CN110283915A - 一种筛选高产蛋狮头鹅的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种筛选高产蛋狮头鹅的方法，发明人首次发现CLPB基因的表达量与狮头鹅产蛋量为正相关，测定狮头鹅的CLPB基因的表达量可以用来评估狮头鹅的产蛋量，CLPB基因高表达的为高产蛋狮头鹅，CLPB基因低表达的为低产蛋狮头鹅。其有益效果在于，利用该方法能快速检测样本狮头鹅为高产蛋还是低产蛋，节省了传统育种的时间和成本，为快速培育高产蛋的狮头鹅新品系提供技术支持，也为开发狮头鹅品种资源及产业化发展提供参考。

Description

一种筛选高产蛋狮头鹅的方法及其应用

技术领域

本发明属于遗传育种技术领域，更具体地，涉及一种筛选高产蛋狮头鹅的方法及其应用。

背景技术

我国地方鹅品种资源丰富，但总体产蛋性能不佳，提高我国地方品种的产蛋率一种是我国家禽育种的主要目标之一。传统的鹅产蛋性能选育方法，至少要通过一个世代的产蛋量表型来选择。产蛋表型的选择又是一个长期累积的过程，其影响因素又很多，如选择强度、选择性状的强度、选择性状的数目、世代间距，环境条件和营养水平等，都会对表型选择发生作用，其变异连续性，加之性状的表型与其基因型之间的关系复杂，在大多数情况下并不完全吻合，因而选择往往难以准确，只有多次重复同一种方法，连续数代定向选择才能取得稳定的结果，存在周期长，效率低、成本高、进展缓慢等缺点。

狮头鹅是世界上最大型的鹅种之一，也是中国特有的大型的肉鹅，也是世界三大大型鹅类之一。狮头鹅现在主要养殖于澄海、潮安县、汕头郊区等地，是广东省特色的农业家禽品种。狮头鹅具有生长速度快、体型大、产肉多、狮头鹅肝肥美、抗逆性强、适应性强、抗逆性强等优点。然而狮头鹅每年产卵总量较少，一般一年产3窝蛋，少部分鹅可以产4窝蛋，总产量约为25至30个，每个鹅蛋的平均重量约为203克，狮头鹅蛋壳呈白色，受精率和孵化率均较低，受精率约为70％～80％，而受精卵的孵化率约为85％～90％，狮头鹅的产蛋特性严重限制了狮头鹅产业的发展。

狮头鹅产业最突出的问题是种质资源利用和新品种选育程度不够，品种发展程度不一，良种结构不够完善。长期以来，狮头鹅采用闭锁繁育，育种工作相对滞后，品系选育与配套系杂交的使用也才起步不久，导致狮头鹅产业面临着诸多问题：种狮头鹅繁殖率低，供种能力差，缺乏满足不同市场需要的专用配套系或新品系，群体生产性能整齐度差，个体生产性能差异大等，严重阻碍了狮头鹅产业的发展。

发明内容

本发明针对于以上问题，提供一种筛选高产蛋狮头鹅的方法，所述方法为对狮头鹅CLPB基因的RNA水平进行检测，得出CLPB基因的表达量，作为判断狮头鹅产蛋量的依据，其中所述CLPB基因序列为GenBank登录号：XM_013191218.1所示序列，CLPB基因的表达量与产蛋量成正相关，即CLPB基因高表达的为高产蛋狮头鹅，CLPB基因低表达的为低产蛋狮头鹅。

本发明对产蛋量显著差异的狮头鹅群体的血液DNA样本开展了全基因组测序工作，并利用全基因组关联性分析(GWAS)手段挖掘了狮头鹅产蛋性状的候选基因，荧光定量的方法进行验证，找到了与狮头鹅产蛋性状关联的主效基因CLPB，并且发现CLPB基因的表达量与狮头鹅产蛋量为正相关，即CLPB基因的表达量高的狮头鹅表现为高产蛋量。

本领域技术人员应当知晓，测定基因表达量的方法有多种，比较常见的为northern，RT-PCR或real-time PCR等，本发明不限定具体使用哪种方法测定CLPB基因的表达量，本发明以下涉及的具体步骤只是本发明较优的一个实施例。

进一步，所述表达量为相对于内参基因的表达量，所述内参基因为GAPDH时，所述CLPB基因的高表达是高于1.5倍GAPDH的表达量，所述CLPB基因的低表达是低于0.5倍GAPDH的表达量，所述高产蛋是产蛋量≥45个/年，所述低产蛋是产蛋量＜20个/年。

进一步，所述筛选高产蛋狮头鹅的方法包括以下步骤：

S1：对处于产蛋期的样本狮头鹅母鹅采血，并提取全血mRNA；

S2：将步骤S1中全血mRNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，GAPDH为内参，根据GenBank登录号：XM_013191218.1所示序列设计扩增CLPB基因mRNA的引物并进行荧光定量PCR；

S3：根据荧光定量的结果判定，CLPB基因表达量高于1.5倍GAPDH表达量的为高产蛋狮头鹅，CLPB基因表达量低于0.5倍GAPDH表达量的为低产蛋狮头鹅。

本方法步骤S1中，采用狮头鹅全血mRNA，样品容易采集，采血量小不会对狮头鹅的生长产生不利影响，mRNA提取的试剂盒较为方便，能保证mRNA的质量和纯度，有利于后续步骤有效可靠。

本方法步骤S2中，反转录和荧光定量都是本领域技术人员较为熟悉的用于测定某个基因表达量的方法，只需要根据CLPB基因设计合适的引物进行扩增即可。

进一步，所述检测CLPB基因的引物对为：

F：5’-TTATTGCTGGAAGGCACGGA-3’

R：5’-TAGCTGCAAGCAGGGTCTTC-3’

本领域技术人员很容易根据CLPB基因的序列设计扩增引物，本发明所示引物对只是其中一种实施方式中所使用的引物，但不限于使用该引物对。

本发明同时保护一种所述筛选高产蛋鹅的方法在辅助鹅育种中的应用。

以CLPB基因的表达量为判断标准，利用所述筛选高产蛋狮头鹅的方法所得出的评估产蛋量范围，将高产蛋狮头鹅作为良种培育的选择基础，将低产蛋鹅逐步淘汰，节省育种的时间和成本。

本发明也提供一种利用所述CLPB基因在筛选高产蛋鹅试剂盒中的应用。

试剂盒向来以快速、批量化检测为商品特性，本发明中指出只要是利用CLPB基因来作为与鹅体型相关的检测均属于本发明的保护范围。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

本发明的研究成果为快速培高产蛋狮头鹅新品系提供技术支持，满足市场需求，为开发狮头鹅品种资源及产业化发展提供参考。

本发明所提供的与狮头鹅产蛋相关的基因CLPB，为提高狮头鹅产蛋量提供了新的靶标位置，通过该基因与产蛋性状的关联性，可以通过改变该基因的表达量进而培育高产蛋品种。

本发明所公开的筛选方法对精准育种技术体系，提高选择效率，保护和开发狮头鹅品种资源，促进狮头鹅产业向现代化、良种化及产业化发展具有重要意义。

附图说明

图1为高产狮头鹅与低产狮头鹅主成分析图。

图2为与狮头鹅产蛋性状关联分析曼哈顿图。

图3为与狮头鹅产蛋性状关联分析QQ图。

图4为狮头鹅产蛋候选基因表达量分析。

图5为临床样品产蛋筛选基因CLPB的表达量。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中的狮头鹅样品均来自汕头白沙禽畜原种研究所，且所有个体均为同一批次孵化，在相同环境下饲养。进入育成期后，采用单笼养殖，基于记录狮头鹅个体开产3年的产蛋数得到的狮头鹅样本。

实施例1：

1)产蛋性状的全基因组关联研究

全基因组关联分析：209个样本，其中高产(年产蛋60个以上)128个，对照(年产蛋20个以下)81个)，使用EMMAX进行GWAS分析。

对209个狮头鹅样本进行翅下静脉采血和全血DNA的提取纯化和测序：在提取DNA的过程中，采用天根血液基因组DNA提取试剂盒进行提取和纯化，利用NanoDrop 2000分光光度计测量DNA原液浓度，去DNA原液30μL置于96孔板，并用加入适量超纯水稀释至30ng/μL。将稀释液包装好后送往深圳华大基因股份有限公司，对209个样本鹅血液DNA样本开展了全基因组序列测定。

高产与对照组主成分析结果如图1所示，高产与对照组鹅基因组SNP的分化明显，说明高产鹅与对照鹅的SNP基因存在显著差异。

进一步，全基因组关联研究见图2和图3。

图2中虚线以上共筛选到10个与鹅产蛋性状显著相关的SNP位点。进一步扩大阈值，图3为位点筛选QQ图，共找到与鹅产蛋性状显著相关的SNP位点10个，根据这10个位点其中筛选到与生殖相关的候选基因8个(分别是HTF3A，LIMA1，DDX49，CLPB，ELOVL4，GM2A，SMG7，TMLHE)

2)产蛋性状候选基因的定量验证

选取处于产蛋期的年产蛋60个以上的狮头鹅和年产蛋20个以下的狮头鹅群体血液样品各10份提取RNA。

(1)将200μL采集的鹅全血样品加入800μL TRIZOL，裂解，在无RNA酶的1.5mL管中利用震荡机振荡至液体均匀。

(2)静置5min后加入200μL氯仿，离心管利用漩涡振荡器混匀20s，静置2min后4℃，12000rpm离心10min。

(3)吸取500μL上清到1.5mL离心管中，加入500μL在-20℃提前预冷好的异丙醇试剂，离心管利用漩涡振荡器混匀20s，静置10min后4℃，12000rpm离心10min。

(4)取出离心管可见管底RNA白色沉淀，小心弃去上清，加入1000μL在-20℃预冷的75％乙醇(使用DEPC水配制)，轻轻吹打洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心5min。

(5)小心吸取并去掉上清废液，再用在冰上冷冻过的75％乙醇洗涤一次，4℃，10000rpm离心5min。

(6)小心弃去上清，将离心管在通风橱中风干20min，待乙醇全部挥发后加入50μLDEPC水溶解RNA。

(7)对刚抽取的RNA用微量分光光度计尽快测定它的浓度及纯度，1％琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性，之后于-80℃储存。

(8)以上步骤全部都在低温环境下进行操作。

将获得的RNA吹打混匀后离心至干净的离心管内，在42℃条件下充分反应以去除gDNA。gDNA去除反应体系见表1。

表1 gDNA去除反应体系

参照Takara公司的反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，反转录体系如表2所示。

表2反转录反应体系

反转录过程为：37℃ 15min；85℃ 5s，4℃保存。将制备好的cDNA保存于-20℃备用。

3)实时荧光定量PCR

根据NCBI上下载狮头鹅筛选出来产蛋候选基因的mRNA序列设计引物如下。

表3狮头鹅产蛋性状候选基因的引物序列

根据bimake公司实时荧光定量PCR试剂盒说明书，荧光定量PCR使用20uL体系，体系内各成分体积见表4。

表4荧光定量PCR体系

荧光定量反应程序设置为：95℃ 10min；95℃ 10s，60℃ 30s，40cycles；95℃15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

狮头鹅产蛋性状候选基因的基因表达情况如图4所示，CLPB(Caseinolyticpeptidase B，CLPB)基因在低产蛋狮头鹅群体中的表达量显著低于高产蛋狮头鹅群体(P＜0.05)。

4)产蛋性状差异基因的临床样品检测分析

为了充分验证各差异基因在狮头鹅高低产蛋群体中的差异表达程度，本研究扩大了高低产蛋群体以进行差异表达基因的临床鉴定。临床随机采集高产蛋狮头鹅以及低产蛋狮头鹅血液样本各28份，低产组狮头鹅符合年产蛋数低于20个这一标准，高产组狮头鹅符合年产蛋数高于45个这一标准。在低产蛋组高产蛋组狮头鹅群体中对CLPB基因进行临床鉴定。产蛋性状表型统计值见表5。

表5狮头鹅高低产蛋组产蛋性状统计

大群体鉴定结果表明，基因CLPB在低产蛋狮头鹅群体中的表达量均显著(P＜0.05)低于高产蛋狮头鹅群体。进一步验证了CLPB基因表达量与产蛋性状的相关性极高。临床鉴定结果与前期定量结果一致，表明基因CLPB在狮头鹅产蛋性状中行使重要功能，可以用作狮头鹅产蛋性状基因分型技术的候选靶标。

表6狮头鹅产蛋筛选基因表达量比较

以低产蛋量(年产蛋低于20个)群体的CLPB基因表达量为基准，CLPB基因的表达量越高，对应鹅的表型为产蛋量越多，CLPB基因的表达量显著高的鹅年产蛋量均大于45个，证明CLPB基因的表达量对狮头鹅产蛋性状为正相关，并可以通过对狮头鹅CLPB基因的表达量的测定，评估所测狮头鹅的产蛋量，用于选育高产蛋个体，培育优良品种。

本实施例上述图表中所述表达量是将低产蛋群体的各基因表达量定为1，以此为基础，得出的高产蛋的相对表达量。

本实施例还测定了以内参基因GAPDH的表达量为基础1，高产蛋和低产蛋的相对表达量分别为1.53±0.28和0.50±0.16，见图5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种筛选高产蛋狮头鹅的方法，其特征在于，所述方法为对狮头鹅CLPB基因的RNA水平进行检测，得出CLPB基因的表达量，作为判断狮头鹅产蛋量的依据，其中所述CLPB基因序列为GenBank登录号：XM_013191218.1所示序列，CLPB基因的表达量与产蛋量成正相关，即CLPB基因高表达的为高产蛋狮头鹅，CLPB基因低表达的为低产蛋狮头鹅。

2.根据权利要求1所述筛选高产蛋狮头鹅的方法，其特征在于，所述表达量为相对于内参基因的表达量，所述内参基因为GAPDH时，所述CLPB基因的高表达是高于1.5倍GAPDH的表达量，所述CLPB基因的低表达是低于0.5倍GAPDH的表达量，所述高产蛋是产蛋量≥45个/年，所述低产蛋是产蛋量＜20个/年。

3.根据权利要求1所述筛选高产蛋狮头鹅的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：对处于产蛋期的样本狮头鹅母鹅采血，并提取全血mRNA；

S2：将步骤S1中全血mRNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，GAPDH为内参基因，根据GenBank登录号：XM_013191218.1所示序列设计扩增CLPB基因mRNA的引物并进行荧光定量PCR；

S3：根据荧光定量的结果判定，CLPB基因表达量高于1.5倍GAPDH表达量的为高产蛋狮头鹅，CLPB基因表达量低于0.5倍GAPDH表达量的为低产蛋狮头鹅。

4.根据权利要求3所述筛选高产蛋狮头鹅的方法，其特征在于，检测荧光定量PCR的引物对为：

F：5’-TTATTGCTGGAAGGCACGGA-3’；

R：5’-TAGCTGCAAGCAGGGTCTTC-3’。

5.一种权利要求1～4任意一项所述筛选高产蛋狮头鹅的方法在辅助狮头鹅育种中的应用。

6.一种利用权利要求1所述CLPB基因在筛选高产蛋狮头鹅试剂盒中的应用。