CN111733218B - 一种山羊ccser1基因cnv标记的检测生长性状的方法及其诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山羊CCSER1基因CNV标记的检测生长性状的方法及其诊断试剂盒：基于实时荧光定量PCR技术，以山羊基因组DNA为模板，利用一对特异性引物扩增CCSER1基因的拷贝数变异区域部分片段，利用另外一对特异性引物扩增作为内参的MC1R基因部分片段，根据定量结果并利用2^‑ΔΔCt鉴定个体的拷贝数变异类型。根据对山羊CCSER1基因拷贝数变异与生长性状之间进行的关联分析，本发明提供的方法可以为选育山羊优势种群提供参考的分子标志物，有利于加快山羊分子标记辅助选择育种工作，该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种山羊CCSER1基因CNV标记的检测生长性状的方法及其诊 断试剂盒

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及一种利用山羊基因组DNA进行实时荧光定量PCR，并以MC1R基因为内参，根据2^-ΔΔCt判定个体的拷贝数变异类型的方法。

背景技术

分子育种主要的研究方向集中在标记辅助选择(molecular mark-assistselection,MAS)上，MAS是通过DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，从而对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对与生长性状密切相关的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)指大小从50bp到数Mb的DNA片段拷贝数突变。CNVs是由基因重排导致的，它是基因组变异的重要组成部分，可导致由基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等引起的表型多态性。研究表明，基因组变异是研究表型性状差异最重要的基础资料，各种高通量检测技术为全面、准确的获取基因组遗传变异提供了强有力的手段。在家畜上，多个物种的全基因组拷贝数变异遗传图谱已经构建，并且通过生物信息学分析，预测出了很多与家畜肌肉生长、脂肪代谢、繁殖力和抗病性等数量性状相关的位点。因此，检测山羊基因的CNVs标记有助于加速山羊遗传选育的进展。

在检测已知CNV的各种方法中，实时荧光定量PCR(quantitive Real-Time PCR,qPCR)是使用比较广泛的一种技术。qPCR操作简单、敏感性高、速度快，通过对目的基因(有拷贝数变异)和内参基因(无拷贝数变异)进行相对定量，可以利用2^-ΔΔCt判定个体的拷贝数变异类型。

CCSER1(Coiled-Coil Serine Rich protein 1)，别名FAM190A，作为一种调节蛋白基因。国内外对CCSER1基因的研究较少，对CCSER1的功能及作用机制的认识都还处在初步阶段。作为正常有丝分裂的调节或结构成分，当CCSER1基因表达量发生变化时，会引起染色体的不稳定。目前为止，尚未见到山羊CCSER1基因拷贝数变异与山羊生长性状相关联的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊CCSER1基因CNV标记的检测生长性状的方法及其诊断试剂盒，可以加速山羊良种选育。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测山羊CCSER1基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以山羊个体基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增CCSER1基因的拷贝数变异区域的部分片段及作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定山羊个体CCSER1基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-TGACTTCCATATGGGCCAACT-3’

下游引物R1：5’-TCCTCAGTTGAAATAAACAAGCCCT-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-GGGCAGTCCCTTGACAAAGA-3’

下游引物R2：5’-ATCTCCCCAGCCTCCTCATT-3’。

优选的，所述的拷贝数变异区域位于山羊CCSER1基因候选区域Chr6:34300401-34303200(参考序列为NC_030813.1)。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据Log₂ 2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：增加型(Gain)，Log₂ 2^-ΔΔCt>0.5；缺失型(Loss)，Log₂ 2^-ΔΔCt<-0.5；正常型(Normal)，Log₂2^-ΔΔC t≤|±0.5|。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系包括：10～50ng/μL模板DNA 1μL，以及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为115bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为129bp。

上述检测山羊CCSER1基因拷贝数变异的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状(例如，贵州白山羊的胸围；贵州黑山羊的体重；河南杂交山羊的胸围及管围；河南纯种波尔山羊的体高、体斜长、胸围及管围)上优于具有增加型、缺失型拷贝数变异类型的个体。

一种检测山羊CCSER1基因拷贝数变异的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1和引物对P2。

本发明的有益效果体现在：

本发明以MC1R基因作为内参，采用实时荧光定量PCR对山羊CCSER1基因的CNV位点(候选区域Chr6:34300401-34303200)的拷贝数变异进行了检测，发现位于该CCSER1基因的拷贝数变异位点的分子标记，为山羊生长性状的分子标记辅助选择提供潜在分子标志物，可用于快速建立山羊遗传资源优势种群，从而加快品种改良过程。

与现有方法相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供的山羊CCSER1基因拷贝数变异检测方法，不受年龄和性别的限制，甚至在刚出生时就可以进行检测，可用于山羊早期选育。

2.与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，本发明快速、简单、成本低，能够准确的诊断山羊个体的拷贝数类型。

附图说明

图1为本发明实施例中进行qPCR(CCSER1基因)绘制的扩增曲线。

图2是本发明实施例中进行qPCR(CCSER1基因)绘制的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

本发明利用实时荧光定量PCR对山羊CCSER1基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：(1)利用NCBI数据库的山羊CCSER1基因序列，利用Primer-BLAST网站进行引物设计，并用普通PCR检验引物；(2)采用实时荧光定量PCR技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；(3)利用SPSS 24.0软件将拷贝数变异类型与山羊生长性状进行关联分析，筛选到与山羊生长性状相关的CNV标记；(4)根据个体拷贝数变异类型，建立生长性状优异的山羊种群，进行选育。具体实验步骤和结果如下。

1.山羊样本采集

本发明以贵州白山羊、贵州黑山羊、贵州努比亚山羊、河南杂交山羊及河南纯种波尔山羊为检测对象，采集和使用了414头山羊个体的血液样本(见表1)。并记录它们的生长性状数据，如体高、体重、体长、胸围、体斜长及管围等，以用于后续的关联分析。

表1.样品信息

2.血样基因组DNA的提取

(1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液；重复本步骤至上清液透明。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

(3)加蛋白酶K至5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀后继续消化直至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管；重复本步骤1次。

(5)加入氯仿500μL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

(6)加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500μL，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(7)加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

(8)4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(9)4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(10)干燥后的DNA中加入80～100μL的TE，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存。

3.目的基因及内参基因特异性引物设计

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的山羊CCSER1基因(NC_030813.1)为参考序列，查找重测序中筛选出来的拷贝数变异区域(Chr6:34300401-34303200)，利用Primer-BLAST网站设计在拷贝数变异区域内靠近中间位置一段115bp的序列的扩增引物(引物对P1)，同时，以NCBI所公布的山羊MC1R基因序列(NC_030825.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增内参基因(MC1R基因)中一段129bp的序列的扩增引物(引物对P2)。引物对序列信息如表2所示。

表2.实时荧光定量PCR的引物信息

4.实时荧光定量PCR

qPCR反应体系如表3所示。

表3.qPCR的反应体系

qPCR反应程序为：

(1)95℃预变性10min，然后按照(2)进行扩增反应；

(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环；

(3)绘制溶解曲线：95℃10s，从65℃到95℃，+0.5℃5s。

通过绘制扩增曲线(图1)和熔解峰确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图2)。

5.个体CNV类型判定

实验结果根据2^-△△Ct方法进行计算，具体的计算方法为：

ΔΔCt＝ΔCt_(实验组)-ΔCt_(参照组)，ΔCt_(实验组)＝Ct_{(实验组目的基因)}-Ct_{(实验组内参基因)}，ΔCt_(参照组)＝Ct_{(参照组目的基因)}-Ct_{(参照组内参基因)}

公式中，实验组即为待检测有无拷贝数变异的个体样本。参照组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序试验中所选择的参照组各品种山羊个体，每对引物3个重复，根据2^-△△Ct进行拷贝数的分析。

2^-△△Ct表示的是实验组目的基因的拷贝数相对于参照组的倍数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2^-△△Ct的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。Ct即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

当目的基因为正常型(Normal)序列时，根据2^-ΔΔCt计算出归一化值，0左右(Log₂2^-ΔΔCt≤|±0.5|)。当目的基因为缺失型(Loss)序列时，Log₂ 2^-ΔΔCt计算出归一化值Log₂2^-ΔΔCt<-0.5。当目的基因为增加型(Gain)序列时，Log₂ 2^-ΔΔCt计算出归一化值Log₂2^-ΔΔCt>0.5。

6.CCSER1基因拷贝数变异与生长性状的关联分析

生长性状：体高、体长、胸围、管围、体重、体斜长

关联分析模型：利用SPSS(24.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响体尺性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、品种、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+A+B+G_j+E_ijk

其中，Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的拷贝数类型；E_ijk为随机误差。

统计检测群体中各种类型(Gain、Normal和Loss)的个体数，利用SPSS24.0进行关联分析。结果如表4、表5、表6、表7及表8所示。

表4.贵州白山羊CCSER1基因拷贝数变异与生长性状之间的关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。^*P<0.05；^**P<0.01。括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

表5.贵州黑山羊CCSER1基因拷贝数变异与生长性状之间的关联分析

注：括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

表6.贵州努比亚山羊CCSER1基因拷贝数变异与生长性状之间的关联分析

注：括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

表7.河南杂交山羊CCSER1基因拷贝数变异与生长性状之间的关联分析

注：括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

表8.河南纯种波尔山羊CCSER1基因拷贝数变异与生长性状之间的关联分析

注：括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

关联分析结果表明(见表4-表8)，山羊CCSER1基因的拷贝数变异位点(Chr6:34300401-34303200)与山羊体重、胸围这两个生长性状有显著的关联性，例如，在贵州白山羊中具有正常型拷贝数变异类型的个体在胸围上显著优于增加型、缺失型的个体。

另外，在贵州黑山羊中具有正常型拷贝数变异类型的个体在胸围上较优，在河南杂交山羊中具有正常型拷贝数变异的个体在胸围和管围上较优。而在河南纯种波尔山羊中具有正常型拷贝数变异的个体在体高、体斜长、胸围及管围上较优。

由于具有正常型拷贝数变异类型的山羊个体展现了更高的生长性状优势。因此，山羊CCSER1基因的拷贝数变异位点(Chr6:34300401-34303200)的正常型可以作为一个有效提高山羊生长性状的候选分子遗传标记(CNV标记)。

<110>河南省畜牧总站

<120> 一种山羊CCSER1基因CNV标记的检测生长性状的方法及其诊断试剂盒

<160>4

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

tgacttccat atgggccaac t 21

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

tcctcagttg aaataaacaa gccct 25

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gggcagtccc ttgacaaaga 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

atctccccag cctcctcatt 20

Claims (7)

1.一种检测山羊CCSER1基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以山羊基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增CCSER1基因的拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定山羊CCSER1基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-TGACTTCCATATGGGCCAACT-3’

下游引物R1：5’-TCCTCAGTTGAAATAAACAAGCCCT-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-GGGCAGTCCCTTGACAAAGA-3’

下游引物R2：5’-ATCTCCCCAGCCTCCTCATT-3’；

所述的拷贝数变异区域位于山羊CCSER1基因候选区域Chr6:34300401-34303200，参考序列为NC_030813.1；

所述的拷贝数变异类型是根据Log₂ 2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：增加型，Log₂ 2^-ΔΔCt>0.5；缺失型，Log₂ 2^-ΔΔCt<-0.5；正常型，Log₂ 2^-ΔΔCt≤|±0.5|。

2.根据权利要求1所述一种检测山羊CCSER1基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的扩增体系包括：10～50ng/μL模板DNA 1μL，以及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

3.根据权利要求1所述一种检测山羊CCSER1基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

4.根据权利要求1所述一种检测山羊CCSER1基因拷贝数变异的方法，其特征在于：基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为115bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为129bp。

5.如权利要求1-4中任意一项权利要求所述的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述CCSER1基因的拷贝数变异区域与贵州白山羊体重、胸围有显著的关联性。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：具有正常型拷贝数变异类型的山羊个体在生长性状上较优。

7.一种检测山羊CCSER1基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增CCSER1基因的拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段的实时荧光定量PCR引物，所述引物具体包括引物对P1及引物对P2：

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-TGACTTCCATATGGGCCAACT-3’

下游引物R1：5’-TCCTCAGTTGAAATAAACAAGCCCT-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-GGGCAGTCCCTTGACAAAGA-3’

下游引物R2：5’-ATCTCCCCAGCCTCCTCATT-3’。