CN104342489B - 一种检测鸡胡须基因型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测鸡胡须基因型的方法，涉及分子生物学领域，本发明方法基于焦磷酸测序技术，采用一对引物和一条测序引物，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、2、3所示，对鸡27号染色体1707859bp位点的单核苷酸多态性进行分析，结果发现鸡胡须基因型显性纯合子T碱基、C碱基峰高相同，各占一半；杂合子T碱基峰高大于C碱基，T:C=2:1；隐性纯合子只有T碱基的峰，无C碱基的峰。本发明提供的方法操作简单，灵敏度高，准确性强，通量高，检测成本低，可快速检测纯合基因型的胡须个体，在鸡的保种、育种过程中具有重要应用价值。

Description

一种检测鸡胡须基因型的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于鸡胡须基因型检测的SNP分子标记、以及检测胡须基因型的方法。

背景技术

单核苷酸多态性标记（SNP），主要是指基因组上由单个核苷酸突变所引起的DNA序列多态性。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型是近些年兴起的一种方法。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。

已有多种方法可用于SNP检测，目前比较常用的有基因芯片方法、DNA测序法、质谱法、以及TaqMan荧光定量方法等。不同方法根据所依据的原理不同适用于不同的研究。芯片和质谱技术适用于大规模的多态信息检测。而测序和Taqman技术适用于高精度、高准确性的判定SNP多态信息。在多种测序技术中，焦磷酸测序是一种基于酶级联反应的新型DNA测序技术。是目前少数能够得到定量序列结果的技术之一，其准确度高，重复性好，广泛用于多种遗传多态性分析。

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucle—otidepotymorphisms，SNPs)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。该技术进行改进后可以满足上百个核苷酸序列的测序工作，这样该技术又可以满足对重要微生物的鉴定与分型，特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。在每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP,在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。焦磷酸测序技术可以用来研究单核苷酸多态性(single ucleotidepolymor—phism，SNP)，遗传多态性，植物多态性分析，分子诊断细菌与病毒分型、甲基化分析、法医鉴定及药物基因组学等方面都有广泛的应用。该技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。

鸟类的羽毛在形态和颜色方面都呈现出广泛的多样性，羽毛的演化和发育模型一直是进化、发育生物学研究的热点。分离控制羽毛类型的基因，对阐明羽毛发育机制具有重要意义。目前已经明确定位的羽毛性状包括丝羽、缨头、裸颈、翻毛、无毛等。胡须是在鸡颔下部位呈放射状分布的髯羽，通过杂交试验已经确定胡须是一种显性遗传性状。传统的表型鉴定方法需要很长的时间才能将显性性状的基因纯化。而目前用于鉴定胡须性状基因型的分子标记方法还未见报道，因此确定胡须性状的基因型对于加快具有胡须性状鸡的选种、提高育种效率具有非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测鸡胡须基因型的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案首先提供一种用于检测鸡胡须基因型的SNP分子标记，其位于鸡27号染色体1707859bp处。所述鸡27号染色体基因序列根据鸡第四版本序列信息ICGSCGallus_gallus-4.0/galGal4。

本发明提供了用于检测鸡胡须基因型SNP分子标记的引物，其核苷酸序列为：

上游引物：5’-TCTGCCCCTGTTCTGTACCAT-3’，（SEQ ID No.1）

下游引物：5’-AGCTGCGTGGGCTGAAAC-3’（SEQ ID No.2）。

优选地，在下游引物5’端标记生物素。

本发明还提供了与上述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为：5’-ACCCAACAGCCTCCC-3’（SEQ ID No.3）。

本发明提供一种检测鸡胡须基因型的方法，是利用焦磷酸测序法对鸡27号染色体1707859bp位点的核苷酸进行SNP检测。

进一步地，上述方法包括以下步骤：

（1）提取待测鸡的基因组DNA，以其为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物为扩增引物，进行PCR反应；

（2）以步骤（1）的扩增产物为模板，以SEQ ID No.3所示的探针为测序引物进行焦磷酸测序，当鸡27号染色体1707859bp位点T碱基、C碱基峰高相同，各占一半时，则为鸡胡须基因显性纯合子；当T碱基峰高大于C碱基，T:C=2:1，则为鸡胡须基因杂合子；当只有T碱基的峰，无C碱基的峰时，则鸡胡须基因隐性纯合子。

其中，步骤（1）中PCR扩增的反应体系为：总体系为25μl时，含有基因组DNA：50ng，1×PCR Buffer，dNTP3mM，上下游引物各10pmol，LongAmp Taq DNA聚合酶1.25U，加水补至25μl反应体系。

其中，步骤（1）中PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10sec，60℃退火30sec，65℃延伸20sec，35个循环；65℃终延伸10min；12℃保存。

本发明还提供一种检测鸡胡须基因型的试剂盒，含有一对引物和一个探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、2、3所示。

本发明提供了上述SNP分子标记在鸡育种中的应用。

本发明提供了上述试剂盒在鸡育种中的应用。

本发明提供的一种检测鸡胡须基因型的方法，SNP分子标记，引物对和探针或试剂盒可应用于选育具有胡须性状品种的鸡。

本发明首次提供了用于鉴别胡须基因型的多态位点；利用该多态位点设计特异性引物和探针，进行焦磷酸测序，根据T/G峰值判断鸡胡须基因的基因型可实现对鸡群体中胡须性状个体的快速检测，从而大大地提高育种和保种效率；本发明的检测方法操作简单，费用低廉，准确度高。

附图说明

图1为本发明焦磷酸测序检测HH基因型序列峰值图，其中27号染色体1707859bp位点T碱基和C碱基峰高相同。

图2为本发明焦磷酸测序检测Hh基因型序列峰值图，其中27号染色体1707859bp位点T碱基峰高为C碱基的两倍。

图3为本发明焦磷酸测序检测hh基因型序列峰值图，其中27号染色体1707859bp位点只有T碱基峰，无C碱基峰。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1多态位点的确定以及焦磷酸测序方法的建立

1、多态位点的确定

为了分析鸡胡须基因型的情况，本发明提供了检测胡须基因型的SNP位点。该SNP位点的识别是通过对三个品种7只胡须型个体（HH）、16只（种）野生型个体（hh）27号染色体胡须鸡特异的三个CNV的原始和新产生的拷贝进行测序分析。测序结果共找到2099个SNP位点，其中只有1707859bp这个SNP位点在所有胡须个体CNV1的新产生拷贝中基因型都是CC，原始拷贝中都是TT。胡须鸡（HH）和岭南黄鸡A03系（hh）重测序的结果也支持了这个结果，在胡须鸡(HH)中该点是CT杂合而且C:T=1:1，A03鸡中(hh)该点为TT。从9个品种的中国地方鸡种重测序数据中观察到，该点除了德红原鸡、瓦灰鸡、金湖乌凤鸡有非常低的C（depth T:C分别为93:3、63:3、75:1）覆盖之外，其他7种全都是TT基因型。比较其他已知基因型的9个个体测序的结果发现，该点在所有的杂合子中都是CT基因型且T的峰高大于C。因为HH个体原始和新产生的拷贝数相等，所以C:T=1:1；而hh个体只含有原始拷贝，所以其在该位点只具有T碱基；Hh个体具有一个新产生的拷贝和两个原始拷贝，所以T:C=2（T＞C）。可以根据这一位点的多态信息判断胡须个体基因型情况。

2、试验材料

胡须鸡、岭南黄鸡A03资源家系：由中国农业大学李宁教授课题组与广东省农业科学院畜牧研究所共同建立，用于定位影响鸡重要经济性状的功能基因的实验群体。家系采用远交群体的F2设计，从F2代以后一直采取随机交配的方式进行传代，目前此家系已经传递到F7代。本发明从胡须、A03家系中挑选F7代中的73个个体用于基因型检测。

3、基因组DNA的提取

鸡翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K过夜消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20℃保存。

4、PCR扩增

PCR反应扩增的体系：25ul反应体系中含有待分析的基因组DNA50ng，1×PCR Buffer，dNTP3mM，LongAmp Taq DNA聚合酶（NEB）1.25U，上、下游引物各10pmol，加水补至25μl反应体系。

本实施例设计的用于扩增鸡胡须基因型的SNP分子标记的上、下游引物其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、2所示，其中下游引物5’端标记生物素，

PCR反应条件：第一步：94℃3min；第二步：94℃10sec，60℃30sec，65℃，20sec，35个循环；第三步：65℃10min。4℃保存。取7μl的PCR产物用2%琼脂糖凝胶检测。

5、基因型检测

应用PyroMark ID定量遗传分析系统，以步骤3的PCR扩增产物为模板，以测序引物:5’-ACCCAACAGCCTCCC-3’（SEQ ID No.3）为探针，对27号染色体上1707859bp位点进行进行基因型分析。操作过程如下。

准备微珠预混液：微珠2μl，Binding Buffer38μl，水20μl。分别加到PCR反应管中震荡20min。

在测序反应板的每个孔中加入Anneal Buffer12μl，测序引物（10pmol）1μl。

探头吸附微珠预混液（保证此步骤在三分钟内完成）。然后将探头依次经过70%乙醇，Degeneration buffer，Wash buffer洗涤；将探头对准测序反应板，关闭真空泵，停留3sec后，探头置入反应板，轻轻晃动探头，将获得的PCR产物变为单链DNA模板；然后将含有单链模板的反应板转入80℃烘箱，停留2min后取出，降至室温后放入PyroMark仪器中。根据软件说明设定程序，查看试剂用量，在反应仓的相应位置加入所需试剂。点击软件中的Run选项，开始测序。

6、结果分析

如图3所示，基因型为hh的个体chr27：1707859bp位点只有T碱基峰，不存在C碱基峰。HH、Hh基因型个体根据卡方检验实际测得的C、T碱基信号值所符合的比例来确定。设定两个假设，一是C:T=1:1，二是C:T=1:2，比较真实值A与理论值T之间的差异，计算卡方值∑χ2=（A-T）2/T，显著水平设定为0.05，根据卡方检验结果，确定C、T碱基信号的比值。如图1所示，基因型为HH个体chr27：1707859bp位点C:T符合1:1；如图2所示，基因型为Hh个体chr27：1707859bp位点C:T符合1:2。

在所检测的73个个体中，检测结果发现有32个显性纯合子，13个杂合子，28个隐性纯合子。所有显示显性纯合和杂合的个体都具有胡须表型，所有隐性纯合的个体都没有胡须表型。结果证明chr27：1707859bp位点与胡须表型完全关联，可以用于胡须基因型的检测。

实施例2分子标记的运用

分别对具有胡须表型的3个品种（惠阳胡须鸡、象洞鸡、北京油鸡）和非胡须表型的22个品种进行检测。其中惠阳胡须鸡和岭南黄鸡A03系来源于广东省农业科学院畜牧研究所、北京油鸡来自于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、象洞鸡来自于福建省龙岩市武平象洞鸡保种场、其余鸡种均来自中国农业科学院江苏省家禽研究所。

1、基因组DNA的提取

鸡翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K过夜消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20℃保存。

2、PCR扩增

按照实施例1所述的PCR方法，分别对具有胡须表型的3个品种和非胡须表型的22个品种的共210个鸡只的基因组DNA分别进行PCR扩增检测，引物、扩增体系、方法均参见实施例1。

3、基因型检测

参照实施例1所述的基因型检测方法对25个品种的210个鸡只的基因组对应的PCR产物进行焦磷酸测序，检测鸡27号染色体1707859bp位点的SNP分子标记。

4、结果分析

参照实施例1建立的方法评价标准，对来源于25个品种的共210只鸡基因组的27号染色体1707859bp位点的SNP分子标记分析显示，在所检测的个体中，显性纯合子HH有50个，杂合子Hh有5个，隐性纯合子hh有155个。结果如表1所示。其中惠阳胡须鸡来源于保种场，经历长期的保种过程，多数个体以已处于纯合状态，而北京油鸡没有对胡须性状进行选育，所以存在杂合子。

表1不同品种胡须基因型检测结果

上述来源于25个中国地方鸡种的鉴定结果表明:胡须基因型判定可以通过chr27：1707859bp位点的多态性判定实现。利用分子标记检测确定胡须基因型可以加快选育具有胡须表型的鸡种，节省了育种时间，使得快速获得具有纯合胡须基因型的优良鸡种成为可能。

上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测鸡胡须基因型的SNP分子标记，其特征在于，

所述SNP分子标记通过如下方法扩增：

(1)提取待测鸡的基因组DNA，以其为模板；

(2)使用引物扩增进行PCR反应：

所述引物为：

上游引物5'-TCTGCCCCTGTTCTGTACCAT-3'，

下游引物5'-AGCTGCGTGGGCTGAAAC-3'；

(3)获得包含鸡27号染色体1707859bp位点的SNP分子标记，该位点的多态性为T/C。

2.用于检测权利要求1所述SNP分子标记的引物，其特征在于，其核苷酸序列为：

上游引物：5’-TCTGCCCCTGTTCTGTACCAT-3’，

下游引物：5’-AGCTGCGTGGGCTGAAAC-3’。

3.与权利要求2所述引物配合使用的探针，其特征在于，其核苷酸序列为：5’-ACCCAACAGCCTCCC-3’。

4.一种检测鸡胡须基因型的方法，其特征在于，利用焦磷酸测序法对权利要求1所述的SNP分子标记进行检测。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测鸡的基因组DNA，以其为模板，以权利要求2所述的引物为扩增引物，进行PCR反应；

(2)以步骤(1)的扩增产物为模板，以权利要求3所述的探针为测序引物进行焦磷酸测序，当鸡27号染色体1707859bp位点T碱基、C碱基峰高相同，各占一半时，则为鸡胡须基因显性纯合子；当T碱基峰高大于C碱基，T:C＝2:1，则为鸡胡须基因杂合子；当只有T碱基的峰，无C碱基的峰时，则鸡胡须基因隐性纯合子。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增的反应体系为：总体系为25μl时，含有基因组DNA：50ng，1×PCR Buffer，dNTP 3mM，上下游引物各10pmol，LongAmp TaqDNA聚合酶1.25U，加水补至25μl反应体系。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10sec，60℃退火30sec，65℃延伸20sec，35个循环；65℃终延伸10min；12℃保存。

8.一种检测鸡胡须基因型的试剂盒，其特征在于，含有一对引物和一个探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、2、3所示。

9.权利要求1所述的SNP分子标记在鸡育种中的应用。

10.权利要求8所述试剂盒在鸡育种中的应用。