CN104342490B - 一种检测鸡胡须性状的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测鸡胡须性状的方法,涉及分子生物学领域,在胡须鸡27号染色体发现存在三个DNA片段的拷贝数变异,物理位置分别为1702269‑1721521bp、4470331‑4503417bp、3578409‑3592890bp,确定了3个分子标记,针对该分子标记设计了3对引物,用PCR方法对待测鸡基因组的上述3个分子标记进行检测,若三个PCR扩增反应的目的片段分别为3200bp、501bp、411bp,则检测结果为阳性,否则为阴性。本发明提供的方法操作简单,灵敏度高,准确性强,检测成本低,可快速检测含有胡须性状的个体,在鸡的保种、育种过程中具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,具体涉及用于鸡胡须性状的分子标记、以及检测胡须性状的方法。
背景技术
长期的进化和驯化选择,丰富了农业动物遗传资源的多样性。近年来的研究发现,基因组结构变异是畜禽驯化过程中多个重要性状的遗传基础,如鸡20号染色体上发生的复杂结构重排,会使EDN3基因的表达产生变化,最终导致黑色素在真皮内的沉积;位于鸡1号染色体的SOX5基因内含子1内3.2kb区域的复制,使得在发育的6-12天内SOX5基因表达发生改变,导致豆冠表型的产生。基因组结构变异可以通过多种机制影响基因表达,对结构变异进行研究,有助于我们解析相关性状形成的机制。
基因组结构变异包括缺失、重复、倒位、易位四种类型。目前针对基因组结构变异的检测技术主要有基于高密度SNP的基因分型芯片、比较基因组杂交芯片,以及高通量测序技术等。随着高通量测序技术的不断发展,成本的不断降低,测序已经成为目前生物学研究的重要手段。通过对结构变异靶区域的重测序分析,分离出结构变异造成的断点和重排情况,进而利用PCR等常规分子生物学技术对结构变异进行检测。检测只需在结构变异产生的断点两侧设计扩增引物,利用简单的PCR反应,通过琼脂糖凝胶检测就可以检测结构变异的存在。
鸡的胡须性状是家畜中最早进行研究的表型性状之一,经历了上百年的历史,至今仍未见报道影响胡须性状的确定染色体位置和检测方法。如果利用传统方法对鸡的胡须形状进行选育,将耗费大量的人力、物力、财力。利用分子生物学的手段建立一种快速检测胡须性状的方法,进行标记辅助选择,将有助于提高育种效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别鸡胡须性状性状的方法。
本发明以中国农业大学与广东省农业科学院畜牧研究所合作建立的以惠阳胡须鸡与岭南黄鸡A03系为亲本的F2杂交资源群体为研究对象,记录了F0、F1和F2代个体的胡须性状,利用全基因组SNP进行连锁分析,将影响鸡胡须性状的基因座定位于鸡27号染色体;对F0样本的进行重测序分析,分离得到了影响鸡胡须性状的结构变异。本发明发现,胡须鸡27号染色体存在三个DNA片段的重复(拷贝数变异,CNV),在鸡ICGSC Gallus_gallus-4.0版本基因组中的物理位置分别为1702269-1721521bp(CNV1)、4470331-4503417bp(CNV2)、3578409-3592890bp(CNV3),三个片段顺利连接并插入到CNV1原座位,其位置关系如图1所示。本发明鉴别鸡胡须性状的方法,是针对不同CNV片段间的连接设计引物进行PCR检测,根据检测结果判定鸡是否存在胡须基因。
本发明首先提供一种用于检测鸡胡须性状的分子标记组合,其为CNV1、CNV2和CNV3,这三个分子标记物理位置位于鸡27号染色体1702269-1721521bp、4470331-4503417bp、3578409-3592890bp处,CNV1和CNV2连接的基因序列如SEQ ID No.7所示,CNV2和CNV3连接的基因序列如SEQ ID No.8所示,CNV3和CNV1连接的基因序列如SEQ ID No.9所示。
本发明提供了用于检测上述分子标记组合的引物组合,是针对上述不同CNV片段间的连接设计引物,其核苷酸序列为:
CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT
CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT
CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG
CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA
CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC
CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC。
本发明提供了一种检测鸡胡须性状的试剂盒,含有针对上述三个分子标记分别设计的3对引物。
本发明方法包括以下步骤:
(1)以待测鸡的基因组DNA为模板,用三对引物分别进行PCR反应;所述三对引物分别是:
CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT
CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT
CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG
CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA
CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC
CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC;
(2)将三次PCR反应的扩增产物用琼脂糖凝胶检测,若CNV1、CNV2、CNV3引物的PCR扩增反应的目的片段分别为3200bp、501bp、411bp,则结果为阳性,否则为阴性。
本发明方法中,步骤(1)中引物CNV3-1F、R和CNV2-3F、R的PCR扩增反应体系为:
总体系为25μl时,基因组DNA:50ng,1×PCR Buffer,dNTP4mM,上、下游引物各10pmol,康为Taq DNA聚合酶1.25U,加水补至25μl反应体系;
引物CNV1-2F、R的PCR扩增反应体系为:基因组DNA:50ng,1×PCR Buffer,dNTP4mM,上、下游引物各10pmol,Long AmpTaq DNA聚合酶NEB1.25U,加水补至25μl反应体系。。
本发明方法中,步骤(1)中引物CNV3-1F、R及CNV2-3F、R的PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性30sec,60℃退火30sec,72℃延伸20sec,共35个循环;72℃终延伸7min;12℃保存;
引物CNV1-2F、R的PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃变性10sec,57℃退火30sec,65℃延伸4sec,共35个循环;65℃终延伸7min;12℃保存。
本发明提供了上述方法、分子标记组合在鸡育种中的应用。
本发明还提供了上述引物组合在检测鸡胡须性状或制备检测鸡胡须性状试剂盒中的应用。
本发明首次提供了用于鉴别胡须性状的3个分子标记;利用该分子标记设计特异性引物,共3对引物,分别对待测鸡基因组DNA进行PCF检测,根据检测结果判断待测鸡只是否具有胡须性状。本发明方法可以实现对鸡胡须性状个体的快速筛选,加快胡须性状鸡的选育,从而大大地提高育种和保种效率;本发明的检测方法操作简单,费用低廉,准确度高。
附图说明
图1为本发明提供的重测序胡须鸡与岭南黄鸡A03测序深度比值的对数值(Log2Ratio),横坐标为鸡27号染色体的物理图谱序列位置。具有胡须性状鸡的27号染色上存在的三个CNV,其中CNV1的区间为chr27:1702269-1721521bp;CNV2的区间为chr27:4470331-4503417bp;CNV3的区间为chr27:3578409-3592890bp。CNV1、CNV2、CNV3在发生复制后插入CNV1所在原始位置的下游,其连接方式如图所示。
图2为本发明提供的引物CNV1-2F、R扩增后琼脂糖凝胶检测的结果。目的片段大小为3.2kb,marker为1kb的marker。其中泳道13-24为北京油鸡(有胡须),能够扩出条带;泳道1-12为岭南黄鸡A03系(无胡须),不能够扩出条带。
图3为本发明提供的引物CNV2-3F、R扩增后琼脂糖凝胶检测的结果。目的片段大小为501bp,marker为100bp的marker。其中泳道13-24为北京油鸡(有胡须),能够扩出条带;泳道1-12为岭南黄鸡A03系(无胡须),不能够扩出条带。
图4为本发明提供的引物CNV3-1F、R扩增后琼脂糖凝胶检测的结果。目的片段大小为411bp,marker为100bp的marker。其中泳道13-24为北京油鸡(有胡须),能够扩出条带;泳道1-12为岭南黄鸡A03系(无胡须),不能够扩出条带。
图5为鸡胡须性状全基因组关联研究的曼哈顿图,图5a显示仅27号染色体的标记达到基因组水平显著(横坐标为不同的染色体编号,纵坐标为P值的10为底对数值),图5b显示了27号染色体上标记的关联信号(横坐标为27号染色体的物理位置,纵坐标为P值的10为底对数值),虚线为bonferroni校正的5%基因组水平显著。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1鸡27号染色体三个拷贝数变异区间的确定
1、胡须性状的QTL定位
本发明以中国农业大学与广东省农业科学院畜牧研究所合作建立的以惠阳胡须鸡与岭南黄鸡A03系为亲本的F2杂交资源群体为研究对象,记录了F0、F1和F2代个体的胡须性状,利用Illumina的鸡60K SNP芯片进行基因分型,通过数据质控(样本检出率>90%,SNP检出率>90%,最小等位基因频率>0.05,遗传错误率<0.05),获得了588个个体的平均约42K的全基因组SNP标记信息,利用GenABEL软件混合回归模型分析,bonferroni校正达到5%基因组水平显著的SNP(P<1.19E-6)全部位于鸡27号染色体(如图5a、图5b所示),但关联信号的区间较大。
利用CRI-MAP软件构建了27号染色体的连锁图谱,通过遗传分离分析,及区间内重组子的重测序分析,确定了影响鸡胡须性状的22Kb的最小单倍型(1.70~1.72Mb)。
2、拷贝数变异与胡须性状
本发明以自定制了Agilent2X400K的比较基因组杂交(CGH)芯片,以德宏鸡基因组作为参照,分析了14个品种鸡(仅胡须鸡有胡须表型)的全基因组拷贝数变异信息,将包含连续5个探针的CNV确定为可信的CNV区域,由此检测到3个胡须鸡品种特异CNV区域(见表,CNVR1、CNVR2和CNVR4)。CNVR1与胡须性状的单倍型完全重合,推测拷贝数变异可能是胡须表型的致因突变。
表1胡须鸡品种特异的CNV信息
对资源家系的F0样本进行全基因组DNA重测序,采用测序深度(read depth)分析方法研究基因组结构变异,如图1所示。27号染色体以胡须鸡与岭南黄鸡A03系测序深度的比值的2为底对数(log2ratio)作图,在1.7、3.5、4.4Mb区间的log2ratio达到1,说明两者测序深度比值为2,均为多拷贝的结构变异,即正常基因组为2个单倍型,胡须鸡有4个单倍型。CNVR1和CNVR2与CGH结果吻合,CNVR3由于片段较小,所以没有在最初的统计中。
通过部分比对的read信息(partially-mapped read),确定3个结构变异的断点(Breakpoint)分别为1702269-1721521bp(CNVR1)、4470331-4503417bp(CNVR2)和3578409-3592890bp(CNVR3)。CNV1和CNV2连接处基因序列、CNV2和CNV3连接处基因序列、CNV3和CNV1连接处基因序列分别如SEQ ID No.7-8、9所示。同时,这三个CNV的新拷贝片段并非独立,而是顺序连接并插入到CNVR1原座位,其位置关系如图1所示。
实施例2针对三个CNV分子标记的引物的设计
本发明针对实施例1确定的不同CNV片段间的连接,1702269-1721521bp(CNV1)、4470331-4503417bp(CNV2)、3578409-3592890bp(CNV3),设计引物用于PCR检测。引物序列分别见表1。
表2三对引物的核苷酸序列
实施例3检测鸡胡须性状方法的建立
1、试验材料
用于检测的北京油鸡来自于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所;象洞鸡来自于福建省龙岩市武平象洞鸡保种场;惠阳胡须鸡与岭南黄鸡A03系杂交资源群体来源于广东省农业科学院畜牧研究所;其他品种均来自中国农业科学院江苏省家禽研究所。
2、基因组DNA的提取
鸡翅静脉采血,抗凝处理后裂解,经蛋白酶K过夜消化后,用酚仿抽提,TE溶解-20℃保存。
3PCR扩增
用实施例2的三对引物,分别对样品基因组进PCR反应。
引物CNV3-1F、R及CNV2-3F、R PCR扩增的反应体系为:基因组DNA:50ng,1×PCRBuffer,dNTP4mM,正向引物10pmol,反向引物10pmol,康为Taq DNA聚合酶1.25U,加水补至25ul反应体系。引物CNV1-2F、R PCR扩增的反应体系为:基因组DNA:50ng,1×PCR Buffer,dNTP4mM,正向引物10pmol,反向引物10pmol,Long AmpTaq DNA聚合酶(NEB)1.25U,加水补至25ul反应体系。
引物CNV3-1F、R及CNV2-3F、R PCR反应条件为:94℃预变性5min;35个循环过程条件为94℃变性30sec,60℃退火30sec,72℃延伸20sec;72℃终延伸7min;12℃保存。引物CNV1-2F、R PCR反应条件为:94℃预变性3min;35个循环过程条件为94℃变性10sec,57℃退火30sec,65℃延伸4sec;65℃终延伸7min;12℃保存。对扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行检测。扩增结果分别见图2、3、4。
4、结果分析
凡是具有胡须性状的个体,用本发明的三对引物扩增都能够扩出目的条带。凡是没有胡须性状的个体都不能扩出目的条带。在所检测的524个个体中,鉴定为胡须个体的有248个,鉴定为非胡须个体的有276个。结果如表3所示。
表3胡须性状检测结果
品种 | 个体数 | 胡须 | 非胡须 |
岭南黄鸡A03系 | 18 | - | 18 |
惠阳胡须鸡 | 18 | 18 | - |
胡须、A03家系F1 | 36 | 36 | - |
胡须、A03家系F2 | 89 | 62 | 27 |
胡须、A03家系F5 | 189 | 95 | 94 |
文昌鸡 | 6 | - | 6 |
清远麻鸡 | 6 | - | 6 |
北京油鸡 | 23 | 11 | 12 |
象洞鸡 | 20 | 20 | - |
白耳黄鸡 | 6 | - | 6 |
瓦灰鸡 | 6 | - | 6 |
茶花鸡 | 6 | - | 6 |
河南斗鸡 | 6 | - | 6 |
崇仁麻鸡 | 6 | - | 6 |
狼山鸡 | 6 | - | 6 |
边鸡 | 6 | - | 6 |
鹿苑鸡 | 6 | - | 6 |
藏鸡 | 6 | - | 6 |
固始鸡 | 6 | - | 6 |
大骨鸡 | 6 | - | 6 |
尤溪麻鸡 | 6 | - | 6 |
安卡鸡 | 6 | - | 6 |
隐性白鸡 | 6 | - | 6 |
寿光鸡 | 6 | - | 6 |
石岐杂鸡 | 6 | - | 6 |
矮脚黄鸡 | 6 | - | 6 |
红色原鸡 | 6 | - | 6 |
瓢鸡鸡 | 5 | - | 5 |
共计 | 518 | 242 | 276 |
上述524个个体的鉴定结果表明鸡胡须性状与27号染色体上存在的三个CNV完全关联,因此可以通过判定27号染色体上的结构变异事件来确定胡须性状有无。这种确定胡须性状的检测方法用于育种实践,克服了传统育种方法费时、费力的问题,可以加快选育具有胡须表型的鸡种。
原则上,利用其中本发明三对引物中的任何一对引物既可以做出胡须性状的判断,但保证不了这种结果的可靠性,所以本发明要求以三对引物分别进行扩增,综合三次PCR检测的结果来判断待测鸡种是否具有胡须性状,以保证判断结果的正确性。
上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以对相应的条件等做一些改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于检测鸡胡须性状的分子标记组合,其特征在于,其为CNV1、CNV2和CNV3,这三个分子标记物理位置位于鸡ICGSC Gallus_gallus-4.0版本基因组中鸡27号染色体1702269-1721521bp、4470331-4503417bp、3578409-3592890bp处,CNV1和CNV2连接的基因序列如SEQ ID No.7所示,CNV2和CNV3连接的基因序列如SEQ ID No.8所示,CNV3和CNV1连接的基因序列如SEQ ID No.9所示。
2.权利要求1所述的分子标记组合在鸡育种中的应用。
3.一种用于检测鸡胡须性状的引物组合,其特征在于,其核苷酸序列为:
4.权利要求3所述的引物组合在制备检测鸡胡须性状试剂盒中的应用。
5.权利要求3所述的引物组合在鸡育种中的应用。
6.一种检测鸡胡须性状的试剂盒,其特征在于,含有权利要求3所述的引物组合。
7.一种检测鸡胡须性状的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)以待测鸡的基因组DNA为模板,用三对引物分别进行PCR反应;所述三对引物分别是:
(2)将三次PCR反应的扩增产物用琼脂糖凝胶检测,若CNV1、CNV2、CNV3引物的PCR扩增反应的目的片段分别为3200bp、501bp、411bp,则结果为阳性,即鸡有胡须,否则为阴性,即鸡无胡须。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(1)中引物CNV3-1F、CNV3-1R及CNV2-3F、CNV2-3R的PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性30sec,60℃退火30sec,72℃延伸20sec,共35个循环;72℃终延伸7min;12℃保存;
引物CNV1-2F、CNV1-2R的PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃变性10sec,57℃退火30sec,65℃延伸4sec,共35个循环;65℃终延伸7min;12℃保存。
9.权利要求7-8任一所述的方法在鸡育种中的应用。
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CN102154266A (zh) * | 2010-09-16 | 2011-08-17 | 华南农业大学 | 一种与鸡耐热性相关的分子标记及其鉴定方法和应用 |
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Patent Citations (1)
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