CN110079615B

CN110079615B - 一种检测茶卡羊kmt2d基因cnv标记的方法及其应用

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Publication number: CN110079615B
Application number: CN201910498477.XA
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 程杰; 曹修凯; 胡林勇; 黄永震; 蓝贤勇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2039-06-10
Also published as: CN110079615A

Abstract

本发明公开了一种检测茶卡羊KMT2D基因CNV标记的方法及其应用：所述的CNV标记是指茶卡羊KMT2D基因候选区域Chr3:136830401‑136832800内的拷贝数变异，以茶卡羊基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增茶卡羊KMT2D基因CNV区域和内参基因ANKRD1部分片段，根据2*2^‑ΔCt将定量结果分为增加型、减少型和正常型。本发明在DNA水平上检测与茶卡羊体长性状密切相关的CNV标记，可作为茶卡羊生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记，以便快速建立遗传资源优良的茶卡羊种群。

Description

一种检测茶卡羊KMT2D基因CNV标记的方法及其应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种与茶卡羊生长性状相关的KMT2D基因CNV标记的检测方法与应用。

背景技术

绵羊在世界各地均有饲养，性情温顺，易驯化，可以为人类提供肉和毛皮等产品。茶卡羊属于毛肉兼用半细毛羊，生长于青海高原乌兰县环茶卡盐湖区域，受独特地理气候和土壤环境影响，其羊肉含丰富矿物质和维生素。2013年4月，“茶卡羊”获得国家农业部农产品地理标志认证。

拷贝数变异(copy number variations，CNVs)是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象。CNVs是基因组上一种亚显微水平的结构变异，涉及的片段大小在50bp到数个Mb之间，包括拷贝数增加(copy number gain)和拷贝数减少(copy number loss)。有些拷贝数变异并不对动植物的表型造成影响，而有些拷贝数变异则通过扰乱基因序列和改变基因含量来影响基因表达，从而造成表型差异和表型适应。

目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：(1)比较基因组杂交(CGH)：CGH可在全部染色体或染色体亚带水平上，对不同基因组之间DNA序列的拷贝数进行检测，从而发现拷贝数变异。然而该技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出。同时该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广。(2)多重连接探针扩增技术(MLPA)：MLPA是2002年发展起来的一种拷贝数检测方法。该技术具有较准确的相对定量功能，但是该方法探针制备较为复杂，同时操作步骤繁琐，耗时长。并且采用毛细管电泳作为分析手段，通量较低、成本较高且属于开放式操作，易于造成PCR产物的污染。(3)高分辨熔解曲线分析(HRM)：HRM于2003年发明，其通过精确的变温速率控制以及DNA饱和染料的指示，实现了通过研究PCR产物序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。该技术具有快速、廉价、高通量等优点，同时具有以下不足：该方法实现的前提是突变位点必须是杂合的，从而增加了实验的成本和设计的难度，而且降低了检测的通量。并且，单个核苷酸的差异对于熔解曲线的影响较小，甚至有些差异几乎不影响熔解曲线的偏移，造成检测灵敏度较低。(4)实时荧光定量PCR(qPCR)：根据所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。PCR反应体系中加入过量的SYBR Green染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底，几乎不发光，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2*2^-ΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。荧光染料嵌入法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适用于大样本的高通量检测。(5)SNP芯片：目前使用较少。(6)高通量测序技术：当前最有效的检测手段是通过重测序来检测基因组结构变异，但这种方法相较之前的方法成本较高。(7)杂交技术：主要包括Southern blotting杂交、荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization,FISH)、多重扩增探针杂交技术(multiplex amplifiable probehybridization,MAPH)等，但这些方法成本比较高，时间长而且不够准确，目前使用较少。

分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection，MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对与生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

KMT2D基因(histone-lysine N-methyltransferase 2D)是哺乳动物组H3K4单甲基转移酶，属于组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)甲基转移酶家族。该家族具有六个Set1类似的H3K4甲基转移酶，包括KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、KMT2F和KMT2G，其中含有的C-terminal SET结构域，负责H3K4甲基转移酶活性，是维持细胞中KMT2D蛋白稳定所必需的。在以上六种甲基转移酶中，KMT2D的功能与KMT2C相似，KMT2D与确定转录增强剂转录因子的谱系结合，对H3K4具有显著增强的作用。KMT2D基因对肌肉和脂肪组织的发育是必不可少，并在成人组织中广泛表达。KMT2D基因发生突变会导致发育疾病，如歌舞伎综合征和先天性心脏病，甚至导致各种形式的癌症，如膀胱癌、肺癌、子宫内膜癌、食管鳞状细胞癌等。

茶卡羊的KMT2D基因位于Ch3:136807906-136846851(Oar_v4.0)，序列编码5455个氨基酸。但目前，尚未见有关KMT2D基因CNV对茶卡羊生长性状影响的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测茶卡羊KMT2D基因CNV标记的方法及其应用。本发明可以为茶卡羊分子育种提供理论依据，便于茶卡羊生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的茶卡羊种群。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法，包括以下步骤：

以茶卡羊血液全基因组DNA为模板，以引物对P1和引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增茶卡羊KMT2D基因拷贝数变异区域和作为内参序列的ANKRD1基因部分片段，然后根据定量结果鉴定茶卡羊KMT2D基因的拷贝数变异类型，所述的KMT2D基因拷贝数变异区域定位于绵羊KMT2D基因候选区域Chr3:136830401-136832800(GenBank Oar_v4.0)。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔCt将定量结果分为的三类：增加型，2*2^-ΔCt≥2.5；减少型，2*2^-ΔCt<1.5；正常型，1.5≤2*2^-ΔCt<2.5。

优选的，所述的引物对P1为：

上游引物F1：5′-TCATTGTTCTGCTTGGCTTGGT-3′，

下游引物R1：5′-TGCAGCGAATTTGTCCAGGT-3′；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5′-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3′，

下游引物R2：5′-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3′。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系以13μL计为：50ng/μL模板DNA1μL，10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR GreenqPCRMix 6.5μL，以及去离子水4.5μL。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序包括以下步骤：(1)预变性95℃10min；(2)扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环。

上述与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法在茶卡羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述的KMT2D基因拷贝数变异区域的不同拷贝数变异类型与茶卡羊的生长性状显著相关，其中，具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状(例如，体长、体重)上优于具有减少型和增加型拷贝数变异类型的个体，并且具有正常型拷贝数变异类型的个体的体长显著高于减少型的个体，表型较为优异，而减少型的个体表型较差。

一种检测与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1及P2。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据所发现的位于绵羊KMT2D基因候选区域Chr3:136830401-136832800(GenBank Oar_v4.0)的拷贝数变异(CNV)位点，建立了通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在茶卡羊群体中的拷贝数变异的方法，检测方法操作简便，可以快速、准确、可靠的获得茶卡羊个体KMT2D基因在对应CNV位点的拷贝数变异类型；通过对茶卡羊KMT2D基因拷贝数变异与体高、体长、胸围、体重等重要经济性状进行关联分析，发现茶卡羊KMT2D基因的这一拷贝数变异位点可以作为CNV标记，其检测不受年龄和性别的限制，可用于早期选育，为茶卡羊生长性状的分子标记辅助选择提供科学依据，从而加快优势茶卡羊种群的建立及育种进程。

附图说明

图1为本发明中进行qPCR(KMT2D基因)绘制的扩增曲线。

图2是本发明中进行qPCR(KMT2D基因)绘制的熔解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。所述实施例用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明依据通过高通量测序技术将KMT2D基因CNV映射到茶卡羊KMT2D基因的41-44个外显子上的发现，并结合KMT2D基因变异与表型的相关性，确立茶卡羊KMT2D基因拷贝数变异并将其与茶卡羊重要生长性状进行关联分析。

本发明利用实时荧光定量PCR对茶卡羊KMT2D基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；

(2)利用SPSS 18.0软件将拷贝数变异类型与茶卡羊生长性状进行关联分析，筛选到一个与茶卡羊生长性状相关的CNV标记；该CNV标记位于绵羊KMT2D基因候选区域Chr3:136830401-136832800(GenBank Oar_v4.0)；

(3)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的茶卡羊选育。

本发明具体包括以下步骤：

1、茶卡羊样本采集

本发明具体以茶卡羊(n＝305)作为检测对象，于青海省乌兰县茶卡镇采集茶卡羊血样，采集时间为2018年5月。

2、基因组DNA的分离、提取、纯化

参考文献Sambrock et al(2002)方法。

3、目标序列及内参序列的扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的绵羊KMT2D基因序列(GenBank Oar_v4.0)为参考序列，利用Primer 5.0设计扩增KMT2D基因拷贝数变异区域(目标序列)的实时荧光定量PCR引物对，内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即ANKRD1基因中的一段143bp的序列。引物对序列信息如表1所示(引物设计完成时间为2018年7月)。

表1.实时荧光定量PCR的引物信息

进行实时荧光定量PCR所用的扩增体系以13μL计为：50ng/μL模板DNA(提取自血样样本的基因组DNA)1μL，10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCR Mix 6.5μL，以及去离子水4.5μL。

进行实时荧光定量PCR所用的的反应程序为：(1)预变性：95℃10min；(2)扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环；(3)绘制溶解曲线：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min。

通过绘制扩增曲线(图1)和熔解峰确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图2)。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2*2^-ΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔCt＝(C_{T目标序列}-C_{T内参序列})。C_T即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

当目标序列为正常型时，1.5≤2*2^-ΔCt<2.5。当目标序列为减少型时，2*2^-ΔCt<1.5。当目标序列为增加型时，2*2^-ΔCt≥2.5。

5、茶卡羊KMT2D基因CNV位点与生长性状的关联分析

生产数据：体长、体高、体重、胸围。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 18软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkh＝μ+A_i+S_j+CNV_k+e_ijkh

其中：Y_ijkh为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i头个体的年龄，S_j为第j头个体的性别，CNV_k为第k个拷贝数变异类型的固定效应，e_ijkh为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。

表2.KMT2D基因CNV与茶卡羊生长性状的关联分析

关联分析结果表明(见表2)：在茶卡羊群体中，KMT2D基因CNV位点可显著影响个体的体长，并且正常型个体显著优于减少型个体，说明KMT2D基因的CNV位点(绵羊KMT2D基因候选区域Chr3:136830401-136832800)可以作为一个提高茶卡羊体长性状的候选分子遗传标记。

6、上述CNV标记在茶卡羊选育中的应用

利用以上获得的候选分子遗传标记，可以对茶卡羊体长等性状进行分子标记辅助选择，从而加快茶卡羊品种改良的选育进程。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种检测茶卡羊KMT2D基因CNV标记的方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tcattgttct gcttggcttg gt 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgcagcgaat ttgtccaggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<400> 3

tgggcaccac gaaattctca 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tggcagaaat gtgcgaacg 19

Claims

1.一种与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法在茶卡羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法，包括以下步骤：

以茶卡羊基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增茶卡羊KMT2D基因拷贝数变异区域和作为内参序列的ANKRD1基因部分片段，然后根据定量结果鉴定茶卡羊KMT2D基因的拷贝数变异类型，所述的KMT2D基因拷贝数变异区域位于KMT2D基因候选区域Chr3:136830401-136832800；

所述的拷贝数变异类型是根据2*2^−ΔCt将定量结果分为的三类：增加型，2*2^−ΔCt≥2.5；减少型，2*2^−ΔCt<1.5；正常型，1.5≤2*2^−ΔCt<2.5；

所述的KMT2D基因拷贝数变异区域的不同拷贝数变异类型与茶卡羊的生长性状显著相关，其中，具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于具有减少型和增加型拷贝数变异类型的个体；

所述的KMT2D基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：

上游引物F1：5′-TCATTGTTCTGCTTGGCTTGGT -3′，

下游引物R1：5′-TGCAGCGAATTTGTCCAGGT -3′；

所述的ANKRD1基因部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5′-TGGGCACCACGAAATTCTCA -3′，

下游引物R2：5′-TGGCAGAAATGTGCGAACG -3′。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序包括以下步骤：95℃预变性10min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，共39个循环。