CN112359120B - 一种检测黄牛mfn1基因cnv标记的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛MFN1基因CNV标记的方法及其应用：以云岭牛的血样基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增MFN1基因CNV区域和参考基因BTF3的部分片段，根据2*log₂2^‑ΔΔCt将定量结果分为插入型、缺失型和正常型，从而鉴定云岭牛MFN1基因的拷贝数变异类型。与云岭牛生长数据的关联分析显示，MFN1基因不同拷贝数对个体生长发育有显著影响，其中缺失型个体的胸宽低于插入型个体。本发明在DNA水平上检测与牛生长性状密切相关的CNV标记，可作为生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记，快速建立遗传资源优良的肉牛种群。

Description

一种检测黄牛MFN1基因CNV标记的方法及其应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于qPCR技术检测牛MFN1基因CNV标记的方法。

背景技术

随着基因组学和生物信息学等学科的发展，动物育种理论和技术正在发生重大变化，肉牛育种的方向由常规的表型选育向分子育种发展。目前，牛分子育种研究主要集中在以分子标记为基础的标记辅助选择方面。分子育种即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)作为一种基因组亚显微水平结构变异，具体是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数Mb之间。全基因组范围内寻找CNV的方法主要包括比较基因组杂交(CGH)、SNP芯片和重测序。CGH是基于微阵列技术的比较基因组杂交，通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品(试验样本与对照样本)同时进行杂交，可检测试验样本基因组和对照样本基因组间DNA拷贝数的变化。CGH芯片的探针覆盖整个基因组，具有敏感度、准确度、分辨率高的特点，分析所得数据具有较高的可信度。然而CGH的分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出，同时CGH操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要大量的模板DNA，不利于大范围的推广。SNP芯片不需要同时使用两个样本的DNA和探针进行双杂交，仅使用单杂交就可以完成。它可以通过比较测试样本的信号强度与其他个体的强度，确定每个位点的相对基因组拷贝数。新一代直接测序技术克服了杂交固有的一些缺点，不需要更多的背景知识和设计工作，应用配对测序可以鉴定出复杂的结构变化。

对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。例如实时荧光定量PCR(qPCR)、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH。qPCR根据所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。荧光染料嵌入法利用PCR反应体系中加入的过量的SYBR Green染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2^-ΔΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。荧光染料嵌入法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数。

线粒体融合蛋白(MFN1)基因调控细胞内线粒体外膜的融合，维持细胞中网状线粒体的动态需要。线粒体融合蛋白在N末端含有保守的催化GTP结合结构域，并通过C末端跨膜结构域锚定到外膜，线粒体融合蛋白通过GTP水解的同型和异型相互作用介导外膜融合。线粒体是所有真核生物都不可或缺的双层膜细胞器，大多数细胞中线粒体是高度动态的，且通过不断的融合、分裂来维持动态平衡。有研究指出，线粒体的快速融合与分裂是消除细胞内不正常线粒体的一种机制。

MFN1基因在线粒体新陈代谢中起着重要的作用，然而MFN1基因在牛肌肉发育中的作用尚未有研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测黄牛MFN1基因CNV标记的方法及其应用，从而加快良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测牛MFN1基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以云岭牛(或与云岭牛关系密切的黄牛品系)个体的基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增MFN1基因的拷贝数变异区域的部分片段以及作为参考的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定个体MFN1基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-GGGAGAGAAGTGATTTACTCAGACA-3’

下游引物R1：5’-TTCATCAGCAGCAAAGGGAACTA-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

优选的，所述的MFN1基因的拷贝数变异区域位于牛MFN1基因参考基因组序列NC_037328的87761056nt-87763853nt。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*log₂ 2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*log₂ 2^-ΔΔCt大于2；缺失型，2*log₂ 2^-ΔΔCt小于2；正常型，2*log₂ 2^-ΔΔCt等于2。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系包括10ng/μL模板DNA 1μL以及10pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃复性30s，共39个循环。

优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为126bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

上述检测牛MFN1基因拷贝数变异的方法在肉牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，具有插入型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。

优选的，所述生长性状为胸宽。

一种检测牛MFN1基因拷贝数变异的试剂盒，包括上述引物对P1和引物对P2。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据牛MFN1基因候选区域的候选位点Chr 1:87761056-87763853，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在云岭牛群体中的拷贝数变异情况，根据对应的MFN1基因拷贝数变异类型与体高、体重、胸宽等重要经济性状的关联分析结果，发现了与牛重要生长性状(例如，胸宽)密切相关的CNV标记，可以为肉牛分子育种提供试验依据，快速建立遗传资源优良的肉牛种群，加快肉牛生长性状的标记辅助选择的育种进程。

附图说明

图1为利用qPCR技术绘制的MFN1基因溶解曲线。

图2为利用qPCR技术绘制的BTF3基因溶解曲线。

图3为BTF3和MFN1基因扩增的凝胶电泳结果，其中：1号孔位为BTF3基因引物(P2)的扩增片段，2～4号孔位为MFN1基因引物(P1)的扩增片段，5号孔位为Marker。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

本发明通过对云岭牛在1号染色体上候选区域(Chr 1:87720810—87764841)的CNV进行检测，结合与生长数据的关联分析，发现了可以利用qPCR技术检测的位于牛MFN1基因序列(GenBank Accession No.NC_037328)的87761056nt-87763853nt区域内的CNV标记，可以用于快速建立遗传资源优良的肉牛种群，从而加快良种选育速度。

1、云岭牛样本采集

本发明以云岭牛作为检测对象，从云南省昆明市小哨乡草地动物科学研究院采集125个生长数据资料完善的个体的血液样本(采集时间：2018年9月)。

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化

参考文献Sambrock et al(2002)方法。

3、目的基因及参考基因扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛MFN1基因(目的基因)序列(GenBank Accession No.NC_037328)为参考序列，利用Primer 5.0设计扩增MFN1基因拷贝数变异区域中一段126bp的序列的qPCR引物(引物对P1)，同时，以NCBI公布的牛BTF3基因序列(AC_000177.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增参考基因(BTF3基因)中一段166bp的序列的qPCR引物(引物对P2)。引物对序列信息如表1所示，PCR扩增验证结果如图3所示。

表1.实时荧光定量PCR的引物信息

注：F表示上游引物，R表示下游引物。

qPCR所用的扩增体系以10μL计为：10ng/μL模板DNA(基因组DNA)1μL、10pM的上、下游引物各0.5μL、2×SYBR Green qPCR Mix(TAKAR,Japan)5μL，以及ddH₂O3μL。

qPCR所用的反应程序为：

(1)预变性：95℃1min；

(2)扩增反应：95℃变性15s，60℃退火15s，72℃复性30s，39个循环。

绘制溶解曲线：95℃10s，从65℃到95℃，+0.5℃5s，读板。

通过绘制扩增曲线和溶解峰确定引物适用于qPCR分析。扩增曲线平滑，表明qPCR试剂质量好且扩增体系和条件合适；绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好(图1、图2)。

4、拷贝数变异的推断

每个个体的DNA样品分别用目的基因和参考基因的引物(引物对P1和P2)进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(C_{T目的基因}-C_{T参考基因})_实验组-(C_{T目的基因}-C_{T参考基因})_对照组，实验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本，C_T即Cyclethreshold，为扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。2^-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的拷贝数相对于对照组的倍数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2^-ΔΔCt的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。

根据2*log₂ 2^-ΔΔCt将定量结果分为三类：插入型，2*log₂ 2^-ΔΔCt大于2；缺失型，2*log₂2^-ΔΔCt小于2；正常型，2*log₂ 2^-ΔΔCt等于2。

5.云岭牛MFN1基因CNV位点与生长性状的关联分析

生长性状：体高、体重、胸宽等。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 23软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+A_i+CNV_j+e_ijk，

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i个个体的年龄，CNV_j为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e_ijk为随机误差。各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以平均值±标准误差形式表示。

表2.云岭牛MFN1基因CNV与其生长性状的关联分析

注：表中所计算的数值Mean±SE为平均值±标准误差；在同一行中数值的右上角标有a、b、c代表同行数据间差异显著水平P＜0.05。

参见表2，关联分析结果表明，MFN1基因位点(Chr 1:87761056-87763853)拷贝数变异可显著影响云岭牛胸宽，并且，优势拷贝数变异类型为插入型，说明该MFN1基因CNV位点可以作为提高云岭牛生长性状的CNV标记。如果鉴定个体MFN1基因候选位点的拷贝数变异类型为插入型，则个体的胸宽表型更优；如果拷贝数变异类型为缺失型或正常型，则个体的胸宽表型较差。

6.上述CNV标记在云岭牛选育中的应用

获得的CNV标记可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响牛生长性状的数量性状基因座，以及对云岭牛进行分子标记辅助选择，从而加快云岭牛等肉牛改良的选育进程。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)检测MFN1基因拷贝数变异的方法，不受年龄的限制，可用于牛的早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择。

(2)检测MFN1基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便。

(3)MFN1基因拷贝数变异位点的检出，为肉牛分子标记辅助选择提供科学依据。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种检测黄牛MFN1基因CNV标记的方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gggagagaag tgatttactc agaca 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttcatcagca gcaaagggaa cta 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aaccaggaga aactcgccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttcggtgaaa tgccctctcg 20

Claims (6)

1.一种检测牛MFN1基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以牛基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增MFN1基因的拷贝数变异区域以及作为参考的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定MFN1基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’- GGGAGAGAAGTGATTTACTCAGACA-3’

下游引物R1：5’- TTCATCAGCAGCAAAGGGAACTA-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’- AACCAGGAGAAACTCGCCAA -3’

下游引物R2：5’- TTCGGTGAAATGCCCTCTCG -3’；

所述的MFN1基因的拷贝数变异区域位于MFN1基因参考基因组序列NC_037328的87761056nt-87763853nt；

所述的拷贝数变异类型分为三类：插入型，2*log₂ 2^−ΔΔCt大于2；缺失型，2*log₂ 2^−ΔΔCt小于2；正常型，2*log₂ 2^−ΔΔCt等于2；

所述牛选自云岭牛。

2.如权利要求1所述一种检测牛MFN1基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的扩增体系包括10 ng/μL模板DNA 1 μL以及10 pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5 μL。

3.如权利要求1所述一种检测牛MFN1基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s， 72℃复性30s，共39个循环。

4.如权利要求1所述一种检测牛MFN1基因拷贝数变异的方法，其特征在于：基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为126bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166 bp。

5.一种如权利要求1-4中任意一项权利要求所述的方法在肉牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：具有插入型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优；

所述生长性状为胸宽。

6.一种检测牛MFN1基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增MFN1基因的拷贝数变异区域以及作为参考的BTF3基因的部分片段的实时荧光定量PCR引物，所述的引物具体包括引物对P1以及引物对P2；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’- GGGAGAGAAGTGATTTACTCAGACA-3’

下游引物R1：5’- TTCATCAGCAGCAAAGGGAACTA-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’- AACCAGGAGAAACTCGCCAA -3’

下游引物R2：5’- TTCGGTGAAATGCCCTCTCG -3’；

所述的MFN1基因的拷贝数变异区域位于MFN1基因参考基因组序列NC_037328的87761056nt-87763853nt；

所述的拷贝数变异类型分为三类：插入型，2*log₂ 2^−ΔΔCt大于2；缺失型，2*log₂ 2^−ΔΔCt小于2；正常型，2*log₂ 2^−ΔΔCt等于2；

所述牛选自云岭牛。

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