CN102352410B - 一种用dna标记快速提高边鸡产蛋数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种用DNA分子标记筛选边鸡产蛋数的方法。所述方法是：提取待测样本的鸡基因组DNA，经特异性引物扩增得到MSTN基因目的片段，目的片段经限制性内切酶BbvI酶切，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的酶切图谱，根据图谱中条带的数量和大小对待测样本产蛋数进行判断。本发明选择的检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于边鸡产蛋数的分子遗传标记，进行标记辅助选择。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种用DNA标记快速提高边鸡产蛋数的方法。
背景技术
传统的数量遗传学对数量性状遗传机制的理解建立在抽象的微效多基因假设基础上，将影响一个数量性状的所有基因当作一个整体来处理，而不考虑其中的各个基因是如何作用的。这一假说在多年的动植物育种中发挥了重要作用，推动了动植物育种工作的进展，在当时的理论和技术条件下不失为一个很好的基础。但这一假说不了解数量性状的遗传背景，不了解控制数量性状的基因在染色体上的位置及其传递规律，无法对其效应作出准确的估计，更不能从分子水平分离和定位该类基因。随着现代分子生物学技术的飞速发展，遗传学家和育种学家认识到控制数量性状的基因并非在基因组中随机分布，且存在影响数量性状的主效基因。
目前，在育种中对鸡产蛋数的筛选方法主要是通过数量遗传学方法，而数量遗传学方法进展缓慢，寻找到合适的DNA标记用于辅助选择能增强选择的准确性、缩短世代间隔，加快遗传进展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用DNA标记快速提高边鸡产蛋数的方法，该方法利用鸡BbvI酶切图谱对边鸡产蛋数进行标记辅助选择，不受环境影响。
本发明的原理是：DNA池测序发现边鸡MSTN基因外显子1的234bp处存在一个G→A突变，DNAMAN 5.22软件分析表明该位点为BbvI识别位点。针对该酶切位点设计特异性引物扩增边鸡基因组DNA，引物的扩增产物经BbvI酶切产生3种基因型（GG、GA 和AA）。该单核苷酸突变能稳定遗传，选择的检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于边鸡产蛋数选择的分子遗传标记，进行标记辅助选择。
本发明所说的方法是：提取待测样本的鸡基因组DNA，经特异性引物（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）扩增得到162bp的目的片段，目的片段经限制性内切酶BbvI酶切，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的酶切图谱，根据图谱中条带的数量和大小对待测样本产蛋数的多少进行判断。
所述根据图谱中条带的数量和大小对待测样本产蛋数的多少进行判断的方法是：仅有162bp条带的为产蛋数的多的纯合型样本，仅有127bp条带的为产蛋数的少的纯合型样本；同时含有162bp和127bp条带的为产蛋数的多的杂合型样本。
本发明是提供了边鸡MSTN基因在边鸡育种筛选中作为产蛋数选择的分子遗传标记的应用。
所述分子遗传标记在应用于育种筛选时，选择MSTN基因中不含BbvI酶切位点的个体，即产蛋数多的纯合型样本（AA型）。
附图说明
图1是PCR产物图，Marker为GM331。（1-8泳道为8个不同边鸡个体的PCR产物）
图2是BbvI酶切产物图，Marker为GM331。
具体实施方式
实施例1
1. 试验材料
118只一世代的边鸡母鸡血样采自山西省农科院畜牧兽医研究所。采取的边鸡群体来自同一批次，单笼饲养，管理和营养水平一致。用肝素钠作为抗凝剂，从翅静脉采集血样0.5 mL，采用常规苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，测定DNA的浓度后备用。
2. 引物设计和PCR扩增
2.1 酶切引物的设计
根据GenBank中鸡MSTN基因序列（GenBank登录号为AF346599）针对外显子1的BbvI位点设计1对引物，扩增产物大小为162 bp。引物序列如下：
P1：F: 5’-GCATTAGCAGGGACGTTAT-3’;（SEQ ID NO：1）
R:5’-ACTCCGTAGGCATTGTGAT-3’ （SEQ ID NO：2）
2.2 PCR扩增
PCR扩增反应为25 μL体系，包括：上、下游引物（10 μmol/L）2 μL；dNTPs（2 mmol/L）2.5 μL；Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL；DNA模板（50 ng/μL）2 μL；Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL；10×PCR缓冲液2.5 μL；超纯水14.3 μL。PCR扩增反应程序：94℃变性6 min；94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min；10℃保存。
PCR反应完成后，用交联度为（Acr:Bis）39:1的10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果（图1），硝酸银染色，UV凝胶成像系统进行凝胶成像。
2.3 PCR-RFLP检测
PCR产物用BbvI酶切，以检测多态性。酶切反应总体积为20 μL，超纯水 16.5 μL，BbvI酶(10 u/μL) 0.5 μL，10×buffer 2 μL，37°C酶切2 h，酶切产物用交联度为（Acr:Bis）29:1的10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，200V电泳5 h，硝酸银染色。酶切图谱如图2所示，显示3种基因型，仅有162bp目的片段的样本不含BbvI酶切位点，命名为AA型；仅有127bp的为含有BbvI酶切位点的纯合型，命名为GG型；同时含有162bp和127bp的为含有BbvI酶切位点的杂合型样本，命名为GA型。GG和AA相比在外显子1编码区的234 bp（C.234 bp）处有一个G→A的突变。当C.234 bp处为G时，BbvI酶切产生127 bp和35 bp的片段；当C.234 bp处为A时，无BbvI酶切位点。在凝胶检测时，有酶切位点的样本产生的35bp的片段由于长度太小，跑出了凝胶，所以在凝胶中未显示出条带。根据酶切图谱中条带的数量和大小辨别引物的扩增产物中是否有BbvI酶切位点。
2.4 MSTN基因BbvI位点不同基因型与边鸡繁殖性状的关联分析
运用下列模型比较边鸡繁殖性状在MSTN各基因型之间的差异：yijk = μ+ Gi +Sj+ e模型中：yijk为性状的测定值；μ为群体平均值；Gi为基因型效应；Sj为家系效应；e为随机残差。不同基因型对边鸡母鸡繁殖性状的关联分析见表1。由表可见，GG基因型个体的开产日龄极显著的高于GA和AA基因型个体（P<0.01）；AA基因型个体的300日龄产蛋数极显著的高于GG基因型个体（P<0.01），GA基因型个体的300日龄产蛋数显著的高于GG基因型个体（P<0.01）。在育种筛选中只选择AA型（即不含BbvI酶切位点的MSTN基因）可以在群体中固定该基因型。所以PCR产物能否被BbvI酶切开可作为筛选边鸡产蛋数的方法。
表1 不同基因型对边鸡母鸡繁殖性状的关联分析
| 基因型 | GG (45) | GA (51) | AA (22) |
| 开产日龄（天） | 173.93±2.02A | 166.13±1.86B | 161.85±2.60B |
| 开产蛋重（克） | 39.99±0.80 | 40.42±0.74 | 38.88±1.03 |
| 300日龄产蛋数（个） | 92.11±2.96Bb | 100.07±2.73ABa | 101.94±3.81Aa |
| 300日龄蛋重（克） | 51.74±0.95 | 53.07±0.88 | 52.60±1.23 |
注: 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著( P<0.05) , 肩标不同大写字母表示极显著（P<0.01 )。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 一种用DNA标记快速提高边鸡产蛋数的方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcattagcag ggacgttat 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actccgtagg cattgtgat 19
Claims (2)
1.边鸡MSTN基因在边鸡育种筛选中作为产蛋数选择的分子遗传标记的应用，是提取待测样本的鸡基因组DNA，经SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异性引物扩增得到162bp目的片段，目的片段经限制性内切酶BbvI酶切，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的酶切图谱，选择仅有162bp条带的样本，即产蛋数多的纯合型样本。
2.一种用DNA标记快速提高边鸡产蛋数的方法，其特征在于：提取待测样本的鸡基因组DNA，经SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异性引物扩增得到162bp目的片段，目的片段经限制性内切酶BbvI酶切，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的酶切图谱，根据图谱中条带的数量和大小对待测样本产蛋数的多少进行判断，判断方法为：仅有162bp条带的为产蛋数多的纯合型样本，仅有127bp条带的为产蛋数的少的纯合型样本；同时含有162bp和127bp条带的为产蛋数多的杂合型样本。
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