CN113444811B

CN113444811B - 一种基于山羊gpr157基因cnv标记评估生长性状的分子诊断方法及其应用

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Publication number: CN113444811B
Application number: CN202110893489.XA
Authority: CN
Inventors: 黄永震; 沙克拉; 王献伟; 辛晓玲; 丁晓婷; 贺花; 胡沈荣; 张子敬; 刘贤; 李志明; 李文献; 徐泽君
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-08-04
Filing date: 2021-08-04
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2041-08-04
Also published as: CN113444811A

Abstract

本发明公开了一种基于山羊GPR157基因CNV标记评估生长性状的分子诊断方法及其应用。基于实时荧光定量PCR技术，以山羊个体基因组DNA为模板，以一对特异性引物扩增GPR157基因拷贝数变异区域的部分片段，以另外一对特异性引物扩增MC1R基因的部分片段作为内参，利用2*2^‑ΔΔCt判定个体的拷贝数变异类型。本发明提供的方法基于GPR157基因拷贝数变异与生长性状之间的关联，可用于快速建立山羊遗传资源优势种群，有利于加快山羊分子标记辅助选择育种工作，该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种基于山羊GPR157基因CNV标记评估生长性状的分子诊断方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及利用山羊基因组DNA进行实时荧光定量PCR，以MC1R基因为参照、根据2*2^-ΔΔCt确定个体GPR157基因的拷贝数变异类型。

背景技术

基因组DNA携带生物体的所有遗传信息，研究证明，遗传信息的改变是相关重要经济性状变异的主要来源，随着高通量测序技术的日渐成熟，筛选及鉴定经济性状相关基因，以及发掘和精准定位重要表型相关位点成为推动分子育种发展的一项重要任务。

目前分子育种主要的研究方向集中在标记辅助选择(molecular mark-assistselection,MAS)技术上，该技术是通过DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，从而实现对畜禽品种的经济性状的改良。在畜禽育种中，通过对与生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA分子标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)为基因结构变异，是指1kb到数MbDNA片段的拷贝数重复、缺失等类型的突变。CNVs是由基因重排导致的，是基因组变异的重要组成部分，可导致由基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等引起的表型多态性。研究表明，拷贝数变异可能影响基因网络并调节相关基因的表达，促成个体表型，因此，检测与山羊生长性状相关基因的CNV标记有助于加速山羊遗传选育的进程。

在检测已知CNV的各种方法中，实时荧光定量PCR(quantitive Real-Time PCR,qPCR)是使用比较广泛的一种技术。该方法操作简单、敏感性高、速度快，通过对目的基因(有拷贝数变异)和内参基因(无拷贝数变异)进行相对定量，然后可以利用2*2^-ΔΔCt判定个体的拷贝数变异类型。

GPR157(G protein-coupled receptor 157)是一种跨膜适配蛋白编码基因。国内外对GPR157基因的研究较少，对GPR157基因的功能及作用机制的认识都还处在初步阶段。目前为止，尚未见到关于GPR157基因拷贝数变异与山羊生长性状关联的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于山羊GPR157基因CNV标记评估生长性状的分子诊断方法及其应用，从而加快山羊良种选育进程。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测山羊GPR157基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以山羊个体基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增GPR157基因的拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定个体GPR157基因的拷贝数变异类型；

所述引物对P1为：

上游引物F1：5′-GCAGAGGTGCAGTTCCGAT-3′

下游引物R1：5′-AGCCTTGAAAACGTAGGCAAAAC-3′

所述引物对P2为：

上游引物F2：5′-GGGCAGTCCCTTGACAAAGA-3′

下游引物R2：5′-ATCTCCCCAGCCTCCTCATT-3′。

优选的，所述GPR157基因的拷贝数变异区域位于山羊GPR157基因候选区域Chr16:42828376-42910835(参考序列为NC_030823.1)。

优选的，所述拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型(Duplication类型)，2*2^-ΔΔCt>2；缺失型(Deletion类型)，2*2^-ΔΔCt<2；正常型(Normal类型)，2*2^-ΔΔCt＝2；并可按拷贝数(CN)再进行细分，例如2*2^-ΔΔCt＝3、4或2*2^-ΔΔCt≥5为多拷贝型；2*2^-ΔΔCt＝0或1为缺失型，2*2^-ΔΔCt＝2为正常型。

优选的，所述实时荧光定量PCR所用的扩增反应体系包括10～50ng/μL模板DNA 1μL以及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

优选的，所述实时荧光定量PCR所用的反应程序包括以下步骤：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为138bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为129bp。

上述检测山羊GPR157基因拷贝数变异的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，在贵州黑山羊群体中，Deletion类型(CN＝1、0)的个体在体高、体长性状方面的表现显著优于其他类型的个体。

一种检测山羊GPR157基因拷贝数变异的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1及引物对P2。

本发明的有益效果体现在：

本发明以MC1R基因作为对照，采用实时荧光定量PCR对山羊GPR157基因的拷贝数变异进行检测，可以对个体的GPR157基因拷贝数变异类型进行鉴定，从而依据所发现的定位于GPR157基因的DNA分子标记(CNV标记)辅助检测具有生长性状优势的个体，快速建立山羊遗传资源优势种群，从而加快山羊(例如，山羊地方品种)的育种进程。

本发明具有以下优点：

1.本发明提供的GPR157基因拷贝数变异检测方法，不受个体年龄和性别的限制，可用于山羊早期选育。

2.与高通量测序方法、基因芯片方法相比，本发明快速、简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数变异类型。

3.本发明在一定程度上为山羊生长性状的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

图1为本发明实施例中进行qPCR(GPR157基因)绘制的扩增曲线。

图2是本发明实施例中进行qPCR(GPR157基因)绘制的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

本发明对GPR157基因的拷贝数变异进行检测并用于山羊分子育种，主要包括以下步骤：参考NCBI数据库的山羊GPR157基因序列，利用Primer-BLAST网站进行引物设计，并用普通PCR对引物进行检验；采用实时荧光定量PCR技术检测候选位点(Chr16:42828376-42910835)在群体中的拷贝数变异情况；将拷贝数变异类型与生长性状进行关联分析，筛选到与生长性状相关的CNV标记；根据拷贝数变异类型筛选生长性状优异的个体，并建立用于选育的山羊种群。具体说明如下。

1.山羊样本采集

本发明以贵州黑山羊、贵州白山羊、太行黑山羊、波槐杂交山羊、河南槐山羊为检测对象，采集和使用了544头山羊个体的血液样本(见表1)，并记录个体生长性状数据，如体高、体重、体长、胸围、管围等，以用于后续的关联分析。

表1.样本采集信息

本发明中共采集544个样本的血样，血液的采集方法为颈静脉采血，用冰盒带回实验室，于-80℃储存；同时进行基础数据收集和测定：采样时对相应个体进行基础数据测定(体高、体斜长、胸围、管围、体重等)、采集和录入，以用于后期的关联分析。

2.血样基因组DNA的提取

(1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液；重复本步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

(3)加蛋白酶K至5μL(20mg/mL)并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀后继续消化直至澄清，将反应液冷却至室温。

(4)加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管；重复本步骤1次。

(5)加入氯仿500μL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

(6)加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500μL，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(7)加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷乙醇，转动离心管直至白色絮状沉淀析出。

(8)4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(9)4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(10)干燥后的DNA加入80～100μL的TE溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪检测其质量，-80℃保存。

3.目的基因及内参基因特异性引物设计

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的山羊GPR157基因(NC_030823.1)为参考序列，查找重测序中筛选出来的GPR157基因(目的基因)拷贝数变异候选区域的序列(Chr16:42828376-42910835)，利用Primer-BLAST网站设计用于扩增该区域内靠近中间位置的一段138bp的序列的引物(引物对P1)。同时，以NCBI所公布的山羊MC1R基因序列(NC_030825.1)为参考序列，采用相同的方法设计用于扩增内参基因(MC1R基因)中一段129bp的序列的引物(引物对P2)。引物对序列信息如表2所示(引物合成时间2020年11月)。

表2.实时荧光定量PCR的引物信息

注：F1或F2为上游引物，R1或R2为下游引物

4.实时荧光定量PCR

qPCR反应体系如表3所示。

表3.qPCR的反应体系

qPCR的扩增反应程序为：

(1)95℃预变性10min，然后按照(2)进行扩增反应；

(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

参见图1及图2，通过绘制扩增曲线和溶解峰确定引物适用于实时荧光定量PCR分析。

5.个体CNV类型判定

根据目的基因和内参基因的qPCR实验结果计算样本-ΔΔCt：

ΔΔCt＝ΔCt_(实验组)-ΔCt_(参照组)

ΔCt_(实验组)＝Ct_{(实验组目的基因)}-Ct_{(实验组内参基因)}，ΔCt_(参照组)＝Ct_{(参照组目的基因)}-Ct_{(参照组内参基因)}

其中，实验组即为待检测有无拷贝数变异的个体样本，参照组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序试验中所选择的参照组各品种山羊个体。Ct即Cyclethreshold，为PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

根据以上公式计算得出每个个体样本的2*2^-ΔΔCt，并根据以下判定标准鉴定个体的CNV类型：2*2^-ΔΔCt>2为Duplication类型(多拷贝型)；2*2^-ΔΔCt＝2为Normal类型(正常型)，2*2^-ΔΔCt<2为Deletion类型(缺失型)。

利用2*2^-ΔΔCt方法还可以具体分析每个个体的拷贝数(CN)，即计算2*2^-ΔΔCt的值后将所得结果取整处理，便可分别得到不同个体的拷贝数，再根据拷贝数的不同划分入三种不同类型：多拷贝型(CN＝3、CN＝4、CN＝5)、正常型(CN＝2)和缺失型(CN＝0、CN＝1)。

6.GPR157基因CNV位点与生长性状的关联分析

生长性状：体高、体长、胸围、管围、体重、体斜长。

CNV类型：Deletion、Normal和Duplication。

关联分析模型：利用SPSS(23.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响生长性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、品种、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。最终的模型如下：

Z_ijk＝μ+M_i+N_j+CNV_k+e_ijk

其中，Z_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；M_i为(第i个年龄效应)；N_j为(第j个品种效应)；CNV_k为(第k个GPR157基因拷贝数变异类型效应)；e_ijk为随机误差。

关联分析结果如表4、表5、表6、表7及表8所示。

表4.贵州黑山羊GPR157基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：CN表示拷贝数(Copy Number)；平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)，^**P<0.01。

从表4可以看出，贵州黑山羊GPR157基因CNV位点(Chr16:42828376-42910835)对于贵州黑山羊的生长发育具有极显著影响。在贵州黑山羊群体中，Deletion类型(CN＝1、0)的个体在体高、体长性状方面的表现显著优于其他类型的个体。

表5.贵州白山羊GPR157基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：CN表示拷贝数(Copy Number)。

从表5可以看出，贵州白山羊GPR157基因CNV位点(Chr16:42828376-42910835)对于贵州白山羊的生长发育有一定影响，但效果不明显。在贵州白山羊群体中，Deletion类型(CN＝0)的个体在体重、胸围性状方面的表现均优于其他类型的个体。

表6.太行黑山羊GPR157基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：CN表示拷贝数(Copy Number)。

从表6可以看出，太行黑山羊GPR157基因CNV位点(Chr16:42828376-42910835)对于太行黑山羊的生长发育有一定影响，但效果不明显。在太行黑山羊群体中，Deletion类型(CN＝0)的个体在体高、体长、体重和胸围性状方面的表现均优于其他类型的个体，Duplication类型(CN＝4)的个体在管围性状方面的表现优于其他类型的个体。

表7.波槐杂交山羊GPR157基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：CN表示拷贝数(Copy Number)。

从表7可以看出，波槐杂交山羊GPR157基因CNV位点(Chr16:42828376-42910835)对于波槐杂交山羊的生长发育有一定影响，但效果不明显。在波槐杂交山羊群体中，Duplication类型(CN＝3)的个体在体高、体长、胸围、体重性状方面的表现均优于其他类型的个体，Deletion类型(CN＝1)的个体在管围性状方面的表现优于其他类型的个体。

表8.河南槐山羊GPR157基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：CN表示拷贝数(Copy Number)。

从表8可以看出，河南槐山羊GPR157基因CNV位点(Chr16:42828376-42910835)对于河南槐山羊的生长发育有一定影响，但效果不明显。在河南槐山羊群体中，Normal类型(CN＝2)的个体在体高和体斜长性状方面的表现均优于其他类型的个体；Duplication(CN＝3)的个体在胸围和体重性状方面的表现均优于其他类型的个体；Deletion类型(CN＝0)的个体在管围性状方面的表现优于其他类型的个体。

总之，关联分析结果表明上述GPR157基因的拷贝数变异位点与山羊体高、体长等重要生长性状具有极显著的关联性。因此，GPR157基因的拷贝数变异位点(Chr16:42828376-42910835)可以作为一个有效提高山羊生长性状的候选分子遗传标记(CNV标记)位点，从而加快山羊选育进程。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种基于山羊GPR157基因CNV标记评估生长性状的分子诊断方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> F1

<400> 1

gcagaggtgc agttccgat 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> R1

<400> 2

agccttgaaa acgtaggcaa aac 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> F2

<400> 3

gggcagtccc ttgacaaaga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> R2

<400> 4

atctccccag cctcctcatt 20

Claims

1.一种检测山羊GPR157基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以山羊基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增GPR157基因的拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果确定GPR157基因的拷贝数变异类型；

所述引物对P1为：

上游引物F1：5′-GCAGAGGTGCAGTTCCGAT-3′

下游引物R1：5′-AGCCTTGAAAACGTAGGCAAAAC-3′

所述引物对P2为：

上游引物F2：5′-GGGCAGTCCCTTGACAAAGA-3′

下游引物R2：5′-ATCTCCCCAGCCTCCTCATT-3′；

所述GPR157基因的拷贝数变异区域位于GPR157基因参考基因组序列NC_030823.1的42828376到42910835位；

所述拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2^-ΔΔCt>2，并按拷贝数细分为2*2^-ΔΔCt＝3、4或2*2^-ΔΔCt≥5的拷贝数不同的多拷贝型；缺失型，2*2^-ΔΔCt<2，并按拷贝数细分为2*2^-ΔΔCt＝0或1的拷贝数不同的缺失型；正常型，2*2^-ΔΔCt＝2；

所述山羊为贵州黑山羊。

2.根据权利要求1所述一种检测山羊GPR157基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的扩增反应体系包括10～50ng/μL模板DNA 1μL以及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

3.根据权利要求1所述一种检测山羊GPR157基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应程序包括以下步骤：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

4.根据权利要求1所述一种检测山羊GPR157基因拷贝数变异的方法，其特征在于：基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为138bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为129bp。

5.如权利要求1-4中任意一项权利要求所述的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：在贵州黑山羊群体中，具有缺失型拷贝数变异类型、且拷贝数为1或0的个体在生长性状体高、体长上较优。

6.一种检测山羊GPR157基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于分别通过实时荧光定量PCR扩增山羊GPR157基因拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段的引物对P1及引物对P2，根据定量结果确定GPR157基因的拷贝数变异类型；

所述引物对P1为：

上游引物F1：5′-GCAGAGGTGCAGTTCCGAT-3′

下游引物R1：5′-AGCCTTGAAAACGTAGGCAAAAC-3′

所述引物对P2为：

上游引物F2：5′-GGGCAGTCCCTTGACAAAGA-3′

下游引物R2：5′-ATCTCCCCAGCCTCCTCATT-3′；

所述GPR157基因拷贝数变异区域位于GPR157基因参考基因组序列NC_030823.1的42828376到42910835位；

所述山羊为贵州黑山羊。