序深度/总深度，代表其群体基因频率；筛选两个混池中其差值大于0.95位点，重点筛选基因内突变位点，并对这些位点进行基因注释。

在筛选结果中，发现在12号染色体9017030位置处，即图1中rs313381871，其在湖北红鸡中为CC纯合型，在江汉鸡中为TT纯合型，注释信息显示其位于APPL1基因编码区，属于splice_region_variant。

实施例2

本实施例对鸡APPL1基因克隆，并对rs313381871位点的基因分型进行分析，具体过程如下：

(1)采集湖北红鸡与江汉鸡杂交F2代群体血液并提取鸡基因组DNA，具体操作步骤见实施例1。

(2)根据NCBI数据库公布的APPL1基因序列(登录号Gene ID：XM_004944584.5)设计引物对，该引物对的序列如下：

上游引物：5'-CTGCACCTGTTCAGCAGTCCA-3'(SEQ ID NO.3)，

下游引物：5'-ACTAAGCTAACACCATACTCT-3'(SEQ ID NO.4)。

利用上述引物对在鸡基因组DNA中进行PCR扩增，其中，PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。

表1

表2

将所得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，部分检测结果见图2，图中marker为DL2000。

(3)利用PCR产物直接测序法检测分子标记：

将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用DNAStar软件SeqMan查看峰图，结果如图3所示，发现在该序列中的第139位碱基处(rs313381871)存在一个T/C碱基突变，而且图3结果还显示，距离rs313381871的14个碱基处出现4个碱基长度indel，两变异之间高度连锁。

实施例3

本实施例对rs313381871位点多态性进行检测，在检测F2群体中检测到3种基因型，基因型频率和分布情况如表3所示。

表3

注：基因型频率一栏括号内为该基因型个体数。

由表3可知，rs313381871位点T或C碱基多态性位点表现为TT、TC或CC三种基因型，由频率分布可知，CT基因型为优势基因型。

实施例4

为了确认rs313381871位点与鸡黄红羽色是否相关，本实施例以江汉鸡与湖北红鸡杂交F2代为试验对象，使用CIELab色度系统记录羽色L、a、b值。在每只试验鸡背部选择3个位置，取3次测量值的平均值，采用SPSS18.0软件进行基因型与表型之间的关联分析，所用模型如下：

Y_ij＝u+G_i+P_j+e_ij

其中，Y_ij为性状观察值，u为性状平均值，G_i为基因型效应，P_j为家系固定效应，e_ij为随机误差。

rs313381871不同基因型与F2代羽色关联分析的结果如表4所示。

表4

注：上表中相同上表字母表示差异不显著，字母a、b、c表示差异显著。

由表4可以看出，rs313381871位点多态性与L和b值具有显著相关性(P<0.01，P<0.02)；L和b值分别代表羽色的亮度和红度，在生产实际中，我们可以发现F2群体中，L和b值相对较大的个体，羽色表现为偏深红羽色，L和b值相对较小的个体，羽色表现为偏浅黄羽色。rs313381871位点T碱基偏向红羽表型，而C碱基偏向黄羽表型。故本发明的rs313381871突变位点可作为鉴别红黄羽的潜在分子标记。

综上所述，本发明提供的分子标记与鸡红黄羽色紧密相关，通过检测该分子标记的基因型即可准确选育个体羽色，而且本发明进一步提供了用于特异扩增的引物对，并构建了检测方法，为该分子标记的进一步育种应用奠定了基础。

以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种与鸡羽色性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示，在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列中第139bp处存在C/T多态性位点。

2.根据权利要求1所述鸡羽色性状相关的分子标记，其特征在于，所述第139bp处的优势等位基因型为CT。

3.一种用于扩增权利要求1所述与鸡羽色性状相关的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO.3～4所示。

4.如权利要求1所述的与鸡羽色性状相关的分子标记，或如权利要求3所述引物对在鸡育种中的应用。

5.如权利要求1所述的与鸡羽色性状相关的分子标记在鸡红黄羽色检测中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取鸡基因组DNA作为模板；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)所述引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，共32个循环；最后15℃结束。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：共15μL，2×FastTaq Premix 7.5μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH₂O余量。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3)所述基因型为CC则鸡呈偏黄羽表型，基因型为TT则鸡呈偏红羽表型，基因型为CT则鸡呈中间型。